牛蒡子杀小瓜虫活性成分研究.pdf

病害防治栏目编辑宋迁红牛募子杀小瓜虫活性成分研究胡少军(杭州市富阳区农业技术推广中心，浙江杭州3 1 1 4 0 0)牛子是菊科植物牛的一种干果，它被广泛应用于驱散致病风热、促疹、止疮咽喉、排毒、消肿。牛子的主要活性成分是木质素类化合物，被证实具有抗氧化、抗炎和抗菌作用，此外，其也被证实具有抗肿瘤活性。在水产动物上，王高学等报道其具有较好的杀指环虫的作用，同时利用活性追踪试验发现其主要杀虫活性成分为牛劳子苷和牛劳子苷元。在笔者之前的研究中，发现牛劳子正丁醇提取物具有较好的体外杀小瓜虫的作用，因此本研究通过构建体外杀小瓜虫药物筛选模型，利用活性追踪方法分离牛劳子抗小瓜虫活性成分，并利用波谱分析活性单体的化学结构，评价其体内的杀虫药效，为研发新型杀小瓜虫药物提供技术基础和理论依据。一、材料与方法1.供试虫体多子小瓜虫采自浙江开化某草鱼养殖场。2.天然植物牛劳子采自浙江莫干山，由中国药科大学中药学院鉴定。3.试验鱼草鱼体重为2 0 克/尾左右，购自萧山某苗种繁育场，随机取鳃显微观察，并未感染小瓜虫，同时观察鱼体表面未发现白点。鱼体健康，游动自由。草鱼在实验室适应性养殖1 周后，进行模型构建。4.活性追踪试验(1)虫体的收集。将严重感染小瓜虫的草鱼用MS-222麻醉后，迅速取鳃组织（尽量不携带血块）放置到经盛有灭菌水的平皿中，待放置1 小时后，用吸管吸取水体中游动的小瓜虫滋养体。将收集的滋养体一部分放置于2 2 的培养箱中用于掠食体的培养，另一部分放置于1 2 孔细胞培养板中用于制备包囊。(2)体外杀掠食体药效试验。精确吸取上述制备的小瓜虫掠食体1 毫升，放入2 4 孔细胞培养板中，同时加入1 毫升不同浓度梯度的药液，并用吸54科学养鱼2023.6管吹匀，吹匀后放到2 2 培养箱中。之后，于用药后5 分钟和1、2、3、4 小时拿出培养板在显微镜上进行观察，并记录掠食体的死亡情况。小瓜虫纤毛不运动、虫体破裂等均视为虫体死亡，最高浓度组药物的DMSO量为对照组（该浓度的DMSO被证实对小瓜虫掠食体无毒），活性追踪试验以幼虫1 0 0%杀灭作为评价指标。(3)体外杀包囊药效试验。精确吸取上述制备的小瓜虫包囊1 毫升（约含包囊3 0 个），放入到24孔细胞培养板中，同时加入1 毫升不同浓度梯度的药液，并用吸管吹匀，吹匀后放置到2 2 的培养箱中6 小时，小心倒掉药液，并重新加入新的灭菌的蒸馏水继续培养2 0 3 6 小时，显微观察包囊的死亡情况，并统计每个细胞孔中的掠食体的数量，每组试验设置3 个重复。包囊破裂或包囊未分裂（胞质不运动)视为死亡，活性追踪试验以包囊100%杀灭作为评价指标。(4)牛劳子杀虫活性成分追踪分离。前期研究表明牛劳子的杀虫活性部位为其正丁醇提取部分，故而继续对其进行杀虫活性追踪。取3 5 0.0 克牛子正丁醇提取浓缩物，湿法上柱，利用硅胶柱层析进行分离。以TLC检测分析为指导，合并相似流份，对各个流份组进行杀虫活性药效测定，不具杀虫活性的流份丢弃，具有较强杀虫效果的流份组继续进行追踪分离直至分离得到活性单体，并利用质谱、核磁氢谱、核磁碳谱等分析确定其化学结构为拉帕酚C。5.体内杀虫药效评价按照上述方法获取小瓜虫感染性幼虫，并以30005 0 0 0 个/尾鱼的幼虫量感染草鱼（1 0 15克/尾），6 0 9 6 小时后即可见草鱼体表有大小不一的白点，显微观察鱼体有大量小瓜虫，即表明感染成功。