外周血生物活性成分对IL-1β刺激的人软骨细胞的影响.pdf

基金项目：舟山市科技局公益类项目（）作者简介：马志伟，男，生，学士，主任医师，：曲晓言，女，生，硕士，助理研究员，：收稿日期：外周血生物活性成分对 刺激的人软骨细胞的影响马志伟，曲晓言，干贤亮，侯晓军（舟山市普陀区人民医院骨科，舟山 ；中航（宁夏）生物股份有限公司产品研发中心；共同第一作者；通讯作者，：）摘要：目的探讨外周血生物活性成分自体有核细胞处理物（，）对白介素 （）刺激的人软骨细胞迁移、增殖、凋亡与细胞因子分泌的影响。方法采用甲苯胺蓝染色对体外培养的人软骨细胞株 进行鉴定，有核细胞处理试剂盒制备外周血 。将软骨细胞分为对照组（常规培养）、组（处理）和 组（处理 后加入 ）。细胞中加入 后，各组继续培养 ，并每隔 进行观察或取样分析。划痕实验分析 迁移能力，法检测其增殖能力，染色观察细胞凋亡情况，测定 分泌 、的水平。结果甲苯胺蓝染色鉴定培养的 为正常软骨细胞。相比对照组，组 细胞迁移率均下降（），细胞增殖活性在 明显降低（），而细胞凋亡率均显著升高（）。组 分泌水平在 ，相比对照组显著上调（），分泌水平在 ，均显著上调（），而 分泌水平在 时明显下调（）。相比 组，组 细胞迁移率均升高（），细胞增殖活性在 时显著提高（），同时细胞凋亡率明显下降（）。此外，组 、分泌水平相比 组在 ，均显著下调（），而 水平明显升高（）。结论外周血 能够明显改善 刺激的软骨细胞的生物学活性，促进细胞的迁移与增殖，减少其凋亡，从而有效抑制软骨细胞损伤。这些变化可能与 对软骨细胞中炎症因子表达，以及对细胞外基质（）降解、合成之间动态平衡的调控紧密相关。关键词：外周血；生物活性成分；软骨细胞；白介素 ；细胞共培养中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，（），；，：）：（），（），（），（），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 （）：；膝关节骨性关节炎（，）作为一种慢性退行性关节软骨疾病，给患者、家庭和社会造成巨大经济负担。有研究显示，关节腔内注射富血小板血浆（，）或外周血有核细胞（，），能够促进受损关节软骨修复和功能改善，缓解临床症状 。应用中航（宁夏）生物股份有限公司有核细胞处理试剂盒分离提取的人外周血生物活性成分：自体有核细胞处理物（，），其中不仅囊括 中含有的血小板、细胞因子及血浆蛋白，还保留有大量 。关节腔内注射外周血 ，有可能成为一种新的 治疗策略，为 治疗技术发展带来创新性突破。本研究将外周血 与经白介素 （，）刺激的人软骨细胞进行共培养，探究 对受损软骨细胞在细胞迁移、增殖、凋亡及细胞因子分泌方面的影响。材料与方法 材料健康献血者知情同意后采集外周血；人软骨细胞株 采购于青旗（上海）生物技术发展有限公司；培养基采购于美国 公司；胎牛血清（，）采购于美国 公司；甲苯胺蓝染色液采购于北京索莱宝科技有限公司；有核细胞处理试剂盒为中航（宁夏）生物股份有限公司产品；购买自美国 公司；细胞增殖检测试剂盒购买自日本同仁化学研究所；肿瘤坏死因子 （，）、基质金属蛋白酶 （，）与型胶原蛋白（，）酶联免疫检测试剂盒（，）分别购买自武汉博士德生物工程有限公司与武汉云克隆科技股份有限公司；细胞凋亡检测试剂盒为北京雷根生物技术有限公司产品。孔细胞培养板与 小室为美国 公司产品；培养箱购置于美国 公司；荧光显微镜购置于日本 公司；酶标仪购置于美国 公司。方法 细胞培养与鉴定采用常规培养基（培养基 ），于 、条件下进行人软骨细胞株 培养，待细胞约 汇合后传代。软骨细胞鉴定采用甲苯胺蓝染色法。细胞培养 后，用 清洗，加入 的多聚甲醛于 条件下固定 ；去离子水冲洗，孔内加入 的 甲苯胺蓝染色液，室温浸染 ；去除染液并用无水乙醇进行脱色，去离子水终止，显微镜检观察。