FluoroBeadsR分离T淋巴细胞及B淋巴细胞.doc

FluoroBeadsR分离T淋巴细胞和B淋巴细胞
发布: 2010-02-23 来自: 易生物实验 阅读数：7899次
【原理】
免疫磁性微珠表面联结着单克隆抗体的超顺磁性微珠。这些微珠在磁场中能够聚集在一起。当移去磁场时，这些磁珠不残留任何磁性。它们能再被磁化和分散。连接的单克隆抗体的特异性决定着结合细胞的类型。
分离T细胞
【原理】
T 荧光微珠提供了一个利用荧光染色进行Ⅰ型HLA 分型试验中分离T 淋巴细胞的简单的步骤。
T 荧光微珠是直径小于1 微米的免疫磁珠。抗CD2 单克隆抗体包被在微珠表面。CD2 抗体特异性吸附T 淋巴细胞上的E 花结受体。通过磁力架从血液中分离T 淋巴细胞／T 荧光微珠复合体。T 荧光磁珠方法不需要低温孵育、离心分离等步骤。
【注意】
人血液的使用必须严格按照操作步骤和实验室操作规范进行。用手接触标本可能会传染疾病。
【储存条件】
T 荧光微珠和T 荧光微珠显色剂要在2－5℃储存并在有效期前使用。不能冷冻。T 荧光微珠显色剂需避光保存。
【需要的材料和设备】
1.T 荧光微珠（FB1-25；FB1-40；FB1-100）
2.T 荧光微珠显色剂（FB1-DEV）（10×储存液）。工作液（1X），1 份储存液和9 份PBS 混合。
3.Ⅰ型组织分型板
4.FQAE（丫啶黄／溴化乙啶）
5.磁力架
6.1μL 与5μL 加样器
7.5mL 试管
0.磷酸盐缓冲液（PBS），无Ca++和Mg++盐类
0.吸管与吸头
【操作步骤】
（A） 样品采集
约需要2ml 的全血。抗凝剂首选ACD 或CPDA，也可以用肝素钠。不要使用肝素锂！T 细胞的分离要在24 小时内完成分离以得到最高产量，血液保存3 天内使用，血标本要水平放置在20－25℃储存。
（B） Ｔ淋巴细胞提取
方法一：从全血中分离
1、在5ml 的试管中放入2ml 血。
2、T 荧光微珠使用前彻底混悬，旋转约10 秒钟。
3、在待测样品中加入150μl 的T 荧光微珠。加盖反复颠倒2－3 次，使磁性微珠分散开。
4、在室温20－25℃轻轻的旋转3 分钟，让微珠附着到T 细胞上（不要超过4 分钟）。可以使用一种颠倒的装置或手动混匀。
5、加入2ml 稀释后的T 荧光微珠显色剂（工作液）。盖上盖子轻轻的颠倒2－3 次以混匀。
6、打开盖子并放到磁力架上3 分钟，不要超过4 分钟（本步骤为关键）。
7、用移液管移去上清液，移离磁力架。
8、用1－2mlPBS 清洗细胞（微珠）。轻击管子使微珠散开，再次将管子放到磁力架上1 分钟，移弃上清液。反复洗两次。
9、用0.5ml 的PBS 或含5％HIFCS 的McCoy’s 再次混悬细胞（微珠）。
方法二：从淋巴细胞分离液层（Ficoll 层）分离
1、以400－900g 离心已抗凝的全血。
2、收集白膜层并用等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，混匀。
3、在5ml 的管中最多加入2ml 的白膜层／PBS 混合液覆盖到1.5ml 的Ficoll－Hypaque（密度为1.077）层上，并以1000g 离心10 分钟。
4、从每个管中收集约1ml 的界面液体转移到炮弹管中。1000g 离心10 分钟。
5、弃去上清并用细胞培养液1640 再次使小球混悬。以1000g 离心5 分钟（移去大部分血小板。）弃去上清，用1ml 的20％的HIFCS／PBS 再次混悬细胞。
6、用吸液管移去上清，用1ml 的细胞培养液1640 再次混悬细胞。
7、加入100μl 的T 荧光微珠到样品管中。
8、在20－25℃旋混3 分钟。
9、去盖放在磁力架上1 分钟。
10、去上清并保存到另一个管中，用B 荧光微珠分离B 淋巴细胞。
