乳腺癌中ASS1的表达及其与临床病理特征和预后的相关性.pdf

西北大学学报（自然科学版）2023年8 月，第53卷第4期，Aug.，2 0 2 3,V o l.53,No.4Journal of Northwest University(Natural Science Edition)JNWU肿瘤学乳腺癌中ASS1的表达及其与临床病理特征和预后的相关性聂雅婷12,丁兰,袁媛,刘磊”,沈立新1（1.西北大学生命科学学院，陕西西安7 10 0 6 9;2.空军军医大学基础医学院，陕西西安7 10 0 32）摘要探究乳腺癌组织中尿素循环关键分子及其与乳腺癌临床病理特征和预后的关系。首先,通过TCGA及GTEx数据库筛选乳腺癌中差异表达的尿素循环关键分子，分析其与乳腺癌患者预后的关系。然后，收集2 0 10 年11月至2 0 16 年12 月在西京医院进行手术治疗的97 例乳腺癌患者以及54例非肿瘤（乳腺腺病）患者的手术标本，制作组织芯片，利用免疫组化染色法研究乳腺癌和正常乳腺（乳腺腺病）组织中精氨酸代琥珀酸合成酶（a r g i n i n o s u c c i n a t e s y n t h a s e 1,A SS1）的表达情况，并确定其与临床病理特征和预后之间的关系。分析TCGA及GTEx数据库发现，尿素循环关键分子ASS1在乳腺癌中表达下降，并与患者的预后显著相关（p0.05）。免疫组化染色显示ASS1主要定位于胞浆,在乳腺癌中表达下降，且与Ki-67表达及分子分型显著相关（p=0.0215,0.0005）。A SS1在乳腺癌中表达显著下降,与肿瘤的分子分型、Ki-67表达密切相关,推测其在肿瘤发生发展中起着重要的作用。因此,ASS1低表达可以作为评估乳腺癌预后的潜在指标。关键词尿素循环;ASS1（精氨酸代琥珀酸合成酶）;乳腺癌；预后中图分类号：R737.9D0I:10.16152/ki.xdxbzr.2023-04-014ASS1 expression and its correlation with clinicopathologicalfeatures and prognosis in breast cancerNIE Yating,DING Lan,YUAN Yuan,LIU Lei,SHEN Lixin(1.The College of Life Sciences,Northwest University,Xi an 710069,China;2.Basic Medical Science Academy,Air Force Medical University,Xi an 710032,China)Abstract To determine the key molecule in breast cancer pathology and clinical prognosis by data analysis aswell as surgical specimens immunohistochemical staining analysis.TCGA and GTEx databases were used toscreen key molecules in the urea cycle with differential expression in breast,and their relationship with theprognosis of breast cancer patients was also analyzed.Then,the surgical specimens of 97 breast cancer pa-tients and 54 non-neoplastic(mammary gland disease)patients who underwent surgical treatment in XijingHospital from November 2010 to December 2016 were collected to produce breast cancer tissue chips.Immu-nohistochemical staining was employed to determine the expression of ASS1(argininosuccinate synthase 1)inbreast cancer and adjacent normal tissues,and to verify its relationship with pathological features and prognosisof breast cancer.TCGA and GTEx database analysis showed that the expression of ASS1 decreased in breast收稿日期：2 0 2 2-11-15基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（2 0 2 2 JM-536）;陕西化生基础科学研究项目（2 2 JHZ008）第一作者：聂雅婷,女，从事胶质瘤代谢相关研究,。