荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量.doc

荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量
姓名：周蕴赟 学号：40507026
（2005级4班 Email : zyy1021@）

一、实验目的
1、学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理；
2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。

二、实验原理：
常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：

当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：

这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
荧光分析法的特点：
a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。
b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。
c. 所需试样量少、操作方法简便。
荧光光谱
激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。
固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。
荧光分析仪器
常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：
液槽
显示器
单色器
检测器
I0
I
If
光源
单色器

维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：

维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。
多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。
维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

三、试剂与仪器:
970CRT荧光光度计

5 ml吸量管1只，2 ml吸量管1只， 50 ml容量瓶6只, 100 ml容量瓶1只
10.0μg/ml维生素B2标准溶液，冰乙酸， 多维葡萄糖粉试样。

四、实验步骤:
（一）、970CRT荧光光度计基本操作：
1. 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，预热30min。
2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：
设置激发波长为440nm，发射波长为540 nm，灵敏度＝2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。
3、点击“测本底值”，测得本底值为1.41。
4. 样品测定
1）标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：
    在6个干净的50 ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。
2）未知试样的测定：
称取0.1378g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入100 ml容量瓶中，加2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次。
5、退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。
五、数据处理：
1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线

浓度(μg/ml)
荧光强度(I)
1
2
3
平均
0.1
4.323
4.307
4.298
4.309
0.2
7.380
7.329
7.340
7.350
0.3
9.840
9.801
9.790
9.810
0.4
12.020
12.033
11.976
12.010
0.5
14.678
14.781
14.744
14.734
0.6
17.088
17.091
17.090
17.090

2、未知样品浓度的测定                
根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。

编号
1
2
3
平均值
I
7.177
7.202
7.127
7.177
C/ug.ml-1
0.203
0.204
0.201
0.203

维生素B2百分含量= (0.203×50×10-6)/0.1378×100％=0.0074％

六、注意事项
1.使用970CRT时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作。
2.使用石英比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，因握住恻棱。

七、思考题：
1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？
答：荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸收光度法，无论是提高激发光强度提高仪器灵敏度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光光度法较吸收光度法灵敏度高。

2. 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？
答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内，且必须在避光条件下进行。