脱落酸对诱导多能干细胞巨核系血小板分化的影响.pdf

J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3420DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.03.024*本课题受国家自然科学基金面上项目（No.81970165）资助作者单位：200433 上海，中国人民解放军海军军医大学第一附属医院输血科 作者简介：顾海慧，副主任医师，副教授，博士，硕士研究生导师，主要从事细胞治疗与干细胞来源血小板方面研究，（E-mail）。脱落酸对诱导多能干细胞巨核系血小板分化的影响*顾海慧 岳伟 杨玥 黄韦华 钱宝华 【摘要】脱落酸作为一种植物激素，具有抑制植物生长、促进果实成熟和落叶的作用，还可影响动物胚胎发育中核苷合成，发挥抑制肿瘤细胞增殖诱导分化和凋亡的重要作用。研究发现脱落酸对人诱导多能干细胞体外诱导分化生产巨核细胞和血小板也有作用，添加不同剂量的脱落酸，影响体外分化产生造血干细胞、造血祖细胞、巨核细胞和血小板的数量。脱落酸对人诱导多能干细胞体外巨核系血小板分化的相关作用及可能的机制研究对诱导多能干细胞体外大规模分化产生血小板，缓解临床尤其是血小板输注无效患者的血小板供应有重要意义。【关键词】脱落酸 诱导多能干细胞 分化 巨核细胞 血小板 体外 【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）03-0420-05Effect of Abscisic Acid on the Generation of Megakaryocytes and Platelets from Induced Pluripotent Stem Cells in vitro Differentiation GU Haihui,YUE Wei,YANG Yue,et al.Department of Transfusion Medicine,The First Affiliated Hospital of Naval Medical University,Shanghai 200433【Abstract】Abscisic acid is a plant hormone,which can inhibit plant growth,promote fruit ripening and defoliation.ABA can affect nucleoside synthesis during animal embryo development,and play an important role in inhibiting tumor cell proliferation,by means of inducing differentiation and apoptosis.Studies have shown that ABA stimulates the production of megakaryocyte and platelet differentiation from human induced pluripotent stem cells in vitro.ABA can affect the number of hematopoietic stem cells,hematopoietic progenitor cells,megakaryocytes and platelets generation from hiPSCs in vitro system.The study on the related effect and underlying mechanism of ABA on megakaryocyte and platelet differentiation from human induced pluripotent stem cells in vitro is of great significance for the production of platelets by large-scale to meet the needs of platelet transfusion in clinical especially for platelet transfusion refractoriness.【Key words】Abscisic acid Induced pluripotent stem cells Differentiation Megakaryocytes Platelet in vitro血小板输注是当前血小板减少和/或功能障碍所引起出血的不可替代的治疗方法，是手术大出血和放化疗后患者的重要的保障支持。