学习写立项依据.docx

（一） 立项依据与研究内容
1. 项目的立项依据
（一）研究意义
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，以往以欧美国家高发，但是在我国女性中的发病率也逐年以3%的速率增加，上海等地的发病率已经接近了某些欧美国家和地区。由于目前对于乳腺癌发病机理的认识还不够清楚，我们难以降低乳腺癌的发病率和促进相关防治手段的更新进步。虽然以往许多学者对乳腺癌的高发危险因素进行了详细的调查研究，但是对于这些因素如何引起乳腺癌却知之甚少。如果我们从干细胞的自我更新调控Wnt信号途径方面入手，有可能找到乳腺癌发生的关键环节，用以减少乳腺癌的发病率和提供乳腺癌防治的新靶点 （个人觉得，这一句话写得很突兀，和前面几乎没有联系）。据此，本研究拟以乳腺干细胞和Wnt信号途径作为研究对象，揭示乳癌发生过程中Wnt信号途径相关蛋白和相关基因表达的变化情况，明确相关改变影响乳腺干细胞自我更新调控的作用机理，阐明引起乳腺上皮干细胞发生恶性转化的关键因素，为防治乳腺癌提供新思路和理论依据。

（二）国内外研究现状
如何才能更好地防治乳腺癌，最重要的就是清楚乳腺癌的关键发病机理和诱发因素。在诱发因素方面，已经明确雌激素水平、高脂饮食等多种因素和乳腺癌发生有关；在发病机理方面的研究发现，肿瘤的染色体具有非整倍性（染色体数量和/或结构改变），提示肿瘤的产生与染色体不稳定性和大量基因突变有关[1～2]。但是仅用原癌基因和抑癌基因突变的分子机制无法明确地解释乳腺癌的发病机理，并且有研究者提出质疑：大量基因突变究竟是肿瘤的原因还是结果？ （这个问题，直到整个标书看完了，也没有找到对应的答案。后面又如何衔接到干细胞去的？也没有很好的交代。）

1、干细胞自我更新与肿瘤发生
随着肿瘤干细胞的提出和发现，干细胞在肿瘤发生中的地位开始成为大家关注的热点。肿瘤细胞与干细胞之间存在着惊人的相似性：具有自我更新能力和相似的生长调控机制，用以维持克隆生长。Wnt、Hh信号途径是目前发现与干细胞的增殖分化密切相关的信号传导途径，并且与肿瘤发生发展有密切关系。上述途径被激活后可以启动干细胞的自我更新和组织修复，但是持续激活则可以引起干细胞发生恶性转化，导致肿瘤的发生[3]（见下图）。不但以往的肿瘤分子流行病学研究中已经观察到一些可以促进Hh或Wnt信号途径活化的家族性突变和多种人、鼠的肿瘤发生有关，同时也已经有研究表明肿瘤干细胞起源于正常组织干细胞，因为两者具有相同的表面标志[4～5]。这些发现为我们重新认识肿瘤的起源，以及制定有效的肿瘤防治策略开辟了新的视角，提供了新的思路。 （肿瘤细胞、干细胞、肿瘤干细胞三者间关系没有阐明，干细胞分很多种，起码可以分成体干细胞和胚胎干细胞，不同条件下，具有定向或多向分化潜能，肿瘤细胞与其的相似性恐怕差的还是很远；即使肿瘤干细胞也会存在类似的区别。因此这里的交代很含混。）

2、乳腺干细胞与乳腺癌干细胞
乳腺干细胞和成人乳腺组织的增生（青春期和怀孕哺乳期）、更新（月经周期性变化）以及乳腺癌发生关系密切。正常情况下，成人乳腺组织增生和更新时，乳腺干细胞开始处于相对活跃状态，平时则处于相对静止状态；当体内外环境的改变导致乳腺正常的干细胞出现异常，发生恶性转化成为肿瘤干细胞时，就会导致乳腺癌的发生[6～7]。支持乳腺干细胞存在的实验证据来自Kordon EC[8]的研究：一个乳腺干细胞可以构建出一个完整功能的乳腺组织；Al-Hajj[9]等在对人乳腺癌细胞亚群分选和动物移植模型研究中发现，仅有表面标志是Lin－CD44＋CD24－/low的乳腺癌干细胞才能复制出乳腺癌模型，其它的乳腺癌细胞即使大量接种也难以形成乳腺癌，证实乳腺癌干细胞是乳腺癌的起源。也为我们进一步研究乳腺干细胞与乳腺癌的起源的关系提供了良好的研究基础。 （如果这是08年前的基金，这样写可能不会遭受太多质疑，但是08年底有牛人用更好的敲基因小鼠证实过肿瘤干细胞不一定存在，将恶黑的细胞单个接种，同样也可以成瘤，从而挑战了肿瘤干细胞这个概念。乳腺干细胞变成乳腺癌干细胞，这样的提法似乎应该找更牛的文章做证据，乳腺干细胞和乳腺癌干细胞表面标志还是Lin－CD44＋CD24－/low么？乳腺干细胞和乳腺癌干细胞的区别在哪里？怎么知道乳腺干细胞变成了乳腺癌干细胞？）

