铁皮石斛拟原球茎的诱导.pdf

2023 年 7 月 热 带 农 业 科 学热 带 农 业 科 学 第 43 卷第 7 期 Jul.2023 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE Vol.43,No.7 收稿日期 2022-12-06；修回日期 2022-12-27 第一作者 张玉蓉（1997），女，学士，研究方向为植物组织培养、遗传育种和种苗开发，E-mail：。通讯作者 岳健（1979），男，学士，高级农艺师，研究方向为药用植物综合开发利用研究和管理，E-mail：。铁皮石斛拟原球茎的诱导 张玉蓉1 管世超1 王晓2 苏娟2 赵艳娟2 岳健1,2（1.云南青谷生物科技有限公司 云南昆明 650299；2.云南山里红生物科技有限公司 云南昆明 650299）摘 要 以铁皮石斛无菌苗的茎段作为外植体，研究了 2 种铁皮石斛拟原球茎诱导路径，即通过茎段直接诱导以及通过茎段分化的侧芽再诱导，筛选出适合铁皮石斛的拟原球茎（PLBS）诱导培养基，以期能够诱导出大量的拟原球茎，缩短诱导时间，提高诱导效率，达到提高铁皮石斛种苗产量的目的。结果表明，在不同的拟原球茎诱导路径下，诱导效率有所不同，筛选出 2 种诱导效率较高的培养基，通过茎段直接诱导拟原球茎路径条件下，最佳培养基为 1/2 MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ+1 g/L 水解酪蛋白，诱导率为 85%，培养周期为 90 d；通过茎段分化侧芽再诱导路径条件下，最佳培养基为 1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1 g/L 水解酪蛋白，诱导率为 75%，培养周期为75 d。利用侧芽诱导拟原球茎比茎段直接诱导节省时间，在同样的培养基中，茎段诱导拟原球茎比侧芽诱导的诱导率更高。本研究以期为铁皮石斛工厂化育苗提供可行的技术路线。关键词 铁皮石斛；拟原球茎；培养基 中图分类号 S567.239 文献标识码 A DOI:10.12008/j.issn.1009-2196.2023.07.004 Induction of Dendrobium officinales Protocorm-like Bodies ZHANG Yurong1 GUAN Shichao1 WANG Xiao2 SU Juan2 ZHAO Yanjuan2 YUE Jian1,2(1.Yunnan Qinggu Biotechnology Co.,Ltd.,Kunming,Yunnan 650299,China;2.Yunnan Shanlihong Biotechnology Co.,Ltd.,Kunming,Yunnan 650299,China)Abstract Using stem segments of Dendrobium officinale seedlings as explants,two D.officinale bulb induction pathways were investigated,i.e.,direct induction through stem segments and re-induction through lateral buds differentiated from stem segments,and the prophylactic bulb(PLBS)induction medium was screened for D.officinale,to induce a large number of prophylactic bulb,to shorten the induction time,to improve the induction efficiency,and to achieve the purpose of increasing the seedling yield of D.officinale.The results showed that the induction efficiency varied under different pathways of the prophylactic bulb