人外周血 制备采集 健康人外周血，按照“有核细胞处理试剂盒”说明书操作分离提取 、将外周血缓慢加入装有 液的离心管中，离心 ；小心吸取细胞层和血小板层移至新离心管中，加 液至 ，离心 ；弃上清，细胞沉淀用 清洗两次，离心后用细胞培养基重悬，备用。血常规分析显示，外周血制备的 中，平均含量为（）个，血小板平均含量为（）个。实验分组与培养方案 细胞按 孔接种于 孔培养板，分为对照组、组与 组。次日，组、组添加 的 ；培养 后换液，组放入加有外周血 （含 孔 ）的 小室，此时记为共培养。根据以下实验要求，各组继续培养 或 。所有实验设平行孔 个 组，并独立重复 次。划痕实验检测 细胞迁移能力 细胞按 进行实验分组与培养，接种 后，用 无菌枪头进行划痕，清洗去除细胞碎片，组加入外周血 后，各组继续培养 。显微照相并测量 细胞与 共培养，时各组细胞划痕间距，细胞迁移率按照（间距 或 间距）间距 计算。检测 细胞增殖能力 细胞按 进行实验分组与培养，在 细胞与外周血 共培养 ，消化收集各组细胞。各孔取 加入 孔板；并向 孔板每孔加 溶液，培养箱内孵育 后测定 处吸光度值。染色检测 细胞凋亡 ，细胞与 共培养的，消化收集各组细胞。各孔取 离心，清洗次，加 染色液，混匀后 孵育 。荧光显微镜下正常细胞呈低蓝光，凋亡细胞呈高蓝光。每孔选取 个高倍视野，对总细胞及凋亡细胞计数。细胞凋亡率按照公式（凋亡细胞数 总细胞数 ）计算。检测 细胞因子分泌 细胞与 共培养 ，收集各组细胞培养上清液。上清液离心去碎片后，冻存备用。按照 试剂盒操作步骤，分析不同时间点各组 细 胞 上 清 液 中 的 、含量，采用酶标仪于 检测吸光度值。统计学分析采用 统计软件进行统计分析。计量资料以均数 标准差（珋 ）表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用 检验，为差异有统计学意义。结果 细胞形态学特征与染色鉴定 细胞形态较小，贴壁后逐渐伸展为梭形或多角形，细胞汇合后，呈“铺路石”样紧密排列。甲苯胺蓝染色结果显示，细胞染色后呈蓝色，胞质内可见蓝色异染颗粒，表明此细胞能够分泌蛋白聚糖，为正常软骨细胞（见图 ）。细胞形态 甲苯胺蓝染色鉴定 细胞图 人软骨细胞株 细胞形态与鉴定（）（）外周血 对经 刺激的 细胞迁移能力的影响 共培养 ，组相比对照组划痕空白区域面积更大，细胞迁移率均明显低于对照组（）；而 组相比 组划痕区域面积减小，细胞迁移率均明显升高（，见图 ）。外周血 对经 刺激的 细胞增殖能力的影响从与 共培养 起，组相比对照组细胞增殖活性均有所下降，且在 时更为显著图 划痕实验检测 对 细胞迁移的影响（）（）山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期（）。时 组细胞增殖活性超过 组，但差异无统计学意义；时 组相比 组细胞增殖活性进一步升高，差异具有统计学意义（，见图 ）。外周血 对经 刺激的 细胞凋亡水平的影响 染色后，可见正常细胞的细胞核形态正常，产生淡蓝色荧光；而凋亡细胞的细胞核皱缩且染色质浓集，表现为致密的亮蓝色浓染（见图）。从与 共培养 起，组相比对照组细胞凋亡率均显著升高（）。组相比 组细胞凋亡率从 时开始下降，但差异无统计学意义；在 时明显降低，差异具有统计学意义（，见图 ）。与对照组比较，；与 组比较，图 法检测 对 细胞增殖的影响 与对照组比较，；与 组比较，图 染色检测 对 细胞凋亡的影响（）（）外周血 对经 刺激的 细胞因子分泌水平的影响 组相比对照组分泌 水平在 ，均显著上调（）；分泌 水平在，均显著上调（）；在 ，时分泌水平下调，在 时更低，差异具有统计学意义（，见图 ）。