目前临床可用的血小板仍只能通过志愿者无偿捐献获得，血源极其紧张，还存在发生输血反应和感染经血传播疾病的风险1。血小板临床供应呈现季节性、地区性和血型相关的紧缺状态，随着人口老龄化，血小板供需矛盾日益突出。对于产生人白细胞抗原（human leukocyte Antigen，HLA）或人血小板抗原（human platelet antigen，HPA）抗体的血小板输注无效患者输注合适的血小板更加困难。血小板制剂发生细菌污染的风险也高于低温保存的血液制剂。体外生成的血小板可成为输血的替代来源。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）是通过对体细胞“重编程”培育出的干细胞，具有多能性和自我更新能力，可在体外无限扩增培养，可成为生产血小板的源细胞。人iPSCs体外扩增、诱导分化巨核细胞（megakaryocytes，MKs）并产生血小板，对于保障临床血小板供应，尤其是血小板输注无效患者具有重要的意义2。然而从人iPSCs产生MKs和血小板的很多因素尚未确定，效率和产量均亟待提高。脱落酸（abscisic acid，ABA）是一种参与高等植物基本生长发育的重要的植物激素，可以保护植物免受生物和非生物（如寒冷、高热、高盐等）应急刺激。虽然植物和动物有完全不同的ABA受体，但多项研究表明3-6，ABA在植物和动物中也有一种通用的信号分子。ABA在多种动物细胞中分泌，并发挥重要的作用。本文从ABA的基本作用和临床应用出发综述ABA对人iPSC巨核系分化血小板的影响。1 脱落酸（ABA）的基本作用 ABA是一种抑制生长的植物激素，可以引起芽休眠、促进果实与叶的脱临床输血与检验2023年6月第25卷第3期421落。ABA也是广泛存在于生物界的信号因子，存在于真菌，低等生物海绵动物、寄生虫，高等动物鼠、猪以及人类的多种组织细胞中3。ADP-核糖基环化酶（ADP-ribosyl cyclase，ADPRC）通过ABA诱导的蛋白激酶A（PKA）依赖机制被高温激活，海绵动物体通过ABA介导对温度和机械刺激的反应7。寄生虫Toxoplasma gondii体内的ABA，诱导寄生虫产生第二信使环ADP核糖（cyclic ADP-ribose，cADPR），调控钙离子（Ca2+）信号，控制和决定寄生虫宿主的裂解或慢生长的关键性转变因子8。ABA能显著降低高脂饮食导致肥胖小鼠的血脂水平，同时提高小鼠肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活性和降低丙二醇（MDA）含量，高剂量ABA还能显著减少肥胖小鼠腹部脂肪，具有抗肥胖作用9。ABA可诱导胰岛细胞释放胰岛素，影响血糖10。韩佳彤11等研究发现ABA能显著降低小鼠血糖和胰岛素水平，提高小鼠肌糖原和肝糖原含量，中、高剂量组ABA能显著降低小鼠血清中甘油三酯和胆固醇水平，增加高密度脂蛋白水平，显著提高小鼠对胰岛素的敏感性，较好地干预胰岛素抵抗，且高剂量ABA的胰岛素增敏效果优于盐酸吡格列酮。MAGNONE等12研究发现ABA能激活人单核细胞和血管平滑肌细胞，与动脉粥样硬化有关。ABA可激活单核细胞，通过第二信使cADPR诱导细胞内Ca2+浓度升高，再引起 NF-B的激活、环氧合酶-2（COX-2）表达增加、前列腺素 E2（PGE2）产生、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）释放以及金属蛋白酶-9的增加，参与动脉粥样硬化的发生。2 ABA的临床应用 研究发现3-5，人粒细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和胰腺细胞都可以产生和释放ABA，并通过第二信使cADPR信号通路发挥细胞特异性效应。人类粒细胞ABA4被认为是一种新的内源性促炎激素，通过cADPR/Ca2+信号通路发挥作用，可作为抗炎药物开发。单核细胞在血管内皮损伤、血小板被凝血酶激活时释放ABA。单核细胞来源的ABA是一类能自分泌和旁分泌的促炎激素，可刺激单核细胞迁移和MCP-1释放，以及血管平滑肌细胞迁移和增殖。ABA在人类动脉斑块中的浓度比正常动脉组织高10倍，ABA作为一种参与动脉粥样硬化发展的信号分子，能为抗动脉粥样硬化治疗提供了可能的新靶点12。实验研究13证实ABA抑制人胰腺癌细胞株（PANC-1）增殖，通过活化Caspase-3，降低人端粒酶mRNA（hTERTmRNA）及bcl-2、Cyclin D1蛋白的表达促进凋亡。