induction,and two mediums with higher induction efficiency were screened out.Under the condition of direct inducement of prophylactic bulb through stem segments pathway,the optimal medium was 1/2 MS+1 mgL1 6-BA+0.1 mgL1 NAA+0.1 mgL1 TDZ+1 gL1 hydrolyzed casein,with an induction rate of 85%,and the incubation period was 90 d;under the condition of re-induction pathway by differentiation of lateral buds from stem segments,the optimal medium was 1/2 MS+1.5 mgL1 6-BA+0.5 mgL1 NAA+1 gL1 hydrolyzed casein,with an induction rate of 75%and a culture period of 75 d.The induction of protocorm using lateral buds saved more time than that by stem segments,and the induction rate was higher than that by lateral buds in the same medium induction rate in the same medium.This study aims to provide a feasible technical route for Dendrobium plant nurseries.Keywords Dendrobium officinale;protocorm-like body;culture medium 铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生附生草本植物，以新鲜或干燥茎入药，被称为“九大仙草之首”，是我国名贵中药材，始载于神农本草经，具有“补五脏虚，劳羸瘦，厚肠胃”的功效。李时珍在本草纲目中记载：“石斛除痹下气，补五脏虚劳羸瘦，强阴益精，久服，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，逐皮肤邪热痱气，脚膝疼冷痹弱，定志除惊，轻身延年”，具有滋阴清热、益胃生津、抗癌和免疫调节等功效，1987 年被列入我国国家重点保护植物名录。在中国药典2020 版中记载，铁皮石2023 年 7 月 热带农业科学 第 43 卷第 7 期 -26-斛性甘，微寒，归胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热的功效。铁皮石斛可用于热病津伤、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明、筋骨痿软1-4。野生铁皮石斛多生长于树皮或岩石上，生长环境要求苛刻，自然条件下发芽率一般低于 5%，繁殖率极低2-3。因此，运用组织培养技术进行无性系种苗的繁育，对于铁皮石斛产业的保护和发展起到积极的作用。从 20 世纪 70 年代起，国内外已开展铁皮石斛组织快繁技术研究，从目前的研究进展来看，铁皮石斛组培快繁技术应用于规模化育苗栽培还存在问题，如组培苗的生产成本高4-5。铁皮石斛组培苗快繁时，培养转接次数多、周期长，消耗了大量的人力和物力，而铁皮石斛在组织培养中的关键时期之一便是原球茎的诱导4。另有报道显示，铁皮石斛原球茎同样含有大量的功能性成分，早年研究已报道铁皮石斛愈伤组织培养物与原植株多糖含量、化学组分以及药理方面的免疫指标之间存在着明显的相似性；还有报道称，原球茎多糖含量与二年生野生石斛无异6-7。