在 ，时，组相比 组上清液中 水平均显著下调（），水平均显著下调（），分泌水平均明显升高（，见图 ）。与对照组比较，；与 组比较，图 检测 对 分泌细胞因子水平的影响 ，讨论 是一种常见的慢性软骨退行性疾病，导致关节疼痛、僵硬，严重影响患者身心健康。当前研究显示，关节腔注射 、均能缓解 患者关节疼痛，有助于修复受损关节软骨，并显著改善膝关节功能 。外周血 中含有丰富的血小板、细胞因子、血浆蛋白及 ，有利于组织的再生与修复，在皮肤损伤修复方面已经展现出良好的应用前景，能够改善局部血供，调节细胞因子分泌，加速创面愈合，并抑制瘢痕形成 。关节腔注射外周血 有可能成为一种新颖的 临床治疗策略。作为关键的促炎因子，能够诱导炎症反应、降 解 软 骨 细 胞 外 基 质（，），并促进软骨细胞凋亡，在 病程进展中扮演重要角色 。本研究采用 刺激 软骨细胞，建立软骨细胞损伤模型，借此探讨外周血 共培养对受损软骨细胞产生的影响。研究显示，的 能够抑制 细胞的迁移及增殖活性，并促进细胞凋亡。而将外周血 与 刺激的软骨细胞通过 小室进行共培养后，软骨细胞的迁移及增殖活性明显提高；细胞凋亡率显著下降。这些结果表明，外周血 能够促进软骨细胞迁移，提高增殖与存活能力，提示 能够有效减轻 对软骨细胞造成的损伤。软骨细胞凋亡和 退行性改变是导致关节软骨结构和功能障碍的两个重要因素 。患者膝关节软骨组织中，多种炎症因子大量聚集，促进软骨 降解，诱导软骨细胞凋亡，加剧了受损软骨组织的修复难度 。等 研究发现随着膝关节滑液中 水平升高，患者日常活动能力会进一步降低。软骨 主要由 和蛋白聚糖构成，对保证软骨细胞的完整性至关重要。高水平的 不仅能通过诱导 的表达与活化，引起 和蛋白聚糖过度降解，导致软骨 流失；还能通过下调 表达，抑制 合成，影响软骨组织修复能力，最终导致软骨变性，加重 病情 。因此本研究以 为 细胞炎症水平检测指标，为 分解代谢检测指标，为 合成代谢检测指标，探讨外周血 对经 刺激的软骨细胞在细胞因子分泌方面的影响。检测结果显示，的 能够刺激软骨细胞分泌 和 ，并抑制 表达。外周血 与 刺激的软骨细胞共培养后，能够明显下调上清液中 水平，抑制 诱发的炎症反应，显著下调 分泌并上调 表达，从而有效抑制 降解，促进 合成。综上所述，外周血 能够减轻 造成的软骨细胞损伤，有助于促进软骨细胞迁移，刺激细胞增殖，并下调软骨细胞凋亡。这可能与 对软骨细胞中炎症因子表达的抑制作用，及其对软骨 合成与降解失衡状态的调节作用紧密相关，研究提示外周血 将成为助力软骨组织修复的潜在治疗策略。本研究初步评估了外周血 在体外对损伤软骨细胞生物学活性的影响，其中涉及的主要分子机制和作用途径还有待更深入的探讨。同时，有必要后续进一步开展 治疗 动物模型的体内研究，评估该疗法的安全性与有效性，从而为临床自体外周血 治疗 医疗项目的实施夯实研究基础。参考文献：，：，（）：邢亨特，邱波 富血小板血浆注射治疗在膝骨关节炎中的应用进展 生物技术进展，（）：沈兴潮，宋才渊，吕帅洁，等 膝关节腔注射外周血干细胞和富血小板血浆联合口服补肾活血汤治疗膝骨关节炎 中医正骨，（）：邢丹，余楠生，袁霆，等 关节腔注射富血小板血浆治疗膝骨关节炎的临床实践指南（年版）中华关节外科杂志（电子版），（）：，（）：，：，（）：王琳，高赫，任爽，等 外周血有核细胞治疗右鼻翼皮肤坏死一例 中华医学美学美容杂志，（）：贺牡丹，王小平，陈同生 白介素 诱导关节软骨细胞凋亡的分子机理 中国细胞生物学学报，（）：王新军，袁银鹏，王越，等 软骨细胞凋亡引发骨关节炎的机制研究进展 山东医药，（）：吴晓惠，唐流刚，王标，等 滑液尿酸及白细胞介素 、白细胞介素 、肿瘤坏死因子 与膝骨关节炎相关性研究 华西医学，（）：，（）：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期