3、Wnt信号途径与乳腺干细胞自我更新的调控
Wnt信号途径的激活（见下图）始于Wnt效应子（目前已知有19个成员）和胞膜受体Fz、LRP5/6结合，促使β–catenin从复合体中解离出来并进入细胞核内，和Lgs、Pypopus、Tcf/LEF结合后促进靶基因（如CyclinD1、c–myc等）的表达。Wnt信号途径的抑制因子主要有SPRP、WIF、DKK、GSK3β、CK1a。
在对干细胞自我更新调控研究中发现Wnt信号途径与乳腺组织的发育和癌变关系密切[10]。在鼠模型中通过转染使Wnt效应子活性增加后，人们观察到鼠乳腺组织中干细胞的比例增加[11]；而且当鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）感染宿主后，病毒会整合到的宿主染色体的同一部位，并且引起Wnt信号途径活化以及促进乳腺组织发育、乳腺增生以及乳腺癌的发生[10]；表明Wnt信号途径的活化可以引起乳腺干细胞的自我更新和富集以及促进乳腺癌的发生。 （除了Wnt，其余的可以简单提一提，体现自己认真研究过文献，否则大家都说自己做的最重要，最关键。）

但是以往的相关研究仅仅限于鼠源性乳腺组织模型。最近已经成功在NOD/SCID鼠中重建了具有正常结构和功能的人乳腺组织动物模型[12]，这无疑为我们研究人乳腺癌发生过程中Wnt信号途径和乳腺干细胞自我更新调控的变化提供了良好的研究模型。
　（三）本研究基本思路与意义
本项研究拟在诱发人乳腺癌全过程中观察Wnt信号途径相关蛋白和相关基因的变化情况，并根据发生时间顺序、发生频率、发生强度等因素分析Wnt信号途径在癌变过程中的变化规律，同时通过将相应变化作用于乳腺干细胞并观察乳腺干细胞接种动物模型后的乳腺组织生长发育以及恶性转化情况，明确相关改变在乳腺干细胞自我更新中所起的调控作用。这样就有可能揭示Wnt信号途径变化引起乳腺上皮干细胞发生自我更新失调控，进而导致乳腺癌发生的关键环节，部分阐明乳腺癌的发病机理，有望为防治乳腺癌提供新的理论依据和思路。 （似乎漏掉了Wnt和乳腺癌干细胞的关系探讨，既然存在着乳腺干细胞→乳腺癌干细胞→乳腺癌的关系，作为关键部分的乳腺癌干细胞，不应忽略）

参考文献：
1. Harith Rajagopalan,Christoph Lengauer. Aneuploidy and cancer. (2004) Nature;432:338～341.
2. Brandt L,Schneider,Molly Kulesz-Martin. Destructive cycles: the role of genomic instability and adaptation in carcinogenesis. (2004)Carcinogenesis;25:2033～2044.
3.Philip AB, Sunil SK,David MB.Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis.( 2004)Nature;432:324～331.
4. Singh SK, Clarke ID, Terasaki M,et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors[J].( 2003) Cancer Res;63(18): 5821～5828.
5. Hope KJ,Jin L, Dick JE. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity. (2004) Nature Immunol;5: 738～743.
6.G Dontu,D El-Ashry, MS Wicha.Breast cancer,stem/progenitor cells and the estrogen receptor. ( 2004)Trends Endocrinal Metab;15(5):193～197.
7.I Baik,PS Becker, WJ Devito.Stem cells and prenatal origin of breast cancer. (2004)Cancer Causes Control;15(5):517～530.
8. Kordon EC, Smith GH. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. (1998)Development;125:1921～1930.
9. Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez et al; Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. (2003) PNAS; 100: 3983～3988.
10. Keith RB,Anthony MC. Brown. Wnt Proteins in Mammary Development and Cancer. ( 2004)Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia; 9( 2): 119～131.
11. Liu BY, McDermott SP, Khwaja SS et al. The transforming activity of Wnt effectors correlates with their ability to induce the accumulation of mammary progenitor cells. (2004)PNAS;101: 4158～4163.
12. Charlotte K, Tony C, Min W,et al. Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice.(2004)PNAS;101:4966～4971.