ABA将细胞阻滞于G0/GI期，对人肝癌细胞（SMMC-7721）具有抗增殖，促分化的作用14。ABA明显抑制白血病L5178细胞的增殖，诱导人舌鳞癌Tea8113细胞株的凋亡，ABA的抗癌作用可能与调节Ca2+信号的能力有关，进一步探究ABA在肿瘤的作用机制有利于以ABA为基础的新型抗癌药物开发14。ABA是人和小鼠胰腺细胞中胰岛素分泌的内源刺激剂，具有降低血脂和血糖的作用，可为肥胖和糖尿病的临床治疗提供新思路15。ABA通过激活免疫和调节炎症，被认为可用于多种人类疾病的治疗，在临床上具有改善急慢性炎症、止痛、抗癌、抗焦虑等作用14。ABA缓解疼痛与其调节炎症反应机制有关，通过减少炎症介质的产生和释放来缓解疼痛。3 ABA对成体干细胞的作用 研究发现4，ABA通过激活ADPRC和引起Ca2+动员的第二信使cADPR的过量生产，从而提高细胞内Ca2+浓度调节多种生理功能。MSCs也表达ADPRC，ABA及其第二信使cADPR可促进人MSC的体外增殖，而不影响其分化，相关机制包括ABA与质膜受体结合引发的信号级联，以及随之而来的cAMP介导的ADPRC和cADPR/Ca2+信号系统的激活16。ABA可激活MSC产生COX-2催化的PGE2，并释放与MSCs营养和免疫调节功能及化学激活有关的细胞因子。MSC受到某些特殊生长因子（如骨形态发生蛋白-7）、炎症细胞因子及淋巴细胞培养基的刺激能产生并释放ABA。ABA是MSC的自分泌刺激因子，可能参与MSC、炎症与免疫细胞和造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPCs）的旁分泌信号传导。实验发现6，ABA可以通过cADPR介导的细胞内Ca2+浓度增加体外扩增HPCs。微摩尔级的ABA培养CD34+细胞也能诱导转录效应，包括NF-B核易位和一些细胞因子编码基因的转录。MSC在淋巴细胞培养基刺激下能够产生和分泌足够量的 ABA刺激共培养的HPCs生长，ABA被认为是可同时促进HPCs与MSCs的新造血生长因子。MALARA等1 6研 究 发 现 HSCs向MKs分 化过 程 中，ABA结 合 蛋 白（GRP7 8）和ABA受 体（LANCL-2）的表达上调；成熟的MKs中存在功能性ABA受体，而ABA通过PKA激活和随后的cADPR生成诱导细胞内Ca2+增加。在体外，人或鼠HPCs暴露于10 M ABA不增加重组血小板生成素（rTPO）依赖的MKs分化或血小板释放。然而，在rTPO和血清剥夺诱导的细胞应激条件下，ABA以PKA和cADPR依赖的方式刺激丝裂原激活的激酶ERK1/2，导致Bcl-2家族成员的调节，MKs存活率增加，血小板产 J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3422生率更高，认为ABA是一种TPO非依赖的MKs分化促进因子。4 iPSCs体外分化产生血小板 成人血小板常规从骨髓（bone marrow，BM）中产生，BM是一个高度复杂的组织，由内皮细胞（包括窦、小动脉和过渡区血管）、多能MSCs及其子代（成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞）和造血干祖细胞（hematopoietic stem-progenitor cell，HSPCs）及其子代如MKs和巨噬细胞等组成。经典的血小板生成方式是由HSCs分化为多能祖细胞（multipotent progenitor cells，MPPs），再到普通髓系祖细胞（common myeloid lineage progenitors,CMP），再到巨核/红细胞祖细胞（megakaryocyte-erythrocyte progenitors,MEP），再到巨核祖细胞（megakaryocyte progenitor,MKP），形成MKs，MKs多倍体成熟时形成前血小板（proplatelet），其尖端延伸突破骨髓窦血管进入血流中，被血流剪切成血小板释放。据估计每个MKs会产生并释放数千个血小板17。人iPSCs体外分化产生血小板要经三个主要调控阶段：人iPSCs分化为HSPCs；HSPCs定向分化为MKs；MKs成熟产生血小板。整个阶段受多种因子和信号通路调控，确定的生理机制尚不明确。通过基因编辑、小分子化合物、生物反应器等多种优化方法，2022年12月Eto团队18报道了世界首例患者自体iPSCs体外生成血小板并输注的I期临床试验，1年随访期都是安全的，但是iPSCs体外分化生产血小板的效率和费用仍是其大规模临床应用的主要阻碍。