本研究立足铁皮石斛工厂化育苗，研究了 2种铁皮石斛拟原球茎诱导路径（即茎段直接诱导、通过侧芽途径诱导）的诱导效率，筛选出适合铁皮石斛拟原球茎（PLBS）诱导的培养基，以期诱导出大量优质的拟原球茎，缩短诱导时间，从而减少培养转接次数和投入成本，缩短铁皮石斛成苗周期，以达到提高铁皮石斛生产效率的目的；同时，为高效的工厂化育苗提供可行技术路线和理论参考。1 材料与方法 1.1 材料 铁皮石斛来自云南青谷生物科技有限公司生产培养室，是标签为 TPM;K08 的生长健壮的瓶苗，种源为云南省文山壮族苗族自治州广南县基地栽培品种。1.2 方法 1.2.1 外植体的选择 挑选健康、无污染、长势正常、苗龄为 3 个月的铁皮石斛苗，在无菌超净台内，用镊子取出无菌苗，放入盘子内；切掉基部的茎段，去掉无菌苗的叶鞘和顶端，得到干净的茎段，作为外植体备用。1.2.2 培养基配置 按照不同试验处理配置培养基，选用干净带盖的广口瓶，每瓶灌装 50 mL，培养基 pH 为（5.80.1）；分装后高压灭菌，温度保持在（1221），灭菌 30 min 后取出，放入预培养室培养 57 d 后，挑出合格的培养基备用；按照试验处理每瓶接种 2 个茎段，接种后置于光照强度 2 500 lx、湿度 30%、温度（232）的条件下培养，培养过程中记录培养室温湿度变化和培养情况，筛选出适合拟原球茎诱导的培养基。1.2.3 试验处理 设置 2 个试验组：第一组试验（A），以 1/2 MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖 30 g/L+水解酪蛋白 1 g/L+土豆 50 g/L+卡拉胶 9.4 g/L 为对照组，保持蔗糖和卡拉胶含量不变，分别以 MS、1/2 MS、KC 培养基为基础培养基，添加不同浓度的 6-BA、NAA、TDZ 和水解酪蛋白，共设置 6 个处理，见表 1。将接种好的瓶苗置于设定培养条件下培养，培养过程中进行不断的观察、记录原球茎诱导情况和周期。表 1 第一组试验（A）设计 处理组 培养基 6-BA/(mgL1)NAA/(mgL1)TDZ/(mgL1)白糖/(gL1)香蕉/(gL1)卡拉胶/(gL1)水解酪蛋白/(gL1)土豆/(gL1)A1 MS 2.0 0.20/30 100 9.4/A2 MS 2.0 0.50/30 100 9.4/A3 1/2 MS 1.0 0.10 0.1 30/9.4 1/A4 1/2 MS 0.5 0.05 0.1 30/9.4 1/A5 KC 0.8 0.50/30/9.4/A6 KC 0.5 0.50/30/9.4/CK 1/2 MS 1.0 0.30/30/9.4 1 50 注：“/”表示未添加。张玉蓉 等 铁皮石斛拟原球茎的诱导 -27-第二组试验（B），以 1/2 MS+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+1 g/L 水解酪蛋白+50 g/L 土豆+9.4 g/L 卡拉胶为对照组，以 1/2 MS培养基为基础培养基，保持蔗糖、水解酪蛋白和卡拉胶含量不变，添加不同浓度的 6-BA、NAA和 TDZ，共设置 7 个处理，见表 2。将接种好的瓶苗置于设定培养条件下培养，培养 45 d 后，将茎段上长出的侧芽切下转接到同一培养基中，置于设定培养条件下继续培养，培养过程中观察、记录原球茎诱导情况和周期。1.2.4 数据统计 诱导率=诱导产生原球茎数接种总数 100%。试验所得数据均采用 Excel、SPSS 软件进行处理分析，差异显著性检验用 LSD 法。表 2 第二组试验（B）设计 处理组 培养基 6-BA/(mgL1)NAA/(mgL1)TDZ/(mgL1)白糖/(gL1)卡拉胶/(gL1)水解酪蛋白/(gL1)土豆/(gL1)B1 1/2 MS 1.5 0.50/30 9.4 1/B2 1/2 MS 1.0 0.30/30 9.4 1/B3 1/2 MS 2.0 0.10/30 9.4 1/B4 1/2 MS 2.5 0.10/30 9.4 1/B5 1/2 MS 2.0 0.20 0.1 30 9.4 1/B6 1/2 MS 1.0 0.10 0.1 30 9.4 1/B7 1/2 MS 0.5 0.05 0.1 30 9.4 1/CK 1/2 MS 1.0 0.30/30 9.4 1 50 2 结果与分析 2.1 第一组试验结果 第一组试验在茎段接种培养 30 d 后逐渐开始长出叶片；60 d 后，接种茎段均已萌发出侧芽；90 d 后，A3 和 A4 两个处理诱导出了原球茎，其他处理经过培养仅萌发出侧芽（图 1）；A3 和 A4处理诱导的原球茎均呈绿色，较饱满，有明显圆锥状芽，仅有个体的差异。