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第 35 卷 第 3 期2023 年 9 月塔里木大学学报Journal of Tarim UniversityVol.35 No.3Sep.2023文章编号:1009-0568(2023)03-0012-06收稿日期:2022-11-14基金项目:国家自然科学基金项目“创伤微环境 HGFc-Met 信号对鹿茸间充质干细胞增殖、迁移与分化的调控机制”(31860629)第一作者:张荠允(1998-),女,2020 级在读硕士研究生,研究方向为动物遗传育种与繁殖。E-mail:通信作者:韩春梅(1968-),女,博士,教授,研究方向为动物遗传育种与繁殖。E-mail:小鼠骨髓和鹿茸来源间充质干细胞基本生物学特征比较张荠允1,方翟2,贾小东1,刘嘉伟1,侯正创1,韩春梅1,3(1 塔里木大学动物科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300)(2 塔里木大学生命科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300)(3 塔里木畜牧科技兵团重点实验室,新疆 阿拉尔 843300)摘要 为研究塔里木马鹿茸间充质干细胞(MSCs)的生物学特征,本试验对来源于小鼠骨髓和塔里木马鹿茸的 2 种 MSCs 进行了体外培养,检测比较了其生长曲线;同时利用光学显微镜和透射电镜对细胞形态特征、结构、细胞器组成和数量进行观察对比。研究发现鹿茸 MSCs 体外培养呈“S”形生长趋势,增殖速度极显著高于小鼠 BMSCs(P0.01)。鹿茸 MSCs 形态呈梭形,排列规律,形态均一;小鼠 BMSCs 形态不规则,呈三角形,多边形;鹿茸 MSCs 胞体、胞核面积分别为 963.053 m2和134.093 m2,极显著高于小鼠 BMSCs 的 551.026 m2和 79.938 m2(P0.01);鹿茸 MSCs 的核质比为 0.167,显著低于小鼠BMSCs 的 0.206(P0.05);超微结果显示鹿茸 MSCs 胞体面积较大,细胞器种类简单,线粒体、内质网等细胞器形态具备早期幼稚细胞发育特征。塔里木马鹿茸 MSCs 增殖能力高于小鼠 BMSCs,在开发利用方面具备更广泛的优势。关键词 塔里木马鹿茸;间充质干细胞(MSCs);生物学特性;超微结构中图分类号:Q952文献标识码:ADOI:10.3969j.issn.1009-0568.2023.03.002Comparison of biological characteristics of mouse bone marrow with deer antler mesenchymal stem cellsZHANG Jiyun1,FANG Di2,JIA Xiaodong1,LIU Jiawei1,HOU Zhengchuang1,HAN Chunmei1,3(1 College of Animal Science and Technology,Tarim University,Alar,Xinjiang 843300)(2 College of Life Science and Technology,Tarim University,Alar,Xinjiang 843300)(3 Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology,Xinjiang Production&Construction Corps.Alar,Xinjiang 843300)Abstract The objective was to study the biological characteristics of Tarim Red Deer antler mesenchymal stem cells(MSCs).Two types of MSCs from mouse bone marrow and Tarim Red Deer antler were cultured in vitro and their growth curves were examined and compared.The morphological features,structure,organelle composition and number of cells were also observed and compared using light 第 3 期张荠允 等:小鼠骨髓和鹿茸来源间充质干细胞基本生物学特征比较13 microscopy and transmission electron microscopy.The results showed that the growth trend of deer antler MSCs was“S”shaped,and the proliferation rate