四环素降低致倦库蚊共生Wolbachia密度方法的建立及效果评价.pdf

第 卷第 期 年 月寄生虫与医学昆虫学报.收稿日期:通信作者:/.四环素降低致倦库蚊共生 密度方法的建立及效果评价吕慧鑫 姜玉庭 郭晓霞 倪 孟 邢 丹赵彤言 张灵玲(.福建农林大学生命科学学院 福州 .军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室 媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重点实验室 北京)摘要 胞内共生菌 在昆虫生理生殖和天然免疫方面发挥着重要作用 蚊虫体内的 密度与其抗病毒作用有很强的相关关系 本研究建立了一种利用四环素处理幼虫降低致倦库蚊共生 密度的方法 并采用实时荧光定量 进行了效果评估 结果显示 使用 /四环素处理致倦库蚊海口株和温州株 处理后 密度中位数分别下降 和 倍 卵巢及其余组织的 密度均下降至 以下 其中 卵巢中 密度下降 倍 可见 /四环素处理幼虫能显著降低蚊虫体内 密度 为后续清除、探究 对致倦库蚊感染和传播病毒的影响提供了技术基础关键词 致倦库蚊 四环素 沃尔巴克氏体 (.)./.吕慧鑫等:四环素降低致倦库蚊共生 密度方法的建立及效果评价 沃尔巴克氏体 是常见的昆虫细胞内共生菌 隶属于变形菌门变形菌纲 亚门立克次体目立克次体科沃尔巴克氏体属 为革兰氏阴性菌 该菌于 年在尖音库蚊 的卵巢内发现(.)广泛分布于无脊椎动物体内 超过 的节肢动物自然感染沃尔巴克氏体(.)目前 已分成 个亚组(.)节肢动物体内感染 最常见的是 和 亚组 丝虫体内则主要为 和 亚组(.)对宿主昆虫具有重要作用 一方面 不但能改变昆虫适应环境的能力还能通过胞质不相容、孤雌生殖、雌性化或者杀雄作用等多种方式调控昆虫生殖 另一方面 可以调控媒介昆虫免疫系统 进而影响其 对 部 分 病 毒 的 传 播 能 力 研 究 发 现 能 够 增 强 黑 腹 果 蝇 抵抗 病毒的能力(.)在蚊虫体内 通过多种方式影响病毒的复制从而降低蚊虫对登革病毒()、基 孔 肯 雅 病 毒()(.)、黄热病毒()(.)、寨卡病毒()(.)和西尼罗病毒()(.)等的传播能力 影响蚊虫媒介效能的机制有多种例如:通过激活宿主 途径介导抗氧化剂的表达应对氧化胁迫 进而产生多种抗菌肽、抑制 增殖(.)同时 通过在宿主体内与病毒等病原体竞争营养物质 也起到了抑制病原体生长的作用(.)此 外 通过上调甲基转移酶等其他宿主因子抑制 病毒复制(.)可见 对于蚊虫传播虫媒病毒的影响机制是复杂的 可能存在多种机制共同作用 进一步阐明 介导的病毒抑制机制有利于深入了解 在病毒传播中所起作用 从而为蚊媒和蚊媒病防控提供科学依据研究表明 昆虫体内的 密度与其抗病毒效应有很强的相关关系 拟果蝇抗病毒株中 密度明显高于敏感株(.)同样 蚊虫与蚊虫细胞中 密度也同蚊虫及其细胞的抗病毒保护作用关系密切(.)本研究利用四环素处理幼虫 建立了一种降低致倦库蚊体内自然感染 密度的方法 确定了最佳的四环素处理浓度 并对处理效果进行了评估 为明确 对病毒媒介效能及蚊虫繁殖生理提供技术基础 材料与方法 蚊虫 致倦库蚊温州株及海口株于 年 月分别采自海南海口及浙江温州 于养虫室连续常规养殖 温度()相对湿度 光照 黑暗 主要仪器和试剂 实时荧光定量 仪()、英莱顿 位核酸提取仪(上海英莱盾生物技术有 限 公 司)、耶 拿仪()、凝胶成像系统()四环素(宝日医生物技术(北京)有限公司)(赛默飞世尔科技(中国)有限公司).、.、.