桑树磷脂酶MaPLA1-2D亚型4个基因的克隆与胁迫应答分析.pdf

西北植物学报,2 0 2 3,4 3(7):1 1 0 7-1 1 1 6A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.0 7.1 1 0 7 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 3-0 4-1 3;修改稿收到日期:2 0 2 3-0 5-1 1基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(2 0 2 2 J M-1 2 1)作者简介:郝博文(2 0 0 2-),女,在读本科生,主要从事生物科学研究。E-m a i l:h b wn w a f u.e d u.c n*通信作者:张敏娟,博士,讲师,主要从事桑树逆境生理研究。E-m a i l:m j z h a n g 1 0 0 8n w s u a f.e d u.c n桑树磷脂酶M a P L A 1-2 D亚型4个基因的克隆与胁迫应答分析郝博文1,李瑞卿1,夏 宇1,尚姝婷2,李文强1,张敏娟2*(1 西北农林科技大学 生命科学学院,陕西杨凌 7 1 2 1 0 0;2 西北农林科技大学 动物科技学院,陕西杨凌 7 1 2 1 0 0)摘 要:磷脂酶(p h o s p h o l i p a s e)是一类在植物生长发育和胁迫应答中起重要调控作用的磷脂水解酶,也是一类重要的信号转导酶。而磷脂酶A 1(P L A 1)在植物应答生物胁迫和非生物胁迫中的功能研究鲜见报道。研究从桑树(M o r u s a l b a L.)中克隆了磷脂酶P L A 1的1个亚型M a P L A 1-2 D基因,对其进行了序列分析、组织表达、胁迫诱导表达和蛋白亚细胞定位分析。结果表明,桑树P L A 1-2 D亚型基因包括4个成员,命名为M a P L A 1-2 D.1M a P-L A 1-2 D.4。4个基因在桑树根和叶中高水平表达,蛋白亚细胞定位在叶绿体。序列和进化分析表明M a P L A 1-2 D基因4个成员与拟南芥A t D AD 1基因的保守结构域序列具有较高相似度且进化关系紧密。M a P L A 1-2 D基因4个成员的启动子含有多种胁迫应答顺式元件和激素响应元件;胁迫诱导表达模式分析表明M a P L A 1-2 D基因表达受干旱和脱落酸处理显著诱导。以上结果说明,M a P L A 1-2 D基因与拟南芥D A D同源,可能在桑树非生物胁迫应答中发挥重要功能。关键词:桑树;磷脂酶A 1;M a P L A 1-2 D;基因克隆;表达分析;非生物胁迫中图分类号:S 8 8 8.2文献标志码:AG e n e C l o n i n g a n d S t r e s s R e s p o n s i v e A n a l y s i s o f P h o s p h o l i p a s e A 1-2 D i n M u l b e r r y(M o r u s a l b a L.)HAO B o w e n1,L I R u i q i n g1,X I A Y u1,S HANG S h u t i n g2,L I W e n q i a n g1,Z HANG M i n j u a n2*(1 C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,Y a n g l i n g,S h a a n x i 7 1 2 1 0 0,C h i n a;2 C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,Y a n g l i n g,S h a a n x i 7 1 2 1 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:P h o s p h o l i p a s e i s a c l a s s o f p h o s p h o l i p a s e h y d r o l a s e s a n d s i g n a l t r a n s d u c e r s t h a t p l a y a n i m p o r-t a n t r o l e i n r e g u l a t i n g p l a n t g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t a n d s t r e s s r e s p o n s e.H o w e v e r,t h e f u n c t i o n o f p h o s-p h o l i p a s e A 1(P L A 1)i n p l a n t r e s p o n s e t o b i o l o g i c a l a n d a b i o t i c s t r e s s e s i s r a r e l y r e p o r t e d.I n t h i s s t u d y,a s u b t y p e o f p h o s p h o l i p