was significantly higher than that of mouse BMSCs(P0.01).The morphology of deer antler MSCs were shuttle-shaped,regularly arranged and homogeneous,while that of mouse BMSCs was irregular,triangularand polygonal.The cytosolic and nucleolar areas of deer antler MSCs were 963.053 m2 and 134.093 m2,respectively,which were significantly higher than those of mouse BMSCs at 551.026 m2 and 79.938 m2(P0.01).The nucleoplasmic ratio of deer antler MSCs was 0.167,which was significantly lower than that of mouse BMSCs at 0.206(P0.05).The ultramicroscopic results showed that deer antler MSCs had a large cytosolic area,simple organelle types,and organelle morphology such as mitochondria and endoplasmic reticulum with early naive cell development characteristics.The proliferative capacity of Tarim Red Deer antler MSCs was higher than that of mice,and it has wider advantages in exploitation.Keywords Tarim Red Deer antler;mesenchymal stem cells(MSCs);biological characteristics;ultrastructure 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类能够进行自我更新及多向分化且具有低免疫原性的细胞,被广泛应用于细胞治疗、免疫调节、组织工程等多个领域1,是再生医学中充足的干细胞来源,也是组织工程学中重要的后备材料。目前,骨髓、脐带、脂肪等组织来源的 MSCs 在临床治疗上的使用已经获得了初步的疗效2-4。鹿茸的生长与再生基于干细胞的增殖分化5,与传统的 MSCs 相比,鹿茸间充质干细胞是一类具有胚胎干细胞部分特性的成体干细胞,具有软骨、骨、脂肪等多向分化潜能,而且鹿茸 MSCs 来源广泛、丰富,且不伤害动物机体,是一类具有广阔应用前景的干细胞。现已有运用鹿茸 MSCs 治疗小鼠放射性皮肤损伤修复的研究报道6-7;鹿茸 MSCs 在减轻肝纤维化中也具备一定疗效,能作为治疗肝纤维化等疾病的新型细胞来源8。细胞超显微结构的研究有助于了解细胞的状态和功能,也为细胞形态学提供重要理论基础9。LI C 等10在 1998 年对鹿茸角柄发生和初鹿角形成等 5 个发育阶段的鹿茸干细胞超微结构做了研究,初步发现了鹿茸干细胞 ASCs(antlerogenic periosteal cells)与胚胎干细胞相似的特征,细胞内均富含糖原,内质网不发达,但由于取样等因素未进行进一步深入全面的研究。鹿茸组织中存在的生茸骨膜干细胞 APCs(antlerogenic periosteal cells)、角柄骨膜干细胞 PPCs(pedicle periosteum cells)、增生的间充质干细胞都被定义为干细胞,但鹿茸间质层的 MSCs 是鹿茸顶端增生组织间质层的细胞,容易获取而且不会对鹿造成任何损伤,是具有广阔前景的一类新型干细胞。研究鹿茸 MSCs 的细胞生物学特性对其开发利用有重要的意义。本研究以小鼠骨髓间充质干细胞为对照,研究利于体外培养鹿茸 MSCs 的生长规律;采用生物透射电子显微镜对鹿茸 MSCs 超微结构进行研究,获得鹿茸 MSCs 基本生物学特征,为鹿茸 MSCs 应用提供理论支持。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 鹿茸 MSCs 和小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对马鹿麻醉处理,锯取鹿茸,用去污粉清洗茸表面污物,酒精棉擦拭后于超净工作台切取鹿角顶部约 5 cm 鹿茸组织,纵向剖开,分离间充质组织;配制含 PS 量为 800 IU、400 IU、200 IU 的 3 种浓度的D-Hanks 液,将分离所得组织放入不同浓度 D-Hanks液冲洗 3 遍;冲洗后剪成 0.5 mm0.5 mm 的组织块,移入离心管中,加入 0.25%胰蛋白酶,37 消化1 h,弃去胰酶;加入 0.1%型胶原酶,培养箱中消化 5 h;上清液移至离心管,1 000 rmin 离心 5 min,弃上清,加入 1 mL 培养液进行细胞计数,按照 105 个mL 浓度接种,隔 2 d 换液,细胞生长至 80%90%进行传代,传至第 3 代性状稳定后取生长对数期细胞使用。