通信作者：沈立新，女，教授，博士生导师，从事病原微生物致病及耐药机制等研究，。628 cancer,significantly correlated with the prognosis of patients(p 5 cm）,固定、制作组织芯片、切片染色。肿瘤组织经病理诊断均为浸润性乳腺癌,非肿瘤组织为乳腺腺病。所有患者均为首次确诊,术前均未接受任何放化疗治疗、内分泌治疗且未合并其他恶性肿瘤,排除妊娠期女性、男性乳腺癌患者、不能明确分子分型者,临床病理资料完整。1.3乳腺癌分子分型的判定基于不同的基因表达特点收集各个乳腺癌分子亚型病例，主要包括：LuminalA型（10 例）、Lu-minalB型（47 例）、过表达型（30 例）和Basal-like型（10 例）。本研究通过了西京医院医学伦理委员会审批，患者及家属知情。1.4免疫组化染色检测ASS1的表达正常乳腺组织以及乳腺癌组织石蜡样本切片、二甲苯、梯度乙醇脱蜡，自来水冲洗10 min;1 Tris-EDTA(10 Tris-EDTA 碱修复液:Tris 12.1g,EDTA3.7g,去离子水定容至50 0 mL)碱修复液进行高压抗原修复;1%TritonX-100水溶液处理15 30 min进行透化，1PBS清洗3次，每次3min;滴加3%H,0z，避光放置10 2 0 min,结束后1PBS清洗3次，每次3min;采用非一抗来源的山羊血清封闭30 min；滴加兔来源抗人ASS1抗体（1：30 0，Abcam，货号：ab170952)4过夜孵育；室温复苏1h,1PBS清洗3次，每次3min;二抗（山羊抗兔IgG,1：10 0 0 0,Ja c k s o n,货号：111-0 35-0 0 3）室温孵育1h,1PBS清洗3次，第53卷第4期每次3min。D A B染色液显色（ultra viewuniversalDABdetection kit,中山金桥,ZLI-9018）,并在显微镜（10）下观察，看到淡黄色着色后立即将切片置于自来水中终止着色。苏木素复染510 s，1%盐酸-酒精分化3 5s，自来水冲洗10 2 0min返蓝;脱水中性树胶封片。结果判读采用半定量评分标准，于高倍镜下随机选取10 个视野进行阳性细胞计数。评分标准：染色程度。无染色（0 分），淡黄色（1分），棕黄色（2 分），黄褐色（3分）。阳性细胞数计数。5%(0 分),6%2 5%(1 分),2 6%50%(2分),51%7 4%(3分）,7 5%（4分）。依据上述两项积分乘积进行判定：0 分记为（）/阴性，14分记为（+）/弱阳性,58 分记为（+）/阳性，8 分记为（+）/强阳性。1.5 统计方法采用SPSS25.0统计软件进行统计学分析，GraphPad Prism8.0统计软件进行生存曲线制作。服从正态分布的计量数据用均数标准差（meanSD)表示，采用方差分析进行比较；不服从正态分布的计量资料采用四分位间距进行统计描4正常乳腺一乳腺病2F聂雅婷,等：乳腺癌中ASS1 的表达及其与临床病理特征和预后的相关性 629.述，采用非参数检验（Kruskal-Wallis秩和检验）进行组间比较。ASS1蛋白水平与乳腺癌患者临床病理特征的关系分析采用 Spearman秩相关性分析,生存分析采用Kaplan-Meier法并进行Log-rank检验。2石研究结果2.1TCGA数据库分析乳腺癌中尿素循环关键分子的表达氨基甲酰磷酸合成酶1（carbamoyl phosphatesynthetase1,CPS1）、A SS1、A SL和精氨酸酶（argi-nase,ARG1）等是催化尿素循环的代谢酶。主要表达于肝脏,其他组织中发生一定程度的特异性表达。其中 CPS1 和ASS1是尿素循环的关键限速酶,确保尿素循环得以顺利进行。通过分析1212例TCGA数据库乳腺癌患者及90 例GTEx正常乳腺组织mRNA数据发现,这4种酶在乳腺癌中的表达均下调,且差异具有统计学意义（p0.0001）（见图1）。提示乳腺癌患者存在尿素循环障碍。