、()、均为宝日医生物技术(北京)有限公司 致倦库蚊携带 的 检测 取新羽化致倦库蚊海口株、温州株各 只单只蚊虫麻醉后置于 管中 随后加入 颗研磨磁珠和 裂解液 于 的条件下研磨 然后根据 提取试剂盒的说明书进行蚊虫基因组的提取 获取的基因组 通过紫外分光光度计检测浓度和纯度 并将其作为 模 板 使 用 ()表 面 蛋 白()基因引物进行 扩 增 基 因 引 物 序 列:上 游 引 物()序列为 下游引物()序列为寄生虫与医学昆虫学报第 卷第 期 产物大小为 体系 :预混液()无核酶水()模板()上下游引物各 反应程序:预变性 变性 退火 延伸 个循环 延长 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定 不 同 浓 度 四 环 素 处 理 致 倦 库 蚊 体 内 以海口株为代表 从卵杯中取出适量的致倦库蚊海口株卵筏 待其卵孵化后(约 )进行分盘养殖 将幼虫分为 盘 每盘数量为 条 其中 盘设置为对照组 另外 盘分别加入不同浓度四环素处理 四环素终浓度分别为、/每 更换一次固定浓度的四环素隔夜水保证其处理浓度并记录幼虫死亡率 至蚊虫龄时计算幼虫死亡率 根据死亡率筛选合适的四环素处理浓度 饲养条件与 相同用上述筛选的最佳四环素处理浓度处理致倦库蚊海口株、温州株幼虫及成虫 两株致倦库蚊每株蚊虫养殖 盘 分别为四环素处理组和对照组 幼虫阶段处理方法同上 成虫饲喂含有相应浓度四环素的 糖水 四环素处理致倦库蚊体内 的效果评估 及 核 糖 体 蛋 白 ()基因标准曲线的绘制:取四环素处理组及对照组羽化第 天的雌蚊进行实验 海口株对照组、海口株处理组、温州株对照组、温州株处理组 组蚊虫每组取 只进行蚊虫总 提取及荧光定量 检测分析 计算四环素处理前后 密度变化情况 取海口株四环素处理组、对照组致倦库蚊各 只在解剖镜下对四环素处理组、对照组的蚊虫进行卵巢组织的解剖 提取蚊虫卵巢及其余残骸 并进行荧光定量 检测分析 计算致倦库蚊海口株卵巢及身体其他部分 密度及其变化情况 具体步骤如下:扩增致倦库蚊总 中 和 基因目的片段 基因引物序列见 基因引物序列见表 反应条件:个循环 将得到的 产物经 琼脂糖凝胶电泳鉴定后 用凝胶回收试剂盒纯化目的片段 将纯化后的目的片段与 载体质粒连接 转化到感受态细胞中复苏培养 涂在准备好的 固体培养基上 过夜培养后挑选白色菌落在 液体培养基中培养 后测序将含目的基因的菌落扩大培养 提取质粒并测浓度 计算出目的基因相对应的拷贝浓度 把已知拷贝浓度的质粒稀释至 /作为后续荧光定量 的标准品 密度检测:通过 软件设计 基因绝对定量 方法所需引物 基因引物来源于文献(.)引物序列见表 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成 对同一份蚊虫总 样本用绝对定量 方法同时检测 与 的拷贝数 以 与 拷贝数的比值作为蚊虫体内 的密度 反应条件:表 基因及 基因的引物序列.引物引物序列 ()产物()结果 致倦库蚊携带 的检测 对温州株和海口株进行 基因的 检测两个地理株各 只 结果显示致倦库蚊 的感染率为 图 展示为部分结果 四环素去除致倦库蚊体内 最佳浓度的探索 使用、和 /四种四环素浓度对致倦库蚊海口株蚊虫一龄幼虫进行处理 每种浓度下蚊虫 只()结果显示 四环素浓度为 /时 幼虫死亡率为 且在 内全部死亡 四环素浓度为 、/时 幼虫死亡率分别为、和 为保证用于后续实验的成蚊数量 选择 /浓度四环素进行吕慧鑫等:四环素降低致倦库蚊共生 密度方法的建立及效果评价图 不同地理株致倦库蚊体内 检测.:海口株:温州株:的清除实验图 基因()及 基因()梯度稀释的标准曲线.()()图 四环素处理前后致倦库蚊体内 密度变化.:海口株:温州株:及 基因标准曲线的绘制 用荧光定量 法检测拷贝数分别为 /的 和 基因重组质粒结果显示 和 基因的最低检测浓度均为 /基因的标准曲线(图)的线性回归方程为 相关系数.