颈椎脱臼法处理 3 周龄昆明小鼠,于 75%酒精中浸泡 3 次,5 min次;无菌条件下剥离双侧股骨,PBS 清洗股骨;完全培养基冲洗骨髓腔,冲洗液收集于离心管中,1 000 rmin 离心 5 min 后弃上清;用完14 塔里木大学学报第 35 卷全培养基重悬细胞沉淀,血细胞计数板进行细胞计数,调整细胞密度为 105 个mL,接种于培养瓶进行细胞培养;细胞生长至 80%90%传代,用全骨髓贴壁法进行细胞传代培养,传至第 3 代性状稳定后取生长对数期细胞使用。1.1.2 试剂与仪器 光学显微镜(NiKon)、生物透射电子显微镜(HITACHI H-7650)、台式高速冷冻离心机(Sigma 3K30)、涡旋振荡器(Scientific Industries SI Vortex-Genie 22 T)、-80 超低温冰箱(美国赛默飞世尔科技公司)、酶联免疫检测仪、掌上型离心机(赛伯乐仪器有限公司)、超薄切片机(Leica)、完全培养基(DMEM+10%FBS+PS)、胎牛血清(FBS,Gibco)、双抗(penicillin-sreptomycin,PS)、磷 酸 盐 缓 冲 溶 液(PBS)、CCK8 溶液(Solarbio)、胰酶、2.5%戊二醛固定液、6 种浓度乙醇溶液(30%,50%,70%,80%,90%和 95%)、无水乙醇、丙酮、包埋剂、柠檬酸铅溶液、醋酸双氧铀。1.2 方法 1.2.1 光学显微镜下观察 MSCs 取对数期鹿茸 MSCs(P3)、小鼠 BMSCs(P3)接种于 6 孔板制作细胞爬片,观察细胞贴壁后,PBS 清洗;4%多聚甲醛固定 10 min,PBS 清洗 3 5 次;0.1%TritonX-100 溶液透化细胞 15 min;苏木素染色 40 min,蒸馏水冲洗;伊红染色 11 min,蒸馏水冲洗后进行观察拍照。根据 HE 染色结果,每个爬片取 5 个视野,利用 IMAGE J 软件统计每个视野(200)下的细胞数,测量每个爬片每个视野各 5个细胞胞体面积、胞核面积、核大小,计算出核质比进行分析。1.2.2 MSCs 增殖能力检测 将 P3 的鹿茸 MSCs 和小鼠 BMSCs 细胞密度调整为 1.0104 个mL,吸取 100 L 细胞悬液加入 96孔板(设置空白对照组),设置 6 个细胞重复孔,边缘一圈溶液易挥发不接种细胞;常规细胞培养,隔天换液;第 2 d 开始,每天固定时间取出 96 孔板加入CCK8 溶液 10 L,放入培养箱中孵育 1 h;完成后于波长 450 nm 处测定吸光度,记录数据取平均值,计算实验组与对照组平均值差值,记录 7 d,以时间为横坐标,吸光度为纵坐标绘制细胞生长曲线。1.2.3 MSCs 的透射电镜观察 解剖刀刮下细胞,1 000 rmin 离心 5 min,弃上清,缓慢加入 4 预冷戊二醛固定液,置 4 冰箱保存备用。后续进行常规透射电镜样品制备,晾干后于透射电镜中观察。1.2.4 数据统计分析 数据均采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析,方法均为单因素方差分析,结果用平均值 标准误表示。2 结果与分析2.1 鹿茸 MSCs 与小鼠 BMSCs 形态特征比较 光镜 40 倍视野下观察到 2 种 MSCs 呈旋涡状排列,生长趋势一致,贴壁生长,呈纤维样集落,细胞大小较为均匀(如图 1a、图 1c)。200 倍视野下细胞形态更加清晰,鹿茸 MSCs 细胞形态多数呈长梭形,细胞核明显,胞浆丰富,细胞间粘附紧密,大多数细胞呈现片状伪足的迁移状态(图 1b);而小鼠 BMSCs 有较多突起,细胞形态不规则,呈多边形、三角形,细胞略小且大小不一,细胞生长间隙较大,粘附不紧密(图 1d),可见少数细胞有 12 个细胞核,胞浆染色不均一,同质性差,存在多个干细胞谱系。a、b:塔里木马鹿茸间充质干细胞;c、d:小鼠骨髓间充质干细胞。图 1 间充质干细胞 HE 染色光镜下形态第 3 期张荠允 等:小鼠骨髓和鹿茸来源间充质干细胞基本生物学特征比较15 由表 1 可知,2 种间充质干细胞的基本形态特征间存在较大差异。细胞计数结果显示,200 倍视野下鹿茸 MSCs 平均个数为 108.2031.461,极显著小于小鼠 BMSCs 的个数 135.8211.772(P 0.01);鹿茸MSCs 胞体面积、胞核面积分别为 963.053 m2和134.093 m2,均极显著高于小鼠BMSCs 的551.026 m2和79.938 m2(P0.01);鹿茸 MSCs 的核质比为0.167,显著低于小鼠 BMSCs 的核质比0.206(P0.05)。