10r5正常乳脓乳腺癌4-5-6(a)CPS1在正常乳腺和乳腺癌中的表达6F4-10正常乳腺乳腺癌J正常乳腺乳腺癌(b)ASS1在正常乳腺和乳腺癌中的表达正常乳腺3F乳腺痛2正常乳腺一乳腺癌0-14（c）A SL在正常乳腺和乳腺癌中的表达注：（a）（d)结果表明,尿素循环分子CPS1、A SS1、A SL、A RG 1在乳腺癌中的表达均下调,且差异具有统计学意义(p 0.000 1)。正常乳腺乳腺瘤图1尿素循环关键分子在乳腺癌中的表达Fig.1 Expression of key molecules of urea cycle in breast cancer-2（d）A RG 1在正常乳腺和乳腺癌中的表达工正常乳腺乳腺癌 6302.2尿素循环关键分子ASS1表达与预后的相关性基于以上结果,进一步分析TCGA数据库中1217例乳腺癌患者的生存时间发现,尿素循环关键分子ASS1和CPS1低表达乳腺癌患者总体生存率均高于高表达患者，而ASL和ARG1高表达患者总体生存率高于低表达患者。通过Kaplan-1.00.80.60.40.20.001.00.80.60.40.20.00注：经Kaplan-Meier分析和log-rank检验显示,ASS1高表达组患者总体生存率均低于低表达组患者（p0.05)【见图2(a）、图2(c）、图2(d)】。Fig.2 Relationship between the expression of CPS1,ASS1,ASL,ARGl and the prognosis of breast cancer patients2.3免疫组化分析ASS1在乳腺癌组织及非肿瘤组织的表达对乳腺癌组织芯片进行ASS1免疫组化染色,定义ASS1阴性（）以及弱阳性（+）为ASS1低表达（ASS1-L），A SS1阳性（+）及强阳性（+）为高表达（ASS1-H）。免疫组化染色显示ASS1在正常乳腺组织中高表达【见图3（a）（b)】,而在肿瘤组织中呈现异质性表达【见图3（c）（f)。免疫组化结果显示,97 例乳腺癌组织中7 4例（7 6.2 9%）为ASS1-L,23例（2 3.7 1%）为ASS1-H,而在54例正常乳腺组织中47 例（8 7.0 3%）为ASS1-H。与正常乳腺组织相比，ASS1在乳腺癌中的表达下降,且差异具有统计学意义(p0.05,见表1)。西北大学学报（自然科学版）Meier分析并进行Log-rank检验，说明ASS1低表达对患者预后有显著影响（p=0.0031)【见图2（b）。而CPS1、A SL和ARG1表达水平对乳腺癌患者的预后无显著影响（p=0.3313,0.5801，0.4604)【见图2（a）、图2（c）、图2（d)。选择与预后有关的ASS1 基因进行后续研究。-CPS1-L(n-607)1.0CPS1-H(n=607)Logrankp=0.9438pvalue=0.331311200040006000800010000生存时间/d（a）CPS1表达与乳腺癌患者预后的关系ASLL(n=607)ASL-H(n=607)Logrankp-0.3061pvalue=0.5801200040006000800010000生存时间/d（c）A SL表达与乳腺癌患者预后的关系图2 CPS1、A SS1、A SL、A RG 1表达与乳腺癌患者预后的关系第53卷ASS1-L(n-607)ASS1-11(n-607)0.8Logrankp-8.762pvalue=0.00310.60.40.20.001.00.80.60.40.20.002.4ASS1 评分与乳腺癌临床病理特征的关系对乳腺癌患者临床病理信息进行 Spearman秩相关性分析发现，ASS1表达与患者分子分型、Ki-67显著相关（p=0.0005,0.0215,见表1）。而与肿瘤直径、雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）、人类表皮生长因子受体（human epidermal growthfactor receptor2,HER-2）以及淋巴结转移无关（p=0.340 3,0.091 0,0.123 3,0.051 4,0.116 6,见表2)。其中Ki-67为细胞核内分裂增殖相关蛋白,临床上常作为肿瘤细胞增殖活性的可靠标记，与患者预后有关。实验发现ASS1低表达与Ki-67呈正相关,即ASS1低表达患者预后差。前期根据以下标准Luminal A型：ER阳性和（或）PR阳性,HER-2 阴性,Ki-6714%。Lu m in a l B 型:12.00040006000800010000牛存时间/d（b）A SS1表达与乳腺癌患者预后的关系ARG1-L(n=607)ARG1-H(n=607)Logrankp=0.5444pvalue=0.460620004000 6000800010000牛存时间/d（d）A RG 1表达与乳腺癌患者预后的关系第4期ER阳性和（或）PR阳性,HER-2阴性，Ki-6714%或者ER阳性和（或)PR阳性,HER-2阳性。