a s e P L A 1,M a P L A 1-2 D w a s c l o n e d i n m u l b e r r y,a n d t h e s e q u e n c e f e a t u r e,t i s s u e e x p r e s s i o n,s t r e s s-i n d u c e d e x p r e s s i o n o f M a P L A 1-2 D,a n d s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f t h e p r o t e i n w e r e a n-a l y z e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t M a P L A 1-2 D c o n t a i n s 4 i s o f o r m s,n a m e d M a P L A 1-2 D.1-M a P L A 1-2 D.4.T h e f o u r g e n e s w e r e h i g h l y e x p r e s s e d i n t h e r o o t s a n d l e a v e s o f m u l b e r r y,a n d t h e p r o t e i n s w e r e m a i n l y l o c a l i z e d i n c h l o r o p l a s t s.T h e M a P L A 1-2 D m e m b e r s h a d h i g h s e q u e n c e s i m i l a r i t y a n d c l o s e e v o l u-t i o n a r y r e l a t i o n s h i p w i t h A r a b i d o p s i s A t DAD 1 i n t h e c o n s e r v e d d o m a i n.I t w a s s h o w e d t h a t t h e p r o m o t e r s o f t h e f o u r M a P L A 1-2 D g e n e s c o n t a i n e d a v a r i e t y o f s t r e s s-r e s p o n s i v e c i s-e l e m e n t s a n d h o r m o n e r e s p o n-s i v e e l e m e n t s,a n d t h e g e n e e x p r e s s i o n s o f M a P L A 1-2 D w e r e s i g n i f i c a n t l y i n d u c e d b y d r o u g h t s t r e s s a n d a b s c i s i c a c i d(A B A)t r e a t m e n t s.T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t M a P L A 1-2 D g e n e s a r e h o m o l o g o u s t o A r a b i-d o p s i s D A D,w h i c h m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n a b i o t i c s t r e s s r e s p o n s e o f m u l b e r r y.K e y w o r d s:M o r u s a l b a L.;p h o s p h o l i p a s e A 1;M a P L A 1-2 D;g e n e c l o n i n g;e x p r e s s i o n a n a l y s e s;a b i o t i c s t r e s s e s 磷脂酶(p h o s p h o l i p a s e s)是一类能够水解磷脂的酶类,根据其水解磷脂位点的不同可将其分为磷脂酶A 1(p h o s p h o l i p a s e s A 1,P L A l)、磷 脂 酶A 2(P L A 2)、磷脂酶C(P L C)和磷脂酶D(P L D),它们特异地作用于磷脂分子内部的各个酯键,形成不同的产物1。磷脂酶A 2大量存在于动物胰脏和植物组织中,催化水解磷脂的s n-2位酰基,磷脂酶A 1广泛分布在动物细胞的溶酶体内,此外蛇毒及某些微生物中亦有,催化水解膜磷脂s n-1酰基,二者催化磷脂水解产生游离脂肪酸和溶血磷脂2。大量研究表明,P L C和P L D在植物生长发育、生物胁迫及非生物胁迫中起重要的调控作用3-4。截至目前,有关植物磷脂酶A 1的研究较为缺乏,已有报道集中在植物P L A 1基因家族的序列分析和表达分析上,如亚麻芥(C a m e l i n a s a t i v a)5、玉米(Z e a m a y s)6、油菜(B r a s s i c a n a p u s)7、百合(L i l i u m b r o w n i i)8、水稻(O r y z a s a t i v a)9等。