表 1 塔里木马鹿茸 MSCs 与小鼠 BMSCs 基本形态特征比较(XSE)物种细胞个数胞体面积m2胞核面积m2核质比鹿茸108.2031.461 963.05363.493 134.0935.403 0.1670.002小鼠135.8211.772551.02640.24379.9385.8740.2060.015 注:同列比较,“”表示差异显著(P0.05),“”表示差异极显著(P0.01)。2.2 MSCs 增殖能力检测 在细胞数量和孵育时间相同的情况下,鹿茸MSCs 生长曲线呈正“S”形,小鼠 BMSCs 则近似倒“S”形。传代后鹿茸 MSCs 细胞增殖加快,延滞期短,第 2 d 细胞便开始加速增殖进入生长对数期,在第 4 d 达到生长巅峰值以后便进入平台期;小鼠BMSCs 与鹿茸 MSCs 生长趋势相反,在第 12 d 细胞数量略微增长,经过 2 d 的潜伏期,在第 4 d 开始进入生长对数期。由增殖能力检测结果可知每天测定的鹿茸 MSCs 的 OD 值均高于小鼠 BMSCs 的 OD值,在接种后第 1 d 便开始出现显著差异(P0.05),此后细胞生长趋势逐渐出现极显著差异(P0.01)(如图 2 所示)。可见鹿茸 MSCs 的增殖能力明显高于小鼠 BMSCs。图 2 间充质干细胞生长曲线2.3 MSCs 的超微结构 如图3 所示,通过在透射电镜下观察可知,与小鼠BMSCs 相比,鹿茸 MSCs 细胞间连接紧密,表面存在发达的细长突起,微绒毛向间质突起;核膜向内凹陷,细胞核位于细胞中央,2 个核仁明显且大,不规则的核形增大了核与胞质间接触面积,加速了核与胞质的代谢与物质交换;细胞器少、种类简单;少量内质网分布于细胞质中,可见糖原颗粒、高尔基体,胞浆丰富;图 3b 可见溶酶体结构明显,形态规律,能够加速细胞代谢、降解细胞代谢产物、促进细胞器更新,表明细胞功能活跃;线粒体小、数量多且呈短棒状,符合幼稚细胞特征;细胞体积较大,透射电镜下在 2 m 视野下几乎无法观察到完整细胞(图 3a)。而小鼠 BMSCs 细胞状态不均一,有些较为幼稚,核质比大,细胞器少;有些处于分裂期,细胞呈圆形或椭圆形,膜外微绒毛结构不明显,观察到双核(N1、N2),核仁大小不均,胞质中有空泡形成(图 3c);内质网、线粒体结构明显;但细胞核染色质固缩(图 3d)。从超微结果分析可知鹿茸 MSCs 特征更接近未分化的原始幼稚细胞,而小鼠 BMSCs 可能在历代消化过程中对胰酶作用自身抵抗不足出现损伤、细胞老化现象。3 讨论 试验利用光学显微镜及透射电子显微镜技术对塔里木马鹿茸 MSCs 进行显微成像观察,并与小鼠BMSCs 细胞结构比较,获得鹿茸 MSCs 基本生物学特性,为鹿茸干细胞开发利用提供重要理论补充。通过细胞体外培养,发现鹿茸 MSCs 在第 1 次传代后细胞基本性状已稳定,后续培养基本形态均不发生变化,而小鼠 BMSCs 在第 3 次传代后细胞形态特征一致,不发生变化,性状基本稳定11-13。普通光镜下鹿茸 MSCs 形态呈长梭形,极少量细胞表现为不16 塔里木大学学报第 35 卷规则形,胞浆染色均匀,细胞核明显,与张霄蓓等14研究结果一致;而小鼠 BMSCs 胞浆染色不均,同质性差。超微结构中发现的小鼠 BMSCs 细胞大小不均一、状态不一,这一情况与在人骨髓、兔骨髓中观察到的结果相似15-16,且 2 种间充质干细胞核质比也有显著差异,基本推测小鼠 BMSCs 以不对称分裂方式进行增殖,导致细胞群出现高度异质性的表现17;体外培养过程中鹿茸 MSCs 分裂速度高于小鼠 BMSCs,表 明 鹿 茸 MSCs 增 殖 能 力 高 于 小 鼠BMSCs。a、b:鹿茸 MSCs;c、d:小鼠 BMSCs;N:细胞核;M:线粒体;PL:初级溶酶体;SL:次级溶酶体;ER:内质网;Golgi:高尔基体;Chromatin:常染色质;Heterochromatin:异染色质;Mv:细胞表面微绒毛。图 3 透射电镜下间充质干细胞超微结构 细胞的超微结构与细胞的状态和功能具有密不可分的关系;透射电镜下鹿茸 MSCs 核膜内陷、折叠、核仁明显。溶酶体被叫作细胞的“消化车间”,溶酶体数量的多少决定了细胞新陈代谢速度的快慢,2 种细胞中均存在溶酶体,鹿茸 MSCs 中溶酶体数量更多,类别更广,鹿茸 MSCs 中分布着很多溶酶体与沙文琼等18对人胎盘超微结构研究结果相似,推测鹿茸 MSCs 是具有细胞内消化功能的细胞,细胞的吞噬功能更强。MEACHAM C E 等19发现静态的造血干细胞和神经干细胞比分裂的干细胞有更多和更大的溶酶体,且静态的造血干细胞中较大的溶酶体比较小的溶酶体在分裂的干细胞中活性更低。根据溶酶体的功能分析,推测细胞内溶酶体 差 异 是 鹿 茸MSCs 全能性优于小鼠 BMSCs 的一大可能。