11、1ml 细胞培养液1640 再次混悬细胞。轻击管子使得微珠再次混悬，放在磁力架上30 秒钟，用吸液管移去上清。重复2 次。
12、用0.5ml 的细胞培养液1640 再次混悬细胞（微珠）。
（C） 标记与调整细胞浓度
【FQAE 方法】
1、在泰萨奇板上的空白孔中加入1μl 的细胞（微珠）液。或在一张干净的玻片滴一滴细胞悬液。
2、加入5μl 的FQAE。或在一张干净的玻片滴一大滴FQAE。
3、用荧光显微镜计数。调整细胞浓度到2×106 ／ml（2000 个细胞／孔）。
【羧基二乙酰基荧光黄（CFDA）方法】
1、去盖放在磁力架上1 分钟，弃去上清。用PBS 混悬。重复两次。
2、加入0.5mlCFDA（工作液，pH5.5）并混匀。
3、在20－25℃避光孵育10 分钟。
4、重复步骤1。
5、用0.5ml 的含5％HIFCS 的McCoy’s 再次混悬细胞。
分离B细胞
【原理】
B 荧光微珠提供了一个在Ⅱ型HLA 分型试验中利用荧光染料分离B 淋巴细胞的简单的步骤在B 荧光微珠分离方法中，PBS/柠檬酸盐缓冲液是特别预制的。B 荧光微珠是直径小于1 微米的免疫磁性微珠。抗CD19单克隆抗体包被在微珠表面。CD19 抗体特异性吸附T 淋巴细胞上的E 花结受体。通过磁力架从血液中分离B 淋巴细胞／B 荧光微珠复合体。B 荧光微珠方法不需要孵育、旋转、离心分离等步骤。PBS/柠檬酸盐缓冲液是抗凝剂，能提高B 荧光微珠的磁性免疫微珠的分离能力。
【注意】
人血液的使用必须严格按照操作步骤和实验室操作规范进行。用手接触标本可能会传染疾病。
【储存条件】
B 荧光微珠和PBS/柠檬酸盐缓冲液储存在2－5℃。
【需要的材料和设备】
1、B 荧光微珠（FB2-25、FB2-40、FB2-100）。
2、PBS/柠檬酸盐试剂（PCI-500）
3、II 型细胞表面抗原分型板
4、磁力架
5、去离子水配制的磷酸盐缓冲液（PBS）
6、吸管或加样器
7、5mL 试管
8、5％的HIFCS（热灭活的胎牛血清）的McCoy’s
【操作步骤】

（A） 样品采集
抽约10ml 的血。抗凝血药首选ACD 或CPDA。不要使用肝素锂！B 细胞的分离要在24 小时内完成分离，血液在3 天内还是能使用的，血标本水平放置在20－25℃储存。
（A） B 细胞提取
方法一：从全血离心后白膜层中分离
1、以400－900g（1500RPM 左右）离心血液10 分钟。
2、离心后确保完整的获得白细胞膜（1 毫升左右），移取约1ml 离心后白膜层到一个5ml管中。
3、加入4ml PBS/柠檬酸盐缓冲液混匀。
4、B 荧光微珠使用前彻底混匀，旋转约10 秒钟。
5、加入150μlB 荧光微珠到待测标本中。加盖颠倒2－3 次使磁性微珠分散。
6、在室温20－25℃旋转试管3 分钟，使得细胞粘附到微珠上（不要超过4 分钟）否则容易造成血小板和单核细胞凝集。充分颠倒混匀，翻转试管每秒钟一次。
7、去盖并放到磁力架上2 分钟（不要超过3 分钟）。
8、用移液管移去上清液，移去磁力架。
9、用1－2ml 的PBS/柠檬酸盐缓冲液再次混悬细胞，轻击管子使微珠散开，再次将管子放到磁力架上1 分钟，移弃上清液。重复两次。注意：第一次清洗至关重要，因标本中仍存在大量的血小板、单核细胞和多核细胞。第一次清洗用PBS/柠檬酸盐。
加PBS/柠檬酸盐后，请不要翻转试管，否则会造成血小板聚集并黏附到单核细胞和磁珠上。 应在加PBS/柠檬酸盐后立即将试管放在磁架上。在磁架上的时间不要超过一分钟，否则容易使血小板和单核细胞黏附到磁珠上，导致反应弱或假阴性。PBS/柠檬酸盐的功能为防止血小板聚集及黏附到磁珠上。PBS/柠檬酸盐为螯合物，可能会轻微抑制补体反应，所以第二次和第三次清洗可以用普通PBS。