这份标书，新意明确，好好修改，说服力会更强，但从行文来看，可能为新手。其一缺乏研究基础，尤其是自己的原始数据，这样的标书如同在纸上划了个蛋，然后告诉评委，这个蛋可以孵出小鸡来；其二申请者逻辑推理稍显牵强，尤其是乳腺干细胞、乳腺癌干细胞、乳腺癌交待得不够清楚，其内在联系也不明确；其三引入Wnt后做的工作主要是一堆现象的观察和检测，并且大而全，但是忽略了仅靠Wnt恐怕不能解释所有的问题的。

下面这份标书，我个人认为应当是已经中标了。贴出来大家仔细学习一下。里面还是有几个小小的问题，和大家一起探讨。

我室牵头完成的国家科技攻关项目“重庆市水资源安全技术信息分析与对策研究(2003BA903B03-02)”和“三峡成库后水中持久性有毒物质污染对人群健康危害研究（2003BA869C）”表明：长江和嘉陵江水源中有机物污染较为严重，共检出101中有机污染物，主要包括酯类、酮类、酚类及杂环类，邻苯二甲酸二丁酯等7种污染物属于我国水环境优先控制污染物，浓度高达22.8μg/L[1,2]；重庆主城区人群体内检测到292种有机污染物，邻苯二甲酸二丁酯含量高达78.29±34.01μg/L[3]。通过遗传毒性、肝肾损害、神经毒性、雄性生殖毒性及雌性生殖毒性等研究，发现这些有机物污染物可以影响人体健康和饮用水安全，对人体内分泌造成干扰，并造成生殖毒性，甚至可能致癌[1,4,5]。研究结果受到了国家相关部门的高度关注，进一步加速了我国环境保护与环境污染治理研究的进程（详细结果见研究基础）。

邻苯二甲酸酯(Phthalic Acid Esters，PAEs)是工农业生产中具有广泛用途的塑料添加剂以及农药载体、驱虫剂、化妆品、香味品、润滑剂和去污剂的生产原料，同时又是一类全球性有毒难降解有机污染物[6,7,8]。环境中常见的有邻苯二甲酸二甲酯, 邻苯二甲酸二乙酯, 邻苯二甲酸二丁酯, 邻苯二甲酸二异丁酯, 邻苯二甲酸二正辛酯, 邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，邻苯二甲酸二异辛酯。PAEs具有低水溶性，低挥发性及脂溶性等特性，其对固体颗粒、生物体表现出很强的吸附性和亲和性。由于在塑料及其它制品中，PAEs呈游离状态,随着时间的推移，极易转移进入环境，而广泛存在于大气、水体、土壤及生物体内。已有的研究表明，PAEs毒性高，具致畸性、致突变性、致癌性及生殖毒性[9]。目前, PAEs已成为全球最普遍的污染物之一，美国国家环保局和中国环境监测总站均列其为优先控制污染物[10]。

将微生物强大的降解功能应用于邻苯二甲酸酯类物质的环境污染治理是当前国际上的研究热点。在PAEs的降解过程中，水解酶、加氧酶、脱羧酶等酶类发挥着关键作用，由水解酶启动，生成邻苯二甲酸单酯和邻苯二甲酸，而苯甲酸在开环之前，必须经过加氧和脱羧基两个过程。PAEs降解是否彻底、降解效率如何取决于这些关键酶功能的发挥。有关于降解菌的研究已经逐渐从降解菌的分离、鉴定及降解特性等基础研究发展到了PAEs降解菌降解相关的基因及基因编码的功能蛋白的研究，特别是功能蛋白的结构和性状以及功能蛋白在降解各环节中的作用和影响因素。目前国际上研究较多的PAEs降解菌主要有Arthrobacter keyseri 12B[11]、Burkholderia cepacia DBO1[12]、Terrabacter sp strain DBF63[13]、Mycobacterium vanbaalenii PYR-1[14]、Gordonia sp strain FERM P-18102[15]、Rhodococcus ruber strain CQ0301[16] 和Microbacterium sp strain CQ0110Y[18]。虽然这些降解菌都具有PAEs降解功能，但各自的降解机理又各有差异，降解过程中涉及的功能酶也不完全相同，对这些功能酶的结构和性状进行深入研究显得尤为重要。