与小第 3 期张荠允 等:小鼠骨髓和鹿茸来源间充质干细胞基本生物学特征比较17 鼠 BMSCs 相比,鹿茸 MSCs 中粗面内质网数量较少,说明细胞分化程度很低;细胞表层微绒毛,能帮助细胞摄取更多营养以供较强生长繁殖所需20;与小鼠 BMSCs 相比,鹿茸 MSCs 表层微绒毛数量更多,细胞功能更为活跃,且分泌能力更强;鹿茸MSCs 分泌出丰富的基质存在于细胞间,利于 MSCs的贴附生长和信号传递,这也解释了鹿茸 MSCs 的增殖迁移分化能力强的原因。细胞的生长发育受多种环境调控,因此想要鹿茸 MSCs 功能发挥到最佳效果,还需要进行更加有针对性地研究。4 结论 通过透射电镜成功观察到塔里木马鹿茸 MSCs形态超微结构,获得塔里木马鹿茸 MSCs 的细胞学特征,与小鼠 BMSCs 对比得出,塔里木马鹿茸 MSCs 具有更强的增殖能力,在临床治疗中具备更广泛的应用优势。参考文献1 沈甜甜,方翼.间充质干细胞的研究进展J.中国临床药理学杂志,2019,35(22):2939-2942.2 叶青,曾静.骨髓间充质干细胞及其在眼科疾病治疗中的应用进展J.广西医学,2020,42(4):477-482.3 刘星妤,胡小芳,徐广立,等.人脐带间充质干细胞修复子宫内膜损伤J.中国组织工程研究,2022,26(24):3921-3927.4 王彤,刘毅.脂肪间充质干细胞在创面愈合中的应用J.中国美容医学,2022,31(2):172-177.5 王淼,芮雪,罗慧丽,等.塔里木马鹿茸 HGF 基因部分外显子克隆及表达特征J.塔里木大学学报,2020,32(3):29-34.6 RONG X,ZHANG G,YANG Y,et al.Transplanted antler stem cells stimulated regenerative healing of radiation-induced cutaneous wounds in rats J.Cell transplant,2020,29(10):738-746.7 ZHANG W,KE C,GUO H,et al.Antler stem cells and their potential in wound healing and bone regeneration J.World journal of stem cells,2021,13(8):1049-1057.8 RONG X,YANG Y,ZHANG G,et al.Antler stem cells as a novel stem cell source for reducing liver fibrosisJ.Cell and tissue research,2020,379(1):195-206.9 李叶,黄华平,张新春,等.浅析透射电子显微镜在生物学科中的应用J.热带农业科学,2019,39(12):58-67.10 LI C,SUTTIE J M.Electron microscopic studies of antlerogenic cells from five developmental stages during pedicle and early antler formation in red deer(Cervus elaphus)J.Anat Rec,1998,252(4):587-599.11 葛志敏,郭中豪,高飞.大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定J.中国临床研究,2015,28(7):836-839.12 徐金霞,李家锋,韩建国,等.大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究J.中国医药科学,2012,2(9):37-39.13 王晓萃,吴金生,付文玉,等.大鼠骨髓间充质干细胞的超微结 构 观 察 J.潍 坊 医 学 院 学 报,2007(6):484-486.14 张霄蓓,王姗姗,孟浩,等.塔里木马鹿茸间充质干细胞体外培养及细胞特性的研究J.经济动物学报,2014,18(2):81-85.15 路艳蒙,傅文玉,朴英杰,等.人骨髓间充质干细胞的超微结构J.电子显微学报,2002(4):373-376.16 乔东访,路艳蒙,傅文玉,等.体外培养兔骨髓间充质干细胞的超微结构观察J.电子显微学报,2002(5):491-492.17 许震宇.骨髓间充质干细胞衰老调控的研究及单个细胞不对称分裂模型的建立D.上海:第二军医大学,2016.18 沙文琼,折瑞莲,王自能,等.人胎盘间充质干细胞的超微结构及其吞噬功能J.中国组织工程研究,2015,19(14):2230-2235.19 MEACHAM C E,DEVILBISS A W,MORRISON S J.Metabolic regulation of somatic stem cells in vivo J.Nature reviews.Molecular cell biology,2022,23(6):428-443.20 朱少芳,何援利,付霞霏.人脐带间充质干细胞的生物学特性和超微结构J.中国医学科学院学报,2011,33(4):382-386.责任编辑:冯丹妮