由表 3 可知，以 1/2 MS为基础培养基，添加 6-BA、NAA、TDZ 和水解 酪蛋白的培养基能够诱导出性状较好的原球茎，而试验组的其他处理均没有诱导出原球茎，这与涂红艳7研究结论（激素 TDZ 对拟原球茎的诱导有明显的促进作用）一致。此外，本次试验组中，处理 A3 和 A4 的拟原球茎都是从老茎段最底部切口诱导出，而新鲜的幼嫩部分的茎段均没有产生拟原球茎组织。由此可见，成熟茎段基部相比于幼嫩茎段部分更容易直接诱导出拟原球茎。图 1 第一试验组（A）培养 90 d 后茎段生长形态 2023 年 7 月 热带农业科学 第 43 卷第 7 期 -28-表 3 不同培养基对铁皮石斛茎段诱导原球茎的影响 处理 接种茎段数/个 诱导数/个 原球茎生长情况 诱导率/%A1 40 0 0 A2 40 0 0 A3 40 34 绿色，个体中等，较饱满，有明显圆锥状芽 85 A4 40 31 绿色，个体较小，较饱满，有明显圆锥状芽 77.5 A5 40 0 0 A6 40 0 0 CK 40 0 0 注：“”表示未诱导出原球茎。2.2 第二组试验结果 第二组试验在茎段转接培养 45 d 后，部分茎段逐渐开始长出侧芽，将长出的侧芽切下接入培养基中，30 d 后侧芽诱导出拟原球茎，所有处理均诱导出了原球茎，但原球茎的性状品质层次不一（图 2）。由表 4 可知，以 1/2 MS 培养基为基础培养基，保持蔗糖、水解酪蛋白、卡拉胶的浓度不变，添加 1.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA 的处理诱导率最高，达到 75%，并且原球茎呈绿色，个体中等，形态饱满，并且有明显的圆锥状芽；其次为添加 1.0 mg/L 6-BA、0.3 mg/L NAA 的培养基，诱导率为 67.5%，但是原球茎个体小，且较不饱满。经观察发现，本组试验中，不同的侧芽状态对拟原球茎的诱导有一定的影响，其中基 图 2 第二试验组（B）培养 75 d 后拟原球茎生长形态 表 4 不同激素浓度对铁皮石斛茎段诱导原球茎的影响 处理 接种侧芽数/个 诱导数/个 原球茎生长情况 诱导率/%B1 40 30 绿色，个体中等，饱满，有明显圆锥状芽 75.0 B2 40 27 浅绿色，个体小，较不饱满，有明显圆锥状芽 67.5 B3 40 21 绿色，个体中等，较饱满，有不明显圆锥状芽 52.5 B4 40 20 绿色，个体较小，不饱满，有明显白化现象 50.0 B5 40 19 绿色，个体小，较不饱满，有明显圆锥状芽 47.5 B6 40 22 浅绿色，个体中等，较饱满，有明显圆锥状芽 55.0 B7 40 20 浅绿色，个体较小，较饱满，有明显圆锥状芽 50.0 CK 40 16 绿色，个体较小，较饱满，有明显圆锥状芽 40.0 张玉蓉 等 铁皮石斛拟原球茎的诱导 -29-部膨大、形似圆锥体的侧芽较容易诱导出拟原球茎，而细瘦匀称的侧芽诱导出拟原球茎数量较少，有些侧芽甚至直接发育成苗。3 讨论与结论 从本研究可以看出，在培养过程中，培养基和激素均会对植株产生显著的影响。植物生长调节剂被广泛应用于植物无性系种苗的培育和快繁技术体系研究，其中生长素 NAA 和细胞分裂素6-BA 对原球茎的诱导有较大的影响，水解酪蛋白作为多种氨基酸的复合物，在拟原球茎的诱导过程中具有良好的促进作用，这与前人8-11报道一致；铁皮石斛在不同生长时期对营养以及生理需求不同，对不同培养基、添加剂以及不同浓度的激素表现出的生长效应不同，铁皮石斛在种子萌发3和原球茎诱导阶段，对外界营养物质的需求较少。本研究中，在盐浓度较低的 1/2 MS 培养基中，能够诱导出原球茎，而在 KC 和 MS 培养基中均没有诱导出原球茎，由此可看出，相对较低浓度的无机盐浓度对种子萌发和原球茎的诱导有利，这与邱诗春等3、张启香等9、卢莉等12、黄楚燕等13和黄艳艳等14的研究结论一致。使用低浓度盐离子的培养基，是考虑到使用茎段生长出的侧芽进行拟原球茎诱导时嫩芽易受盐害的问题，同时也表明了在诱导初级阶段拟原球茎诱导对盐离子浓度和营养的需求均较低。