HER-2过表达型：ER阴性,PR阴性，HER-2阳性。Basal-like型：ER阴性,PR阴性,HER-2阴20m聂雅婷,等：乳腺癌中 ASS1 的表达及其与临床病理特征和预后的相关性 631 性。对收集的临床病人信息进行整合发现,ASS1低表达与分子分型显著相关,可以针对不同的分子分型采取精准治疗。20m（a）正常乳腺组织：阴性（-）（b）正常乳腺组织：阳性（+）20um20um（c）乳腺癌组织：阴性（-）（d）乳腺癌组织：弱阳性（+）20m20m（e）乳腺癌组织：阳性（+）图3ASS1在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达Fig.3 Expression of ASS1 in normal breast tissues and breast cancer tissues表1ASS1在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达Tab.1Expression of ASS1 in normal breast tissues and breast cancer tissues低表达乳腺腺病组织7乳腺癌组织74总计81（f）乳腺癌组织：强阳性（+）A.SS1表达总计高表达472370P值54 14%)阴性（14%)淋巴结转移有无不确定西北大学学报（自然科学版）表2 ASS1表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系ASS1例数84740210473010534446517225643356365第53卷Rho0.042 1623892812210421484430383654204925452540.340 30.329 00.000 5516291481518515811111-0.136 6-0.118 10.165 80.210 3-0.121 50.091 00.123 30.051 40.021 50.116 62.5ASS1表达水平与乳腺癌患者预后的关系总体生存率和无进展生存期是乳腺癌患者的预后指标,研究中免疫组化染色的97 例乳腺癌患者中ASS1低表达的患者7 4例,截至随访结束生存6 0 例（8 1.0 8%），ASS1高表达的2 3例患者中生存2 0 例（8 6.96%），即ASS1低表达患者总体生存率低。ASS1低表达的7 3例患者中生存6 2例（8 4.9%），ASS1高表达的2 4例患者中生存2 0例（8 3.3%），即ASS1低表达患者的无进展生存率较高表达组高。但是通过Kaplan-Meier生存分析发现,ASS1 表达水平和患者总体生存率(p0.05)【见图4(a)、无进展生存期无相关性（p0.05)见图 4(b)。第4期1.11.00.90.80.70.60（a）A SS1表达与乳腺癌患者总体生存率的关系注：（a）A SS1低表达组患者总体生存率较高表达组低，但差异无统计学意义,P0.05；（b）A SS1低表达组患者无进展生存率较高表达组低，但差异无统计学意义，P0.05。Fig.4 Association between ASS1 expression and overall survival and progression-free survival in breast cancer patients3分析及结论全球乳腺癌的发病率呈上升趋势，位居女性恶性肿瘤之首 10 。目前,手术结合放化疗是治疗乳腺癌的主要手段，但其高度异质性、高复发率、耐药性使治疗效果不可观 4112。因此,探讨乳腺癌的发生、发展及其转移复发的分子机制，寻找潜在的特异性分子生物靶点对于乳腺癌诊断治疗有着极其重要的意义。研究发现,ASS1 低表达与骨肉瘤患者术后转移以及不良预后显著相关 13。此外,ASS1 低表达与黏液纤维肉瘤的分级和分期密切相关,并且可以独立预测肿瘤的无转移生存期和疾病特异性生存期 14。本实验通过分析TCGA以及GTEx数据库发现，乳腺癌中ASS1、CPS1、A SL和ARG1表达均显著下调，提示乳腺癌存在尿素循环障碍。其中,ASS1 下降与乳腺癌患者预后显著相关(p=0.0031）,与低表达组相比，ASS1高表达组预后较差。基于以上分析，本研究制作了乳腺癌以及乳腺腺病组织芯片，进行免疫组化染色，发现ASS1在乳腺癌患者中的表达显著下调,且 ASS1低表达与乳腺癌预后以及无病生存期具有一定相关性。