基因标准曲线(图)的线性回归方程为 .相关系数.两者标准曲线均具有良好的相关关系 四环素处理致倦库蚊体内 效果检测 使用 /四环素处理致倦库蚊海口株和温州株 根据上述标准曲线 对海口株四环素处理组、海口株对照组、温州株四环素处理组、温州株对照组共 组致倦库蚊进行 检测 定量 检测结果表明 致倦库蚊海口株处理组(图)的 密度在大多在 之间 温州株对照组(图)在 之间致倦库蚊海口株及温州株四环素处理组体内的 密度都降低至 以下 四环素处理寄生虫与医学昆虫学报第 卷第 期(/)后致倦库蚊体内 密度显著低于对照组 海口株和温州株共生菌密度中位数分别下降了 倍和 倍 致倦库蚊卵巢中 密度及清除效果检测 如图 所示 海口株致倦库蚊四环素处理前 卵巢内的 密度大约在 左右而身体其他部分的 密度在 之间 两 者 的 密 度 差 异 显 著 可 见 主要在致倦库蚊的卵巢中定殖 以 /浓度的四环素处理后 卵巢及身体其余部位 密度均下降到 以下卵巢中 密度下降了 倍 表明四环素能显著降低蚊虫卵巢体内 图 海口株致倦库蚊四环素处理前()后()卵巢与身体的 密度.()()讨论 目前认为 的抗病毒作用机制主要通过激活宿主天然免疫和胞内营养竞争两种方式抑制 病 毒 复 制 这 两 种 方 式 可 能 依 赖 于 在细胞中的载量 有研究认为只要达到一定的载量阈值 菌株均能发挥抗病毒作用()另外 通过显微注射方法可将新的 转染进入本不携带该菌的实验蚊虫体内 然而 目前人工改变蚊虫携带 的载量还未见报道 通过高温或抗生素处理的方法减低或清除 的效果还有待实验验证 等()发现 和 高温可以显著降低玉米螟赤眼蜂的生殖力并可有效杀死 但是高温处理显然不适合蚊虫 因此本研究尝试采用四环素处理蚊虫幼 虫 的 方 法 来 去 除 致 倦 库 蚊 自 然 携 带 的 本研究对幼虫阶段的致倦库蚊使用、和 /四种浓度四环素进行处理 最终发现 /浓度下蚊虫具有较高的生存率 且 去除效果理想因此采用该浓度对两个地理株致倦库蚊进行除菌处理 与 等()的研究结果一致与传统的 基因检测蚊虫体内 不同 我们建立 密度检测荧光定量方法 设计了 基因引物 定量检测了四环素处理前后致倦库蚊整个虫体 密度 结果显示四环素处理后 海口株和温州株共生菌密度中位数分别下降了 倍和 倍 证明该方法能显著降低共生 密度 同时又检测了 四 环 素 处 理 前 后 蚊 虫 卵 巢 和 其 余 部 位 载 量 发 现 处 理 前 蚊 虫 卵 巢 中 密度中位数为身体其余部分的 倍说明 主要定殖于致倦库蚊生殖细胞中四环素处理后两个部位 密度均下降至 以下 卵巢菌密度下降了 倍 再次 证 明 四 环 素 处 理 能 显 著 降 低 致 倦 库 蚊 密度对含有 的赤眼蜂 进行四环素(/)循环处理使雄蜂与雌雄嵌合体的总比率不断增加 但停止吕慧鑫等:四环素降低致倦库蚊共生 密度方法的建立及效果评价处理后不久赤眼蜂将恢复孤雌产雌且不能够得到永久的 治愈品系(.)但用含 /四环素的糖水饲喂致倦库蚊成蚊 在连续处理 代后得到了 完全 清 除 的 致 倦 库 蚊 株 系(.)本研究发现 四环素处理并不能完全清除蚊虫体内的 密度最低的个体 与 基因的拷贝数比值依然有 本研究所建立的四环素处理蚊虫幼虫的方法能显著降低其密度 为后续研究 影响蚊虫的生殖作用以及抗病毒机制的研究提供了技术基础参考文献 .().():.():.():.():.?.():.():.():.():.():.(:)(:).():.():.():.().():.(.).():.:.():.(:).():.():.:.():.:.():.