我室近几年围绕邻苯二甲酸酯类物质污染的生物降解做了大量研究，已从污染环境中分离到了多株PAEs高效降解菌，能以PAEs为唯一碳源和能源进行生长，其中CQ0110Y菌能降解浓度高达1500 mg/L的PAEs，且半减期t1/2仅为1.5天[17]。在国家自然科学基金项目“邻苯二甲酸酯降解菌降解基因的克隆及其功能表达验证（50408027）”(2005-2007)的资助下，我们进一步阐明了邻苯二甲酸酯的降解机理并且成功克隆了降解基因。PAEs在酯酶作用水解成单酯，继续水解成邻苯二甲酸，进一步降解成苯甲酸，苯甲酸在加氧酶作用下形成对羟基苯甲酸，对羟基苯甲酸脱羧基生成苯酚，经还原反应成环已醇，进而转化成丙酮酸、琥珀酸、延胡索酸等进入三羧酸循环，最终转化为二氧化碳和水[18]。同时，我们采用鸟枪法构建了PAEs降解菌CQ0110Y的基因组文库，文库质量很好，效价达到了5x108 PFU/μg连接DNA。利用功能筛选法从基因组文库中筛选到了一片段大小为3100bp的阳性克隆，该克隆能够在含有PAEs为唯一碳源和能源的无机盐培养基内生长。进一步的基因信息分析显示，该片段含有一大小为2895bp的开放阅读框（ORF）。经过RT-PCR验证，该片段来源于原始降解菌并且可以表达mRNA（详细结果见研究基础）。该基因命名为phtY，在Genbank的登记号为：EF449771。 （“利用功能筛选法从基因组文库中筛选到了一片段大小为3100bp的阳性克隆，该克隆能够在含有PAEs为唯一碳源和能源的无机盐培养基内生长”，不知道是否为笔误，从基因组文库中筛选出的片段应为DNA，DNA不算克隆吧？有点点挑刺的味道，希望申请者不要介意。）

本项目拟立足于前期研究基础，进一步围绕降解菌CQ0110Y对PAEs降解过程中涉及的相关功能蛋白酶展开研究：（1）采用基因克隆和表达技术研究phtY基因编码的蛋白的结构和性状；（2）采用蛋白质双向电泳和质谱技术分析降解菌CQ0110Y在底物诱导下的差异蛋白，进一步明确phtY基因编码的蛋白在PAEs降解过程中的作用，同时寻找新的降解相关的功能蛋白并研究其结构和性状；（3）应用获得的功能蛋白酶进行PAEs降解实验。该研究结果可为水环境中PAEs污染治理以及饮用水的深度处理打下基础，具有较好的环境效益和社会效益。 （研究内容有些过多、过大，做phtY的同时还在继续筛，筛完还在继续做）

参考文献
1. 重庆市水资源中有机物含量高危害人体健康。《国内动态清样》，2005年1月11日（11期），新华通讯社。
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3. Ji-an chen(陈济安), Huijie Liu(刘慧杰), Weiqun Shu(舒为群),et al. Analysis of organic chemicals and di-n-butyl phthalate determination in parturiting women of Chongqing in China. Environment International (under review).
4. 田怀军，舒为群，邱志群，等。长江流域某市饮用水雌激素污染物初步研究。第三军医大学学报。2004，26(19)：1751-1754。
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写得非常好，这是一份不折不扣的来自军医大学的标标准准的标书。虽然有点小瑕疵，但是不影响整体。另外参考文献中过多引用自己的文献，由于申请者在此方面的确做了大量研究工作，倒也说得过去。许多人都觉得，这几年几所军医大学拿国家自然基金委的钱太多了，觉得里面黑幕不少，但是仔细一看，人家写标书的水平的确摆在那里的啊。坦白而言，由于自然基金的钱最终名单是公布的，可以随时查的，因此相对还是公平。再有军医大学拿的并不是大钱，真正的大钱是不会随便摆出来的，君不见，有的城市，花一晚上写份标书，一周后批下来就300、600万的也不少，一个所就几十号人，一个月之内拿上亿的科研经费也比比皆是。因此希望大家，标书好好写，工作好好干，“牢骚太盛防肠断，风物长宜放眼量”，看到的只是皮毛，看不到的才是超乎你想象的海市蜃楼。我始终坚信来这里看帖，回帖的很多人和我一样，属于农二代，出身、做人都清清白白，虽然在五光十色的繁华都市里偶尔会迷失自我，但是洗净铅尘，散尽浮华，仍然生活在最底层。因此，摆正自己的位置，不卑不亢，不轻视标书，但也不要视其为生命中最重要的部分，认认真真对待就OK了。

新春之际，非常感谢大家的祝福与关注，祝愿大家在新的一年里，万事如意！