本实验病例主要处于乳腺癌早期，各分子分型病人所占比重不同,同时存活率较高，故总体生存率以及无进展生存期差异不显著。进一步分析临床病理特征发现,ASS1表达与Ki-67以及乳腺分子分型显著相关,而与肿瘤T分期、淋巴结聂雅婷,等：乳腺癌中ASS1的表达及其与临床病理特征和预后的相关性-ASS1-L-ASS1-HLogrankp=0.8691HR-1.554(95%,CT-0.43170.591)pvalue=0.550 22040生存时间/m图4ASS1表达与乳腺癌患者总体生存率以及无进展生存率的关系 6331.1-ASS1-LASSI-H1.0%/0.90.80.76080Logrankp=0.0985HR=0.7536（9 5%,C I=0.36 56 4.0 15)p value=0.753 611000（b）A SS1表达与乳腺癌患者无进展生存率的关系转移、ER、PR、H ER-2 等无关。本研究为单中心小样本研究,所得结果可能存在偏倚,后期还需继续扩大临床样本量对研究结果进一步补充说明，以便得出更为可靠的结果,用于临床诊断及参考。尿素循环缺陷也是乳腺癌治疗的潜在代谢靶点。研究发现,ASS1在一些乳腺癌细胞中表达低或者缺失,这意味着乳腺癌细胞自身不能通过尿素循环合成内源性精氨酸 15,所以癌细胞生长和增殖所需的精氨酸必须从循环血液中获得,导致产生精氨酸依赖 16 。若血清中精氨酸含量降低，则乳腺癌细胞会因为缺乏营养而死亡 17 。聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶（ADI-PEG20）促进精氨酸转变为瓜氨酸,从而降低血液中的精氨酸含量,有望用于ASS1 低表达乳腺癌患者的治疗。此外，mTOR 抑制剂通过抑制CAD（c a r b a mo y l-phosphate synthetase 2,aspartate transcarbamylase,anddihydroorotase）的磷酸化，与ASS1竞争底物天冬氨酸,从而竞争性抑制精氨酸生成，也可以抑制ASS1低表达乳腺癌细胞的增殖生长 18 。因此,ASS1的表达水平对于乳腺癌具有重要的生物学意义，可成为治疗乳腺癌值得关注的新靶点。综上，本研究发现ASS1在乳腺癌中呈现异质性，但总体表达水平低于正常乳腺组织，并且ASS1低表达与乳腺癌Ki-67、患者预后及分子分型等存在显著相关性。因此,ASS1在乳腺癌的发生发展中具有重要作用，有望作为乳腺癌诊断及治疗的重要靶标。2040生存时间/m6080100 634参考文献1SUNG H,FERLAY J,SIEGEL R L,et al.Globalcancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of inci-dence and mortality worldwide for 36 cancers in 185countriesJ.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.2刘宗超，李哲轩，张阳，等.2 0 2 0 全球癌症统计报告解读 J肿瘤综合治疗电子杂志，2 0 2 1，7(2）：1-14.LIU Z C,LI Z X,ZHANG Y,et al.Interpretation onthe report of global cancer statistics 2020J.Journalof Multidisciplinary Cancer Management(ElectronicVersion),2021,7(2):1-14.3WEI J L,JIANG Y Z,SHAO Z M.The survival bene-fit of postmastectomy radiotherapy for breast cancer pa-tients with T1-2N1 disease according to molecular sub-type J.The Breast,2020,51:40-49.4蒋梦怡，陆言巧，王红霞乳腺癌异质性的研究进展及临床意义J中国癌症杂志，2 0 2 0，30（5）：394-400.JIANG M Y,LU Y Q,WANG H X.Research pro-gress and clinical significance of breast cancer hetero-geneityJ.China Oncology,2020,30(5):394-400.5 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