而宋顺等11和熊文皙等15研究表明，以 MS 培养基为基础培养基最适合滇金石斛和铁皮石斛原球茎的诱导；王将等16研究则表明，以 N6 为基础培养基的液体培养最适合金钗石斛原球茎的诱导，由于品种不同以及所选用的外植体存在差异，最适诱导培养基有所不同。此外，宋顺等11仅探讨了以 MS 培养基为基础培养基，添加不同浓度的激素对铁皮石斛原球茎诱导的影响，并未对不同基础培养基进行对比和研究。本研究中，第一试验组的培养基设置参考了谢恩耀等8、张启香等9、张爱香等5对铁皮石斛、春石斛兰拟原球茎诱导的研究；第二试验组的步骤是参考张爱香等5通过诱导拟原球茎再生春石斛兰的方法，先由茎段诱导出侧芽，然后切下侧芽，以侧芽作为诱导拟原球茎的外植体进行拟原球茎的诱导。本研究在前人研究的基础上，综合 生产实际情况和应用，筛选出 2 个比较适合铁皮石斛茎段诱导拟原球茎的培养基，分别为 1/2 MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖+1 g/L水解酪蛋白+9.4 g/L卡拉胶和1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+1 g/L水解酪蛋白+9.4 g/L 卡拉胶，诱导拟原球茎周期分别为 90 和 75 d，利用侧芽诱导拟原球茎比茎段诱导拟原球茎节省时间，而在同样的培养基中，茎段诱导拟原球茎比侧芽诱导拟原球茎的诱导率更高。目前，对于铁皮石斛或者石斛属植物的拟原球茎诱导、增殖、分化培养的研究已经有较大的进展，针对不同外植体，包括种子、茎段、叶片、芽、无菌苗茎段等，选出的最佳培养基中，基本培养基包括了 MS 培养基、KC 培养基、1/2 MS培养基，添加的激素包括 6-BA、NAA、KT、TDZ、2,4-D 等，但是研究均在实验条件下完成，以诱导率、增殖率、原球茎有效成分含量等作为指标，并没有实际进入生产应用。本研究立足于工厂化育苗，以提升铁皮石斛种苗产量为目的，筛选了可应用于实际生产的能够诱导铁皮石斛拟原球茎的培养基，后续拟进行工艺参数的优化，以期为铁皮石斛工厂化育苗提供可行的技术路线。参考文献 1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）M.北京:中国医药科技出版社,2020:295.2 黄媛.铁皮石斛组织培养技术及标准化生产规程研究D.杨凌:西北农林科技大学,2016.3 邱诗春,张世平,冯山柴,等.铁皮石斛种子快繁培养体系的优化J.江苏农业科学,2021,49(3):58-61.4 宋顺,许奕,李敬阳,等.铁皮石斛的组织培养与快速繁殖研究进展J.中国农学通报,2013,29(33):286-290.5 张爱香,常美花,刘会清,等.通过拟原球茎发生途径建立春石斛兰的组织培养体系J.北方园艺,2009(7):120-122.6 陈青青,王丛巧,赖钟雄.温差对铁皮石斛原球茎生长及药用成分的影响J.园艺与种苗,2022,42(2):20-23.7 涂红艳.细茎石斛的组织培养和提高拟原球茎有效成份含量的研究D.广东:华南师范大学,2003:25-27.8 谢恩耀,金琎.铁皮石斛组培工艺与优化J.农业技术与装备,2020,372(12):13-15+17.9 张启香,付素静,方炎明,等.铁皮石斛拟原球茎的发生过程J.浙江林学院学报,2009,26(3):444-448.10 任海虹,王景雪,聂菁.铁皮石斛原球茎高效再生体系的2023 年 7 月 热带农业科学 第 43 卷第 7 期 -30-研究J.中草药,2017,48(19):4 057-4 061.11 宋顺,许奕,王必尊,等.不同培养基成分对铁皮石斛组织培养的影响J.中国农学通报,2013,29(13):133-139.12 卢莉,刘晓芳,Saad Abdelrahman,等.铁皮石斛高效快速繁殖体系研究J.山西农业科学,2018,46(6):885-888+909.13 黄楚燕,梁宏宇.铁皮石斛茎段原球茎的诱导增殖与分化J.世界中医药,2022,17(19):2 723-2 727.14 黄艳艳,仉劲,付均惠,等.铁皮石斛人工繁育技术J.北方园艺,2021(2):115-123.15 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