5 ABA对iPSCs巨核系血小板分化的作用 在无饲养层和无血清的条件下，Spin-EB分化培养法可以诱导人外周血iPSCs细胞向MKs分化并在体外产生血小板，但是体外血小板产量较低，即使应用剪切力系统增强血小板释放，一个MK也只产生约7080个血小板，远远低于体内19。研究报道ABA处理有利于人iPSCs体外诱导分化MKs和血小板20。实验方法是将人iPSCs在无饲养层和无血清的条件下，Spin-EB方法体外培养19天，添加不同浓度ABA；第14天收集EB释放的CD34+细胞群，继续添加促进血小板分化的细胞因子（rhTPO，IL-11和SCF）或10 M浓度 ABA图1 脱落酸促进诱导多能干细胞巨核系血小板分化的实验流程进行培养，5天后可收获MKs和血小板。实验流程见图1。5.1 ABA刺激iPSCs体外MK分化的最佳浓度：为了研究人iPSCs体外诱导分化中ABA的作用，研究者20在hiPSC-MK分化的第0天到第19天应用不同浓度（0 M、1 M、2.5 M、5 M、10 M、15 M、20 M、25 M）的ABA对细胞进行刺激。在分化第14天通过流式细胞仪检测不同组别中HPCs（CD34+/CD45+）和MKs（CD41+）的百分比，并进行计数，发现在10 M和25 M ABA作用下，HPCs的产出明显高于0 M ABA处理组；且ABA浓度为10 M时，MKs的生成较其他组显著升高，表明10 M ABA可能是刺激MKs分化的最佳浓度。5.2 不同时间ABA刺激对诱导多能干细胞体外MKs分化的作用。5.2.1 019天持续ABA刺激促进人iPSCs分化出细胞的增殖和MK分化及成熟：人iPSCs体外分化培养019天持续添加10 M ABA，发现第19天ABA处理组细胞数量显著高于非处理组的细胞数；流式细胞术检测细胞表型结果显示，在ABA处理组，CD41+细胞、CD41+/CD42a+细胞及CD41+/CD42b+细胞计数显著升高，且ABA处理组中的MKs具有较高的多倍体率（4N）；显微镜下观察并计数培养上清液中形成血小板前体或芽生血小板的MK（MK-PLTs）数量，ABA 处理组的MK-PLT数量显著高于未处理组，说明人hiPSCs体外分化培养时连续的ABA刺激能够促进MKs分化及成熟20。5.2.2 014天ABA持续刺激可促进CD41+MKs分化：人iPSCs体外分化培养014天添加10 M ABA，发现第14天ABA处理组总细胞数明显高于非处理组。流式细胞术检测细胞表型结果显示，ABA处理组HPCs、HSCs和MKs细胞群数量均高于对照组，说明ABA能临床输血与检验2023年6月第25卷第3期423图2 脱落酸促进诱导多能干细胞体外巨核系分化成熟的的机制够较对照组提前进入MKs分化阶段20。收集第 14天细胞进行Wright-Giemsa染色，可在镜下观察到早期造血细胞，通过激光共聚焦免疫荧光染色，也可观察到ABA处理和未处理组HPC相关细胞表面分子 CD34和CD45的表达。集落形成实验发现ABA处理组的CFU-M/MK和CFU-GM数量均高于对照组，说明014 d天的ABA持续刺激可促进HPC向MK分化20。5.2.3 单纯1419天的ABA刺激不能促进MK分化：人iPSCs体外分化培养14天收集EB释放的细胞，随后1419天用10 M ABA处理，发现ABA处理组和非处理组第19天时的细胞计数无差异，说明1419天ABA刺激不能促进19天时总细胞增殖；流式细胞术检测第19天细胞表型结果显示CD41+，CD41+CD42a+和CD41+CD42b+细胞数无差异，说明，单纯1419天ABA刺激不能促进MK分化和成熟20。5.2.4 014天ABA持续刺激可促进第19天MK分化成熟：人iPSCs体外分化培养时在014天添加ABA，在14天至19天停止添加ABA。在第19天进行实验分析，发现ABA（014）处理组总细胞数显著高于非处理组，而与ABA（0-19）处理组细胞总数无差异；流式细胞术检测细胞表型结果显示ABA（0-14）处理组CD41+、CD41+/CD42a+和CD41+/CD42b+细胞计数均显著高于未处理组，而和ABA（019）处理组无显著差异；显微镜下观察和计数培养上清液中的MK-PLTs，ABA（014）处理组产生MK-PLTs数量与对照组相比明显升高，而与ABA（019）处理组产生MK-PLTs数量无明显差异。统计三组每个HPC产生的MK数量，比较发现各组间产生的/HPCs数量无显著差异。ABA处理后每个人iPSCs可产生0.67至1.14个MKs（CD41+CD42b+），该结果表明014天ABA刺激具有持续19天促进MK成熟的作用20。5.3 ABA刺激促进iPSCs体外MK分化成熟的机制：人iPSCs体外分化培养时连续的ABA刺激可促进细胞增殖、MK分化和成熟，通过在体外培养的不同阶段添加ABA刺激，研究探索ABA在人iPSCs体外MK分化的哪个阶段发挥作用。