10、用0.5ml 的含5％HIFCS 的McCoy’s、或PBS 试剂再次混悬细胞／微珠。注意：分离出的B 细胞最好溶在5％的McCoy’s 或RPMI。McCoy’s 或RPMI 为组织培养液，含有钙、镁等离子。而补体反应需要钙离子和镁离子。PBS 不是营养液，也不含有钙、镁离子。如果将分离出来的细胞溶在PBS 中，将会导致反应弱或假阴性。
方法二：从Ficoll 层中分离
1、以400－900g 离心10 分钟已抗凝的血。
2、收集白膜层并用等体积的细胞培养液1640 稀释，混匀。
3、在5ml 的管中加入最多2ml 的白膜层／细胞培养液1640 混合液覆盖到1.5ml 的Ficoll－Hypaque（密度为1.077）层上，并以1000g 离心10 分钟。
4、从每个管中收集约1ml 的界面液体转移到炮弹管中。离心1000g 离心10 分钟。
5、弃去上清并用细胞培养液1640 再次使小球混悬。以1000g 离心5 分钟（移去大部分血小板）。
6、用可换的吸液管移取上清，用1ml 的细胞培养液1640 再次混悬细胞。
7、加入100μl 的B 荧光微珠到样品管中。
8、在20－25℃旋混3 分钟。
9、去盖放在磁力架上1 分钟。
10、移去上清并保存到里另一个管中，用T 荧光微珠分离T 淋巴细胞。
11、用1ml 的细胞培养液1640 再次混悬细胞。轻击管子使得微珠再次混悬，放在磁力架上30 秒钟，用吸液管移取上清。重复2 次。
12、标记或用0.5ml 的细胞培养液1640 再次混悬细胞（微珠）。
方法三：从全血中分离
1、在15ml 的管中放入5ml 血。
2、在待测样品中加入5ml 的1×PBS/柠檬酸盐缓冲液并倒置混合。
3、在待测样品中加入100μl 的B 荧光微珠。在室温20－25℃轻轻的旋混3－5 分钟（不要超过5 分钟），充分颠倒混匀。
4、去盖并放到磁力架上5 分钟。用移液管移去上清液，移去磁力架。
5、用2－3ml 1×PBS/柠檬酸盐缓冲液在待测样品中。轻击管子使微珠散开，再次将管子放到磁力架上1分钟，移弃上清液。重复两次。
6、标记或用0.5ml 的细胞培养液1640 再次混悬细胞（微珠）。
（A） 标记步骤与调整细胞浓度
【FQAE 方法】
1、在泰萨奇板上的空白孔中加入1μl 的细胞（微珠）液。
2、加入5μl 的FQAE。
3、用荧光显微镜计数。调整细胞浓度到2×106 ／ml（2000 个细胞／孔）。
【羧基二乙酰基荧光黄（CFDA）法】
去盖放在磁力架上1 分钟，弃去上清。用PBS 再次混悬。重复两次。加入0.5mlCFDA（工作液，pH5.5）并混匀。在20－25℃避光孵育10 分钟。重复步骤1。用0.5ml 的含5％HIFCS 的McCoy’s 再次混悬细胞。用CFDA 标记的细胞：在泰萨奇板上的一个空白孔中加入1μl 的细胞混悬液。用荧光显微镜计数。调整细胞浓度到2×106 ／ml（2000 个细胞／孔），将标本移到费希尔管，在检测前2 天放置在2－5℃储存。
（A） T 和B 荧光微珠问题解决指南
问题一：产量少
解决：
1、 存血样时间过长，淋巴细胞死亡过多，在20－25℃水平储存血样。垂直储存血样相当于1g 离心作用。几个小时后细胞将集中在黄色层中，将因失去足够的营养而死亡。
2、 对于T 荧光微珠尽量不要使用PBS/柠檬酸盐缓冲液，柠檬酸盐将减少T 细胞E 的数量仅对于T 荧光微珠。
3、小心的混合血样。强烈混合能减少产量。
问题二：淋巴细胞死亡（少量的溴乙非啶污染淋巴细胞）
解决：
加入0.05ml DNA 酶到0.5ml 的细胞上清液中，混匀。37℃孵育15 分钟。放在磁力架上1 分钟弃去上清。用PBS 在此混悬，重复此步骤。用含5％HIFCS 的McCoy’S 液再次混悬。