随机抽取感染有小瓜虫的草鱼1 0 尾放入体积为1 0 升的养殖鱼缸中，并加入所需浓度的药物，4 8 小时后镜检鱼体表（体视显微镜）、鳃的小瓜虫总数量，并与对照组相比计算杀虫率。试验条件如下：温度(2 0 1)、pH7.27.4、溶氧大于5 毫克/升。试验设置对照组和用药组，病害防治栏目编辑宋迁红每组设置3 个平行。10090二、结果801.拉帕酚C体外杀小瓜虫药效7060(1)拉帕酚C对小瓜虫掠食体的杀虫活性。拉50帕酚C对小瓜虫掠食体的体外杀灭结果见图1，可4030知，拉帕酚C对小瓜虫掠食体具有较好的杀灭作20用，1 0 0%杀灭浓度为3.5 毫克/升，半致死浓度为1001.19毫克/升。120100(%)率啤806040200图1 拉帕酚C对小瓜虫掠食体的杀虫活性(2)拉帕酚C对小瓜虫包囊的杀虫活性。拉帕酚C对小瓜虫包囊的杀灭结果见图2，可知，拉帕酚C对小瓜虫包囊具有较好的杀灭作用，在浓度为13.0毫克/升时可1 0 0%杀灭包囊，其作用于小瓜虫包囊后，高浓度组包囊破裂并快速死亡，而低浓度组包囊完整，但其不分裂也不孵化掠食体。1201008060200图2 拉帕酚C对小瓜虫包囊的杀虫活性2.拉帕酚C体内杀小瓜虫药效拉帕酚C体内杀小瓜虫活性结果见图3，可知，拉帕酚C具有较好的体内杀小瓜虫活性，且呈一定的浓度梯度依赖关系，随着药物浓度的增加其杀虫活性也不断增加，浓度为1 3.0 毫克/升时，鱼体存活的小瓜虫数量为对照组的9 2.5%。结果表明其具有较好的杀虫效果。95.285.473.8482518.4135拉帕酚C浓度（毫克/升）图3 拉帕酚C体内杀小瓜虫活性10091.578.951.538.820.411.5拉帕酚C浓度（毫克/升）68.455.340.52535拉帕酚C浓度（毫克/升）7三、讨论本研究在前期工作的基础上，利用活性追踪试验从牛劳子中分离获得一种对小瓜虫具有杀灭作用的化合物拉帕酚C，这是首次发现拉帕酚C对鱼寄生虫具有杀灭作用，可以丰富其作用，也可为其进行仿生合成提供基础资料。22.579933.510086.6J111311活性追踪是研究天然植物药效活性的重要技术手段，其中最为关键的是简便、高效的药效模型的构建。药效模型有体外和体内两种且各具优缺点。体外模型简便、高效且不需要大量的活性物质，体内模型具有临床实际的特点，故而更能有效反应药物的实际使用效果，但缺点是耗时、耗力。姚嘉赞等也利用活性追踪方法从博落回中分离获得两种具有较好杀虫效果的药物血根碱和二氢血根碱。本研究同时构建了体外和体内两种药效模型，从两个不同的维度追踪分离牛劳子的杀虫药效结果，因此结果更可靠。同时，本研究仅对杀虫效果最好的正丁醇提取部分进行追踪分离，但其他提取部位未进行分离，这些部位也有较大的研究意义，需要进一步分离。拉帕酚C是1 种新型的木脂素。木脂素是1 类由两分子苯丙素衍生物（即C6-C3单体)聚合而成的天然化合物，具有广泛的生物活性，如抗病毒、抗真菌以及抗肿瘤等。牛子含有丰富的木脂素，研究者也从其中分离获得了拉帕酚A、拉帕酚B、拉帕酚C和拉帕酚F等化合物。其中拉帕酚F被证实具有广泛的抗肿瘤活性，主要是通过调控MDM2/14-3-3/YAP抑制肿瘤的生长。本研究发现，低浓度的拉帕酚C也可抑制小瓜虫包囊的分裂，同时还可抑制包囊的孵化，但具体机制有待进一步研究。综上，从牛劳子中分离获得1 种具较好杀小瓜虫作用的化合物，经鉴定为拉帕酚C，是1 种具有一定开发潜力的杀虫化合物。5513科学养鱼2023.6