体外培养第8天，收集细胞并进行流式细胞仪检测结果显示，ABA处理组HPC（CD34+/CD45+）细胞数明显高于未处理组，而HSC（CD34+/CD45）数量无显著差异。该结果表明，ABA刺激能够促进hiPSCs分化早期产生更多的HPCs20。研究6，16发现ABA 触发哺乳动物细胞中ABA受体（LANCL-2）介导的PKA和cADPR CD38级联的信号通路活化，ABA以PKA和cADPR依赖的方式刺激有丝分裂原激活激酶ERK1/2。ERK1/2信号通路与促进细胞增殖和减少凋亡有关。激活 ERK 1/2途径是 MKs分化和血小板生成早期阶段所必需的。通过蛋白质印迹法，实验发现人iPSCs体外培养生产HPC和MK成熟过程中，ABA结合蛋白（GRP78）和LANCL-2的表达逐渐增加，在HPCs中达到峰值，随后在MKs中表达逐渐降低20。在ABA作用下，HSCs中ERK1/2或AKT活化信号与对照组相比没有显著差异，但HPC中AKT和ERK1/2磷酸化水平显著增加，表明在ABA作用下信号通路的激活水平增强。H89是一种易于穿过细胞膜的PKA抑制剂，在人iPSCs体外培养分化第014天，添加不同浓度的H89刺激，无论是否存在 ABA刺激，第19天实验结果发现总细胞数和CD41+/CD42b+细胞的百分比呈现H89剂量依赖性抑制20。虽然不同浓度的H89对 CD41+细胞百分比没有影响，但CD41+细胞的数量随着总细胞的数量减少而显著降低。蛋白印迹分析及流式细胞分析进一步证实PKA抑制剂H89作用后HPC中ERK 1/2和AKT磷酸化水平降低，是ABA促进HPC分化的具体机制20。第 014天添加ABA通过增加其受体LANCL-2和GRP78蛋白在HPC中表达，导致PKA级联的ERK1/2和AKT信号通路激活，促进后续MK的分化和成熟，详见图2。6 结论 当前通过人iPSCs体外高效、低成本的大量 J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3424生成功能性血小板仍然是一项难题。通过无饲养和无异种细胞支持条件下spin-EB培养方法探讨ABA对人iPSCs巨核系血小板分化的作用发现，培养体系中014天持续添加ABA是加快MKs生成的关键步骤，ABA主要通过增加第14天HPCs细胞的产生来促进第19天MKs和血小板的增殖。ABA与HPCs上LANCL-2和GRP78受体结合介导PKA级联的Akt和ERK1/2的信号通路激活是其发挥作用的可能机制。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参 考 文 献 1 STUBBS J R,HOMER M J,SILVERMAN T,et al.The Current state of the platelet supply in the US and proposed options to decrease the risk of critical shortagesJ.Transfusion,2021,61(1):303-312.2 IZADY E,SALTANATPOUR Z,LIU L P,et al.Toward in vitro production of platelet from induced pluripotent stem cellsJ.Stem Cell Rev Rep,2022,18(7):2376-2387.3 LI W Q,WANG L,SHENG X L,et al.Molecular basis for the selective and ABA-independent inhibition of PP2CA by PYL13J.Cell Res,2013,23(12):1369-1379.4 SCARF S,FERRARIS C,FRUSCIONE F,et al.Cyclic ADP-ribose-mediated expansion and stimulation of human mesenchymal stem cells by the plant hormone abscisic acidJ.Stem Cells,2008,26(11):2855-2864.5 BRUZZONE S,MORESCHI I,USAI C,et al.Abscisic acid is an endogenous cytokine in 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