研究表明,植物花药不开裂基因(DAD 1,d e f e c-t i v e i n a n t h e r d e h i s c e n c e 1)产物具有磷脂酶A 1活性,对其功能的解析相对深入。拟南芥A t DAD基因通过参与J A合成调节花药开裂2。辣椒(C a p-s i c u m f r u t e s c e n s)C a P L A 1在拟南芥中促进转基因植株生长1 0。麻疯树(J a t r o p h a c u r c a s)J c DAD 1通过参与J A合成途径调节花和果实的发育1 1。因此,充分了解各磷脂酶的生化特性、时空表达关系以及脂质分子之间的转化关系将有利于深入解析植物磷脂酶的生物学功能,并促进磷脂酶基因在植物育种中的应用。桑树(M o r u s a l b a L.)属桑科桑属,自然类型多、分布区域广泛、在中国栽培历史悠久。桑树具有抗寒、抗旱、耐水湿特性,其果实、叶片、根等部分可食用、药用、饲 用、观 赏 用,兼 具 经 济 效 益 和 生 态价值1 2-1 4。近年来,桑树作为修复植物已广泛用于脆弱环境的生态治理1 5-1 7。本研究克隆桑树磷脂酶A 1-2 D亚家族基因,分析其亚细胞定位、时空表达及胁迫诱导表达模式,以进一步深入解析磷脂酶的生物学功能,促进磷脂酶基因在植物育种中的应用。1 材料与方法1.1 试验材料及干旱胁迫处理方法成龄桑树 红果2号 在周至桑树种质资源圃种植;本氏烟草和桑树幼苗在本实验室种植。选取生长健壮、长势一致的4 0 d苗龄桑树幼苗,进行干旱胁迫实验,每个处理3株幼苗,干旱处理:桑树幼苗浇透水后断水模拟土壤自然干旱过程,对照组正常浇水。用土壤水分测量仪(T R I M E-P I C O 6 4/3 2 T D R,北京易科泰生态技术有限公司)测定土壤水分,从而评估土壤干旱程度。当土壤含水量为0时,即视为干旱胁迫第1天,于处理第4天取样。脱落酸(A B A)处理:以5 m L 0.1 mm o l/L A B A溶液喷施幼苗,处理2 4 h后取样;高盐胁迫:采用1 0 0 m L 3 0 0 mm o l/L N a C l溶液浇灌处理盆栽幼苗,处理第3天取样;低温胁迫:将幼苗置于4 条件下处理2 4 h后取样。以上处理结束后,采集第三叶位(自上而下)叶片,经液氮速冻后转移至-8 0 冰箱保存备用。1.2 目的基因R T-P C R扩增及克隆从N C B I基因组数据库获得桑树磷脂酶基因序列和氨基酸序列,并用在线软件C o n s e r v e d D o m a i n S e a r c h S e r v i c e(h t t p s:/w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c t u r e/c d d/w r p s b.c g i)分析候选序列的磷脂酶结构域。以桑树 红果2号 叶片为材料,参照试剂盒说明书提取总R NA(M i n i B E S T U n i v e r s a l R NA E x-t r a c t i o n K i t,T a K a R a)并反转录成c D NA(P r i m e-S c r i p tTM R T r e a g e n t K i t,T a K a R a)。以c D NA作为模板扩增目的基因,引物序列见表1。表1 M a P L A 1-2 D基因克隆所用引物序列T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e s f o r g e n e c l o n i n g o f M a P L A 1-2 D引物名称P r i m e r n a m e 引物序列P r i m e r s e q u e n c e(5 3)引物长度P r i m e r l e n g t h/b pM a P L A 1-2 D.1-FT C TA GAA T G G GA G G G C C T T C T2 1M a P L A 1-2 D.1-RG G TA C C G T T T C GA T C A G C G C2 0M a P L A 1-2 D.2-FT C TA GAA T G T C T G C GA C C G C A2 1M a P L A 1-2 D.2-RG G TA C C TA G G GA GA T C T T C A G C A T2 4M a P L A 1-2 D.3-FT C T A G A A T G G A G A C A A A C A C C A A C A A T2 7M a P L A 1-2 D.3-RG G TA C C G T T T G G T T T C G G GA G TA T2 4M a P L A 1-2 D.4-FT C TA GAA T GA C GA C C A C G C AA T C2 3M a P L A 1-2 D.4-RG G TA C C AAA C T C A G G GA C A G G C2 28011西 北 植 物 学 报 4 3卷 P C R反应程序为9 4 预变性1 0 m i n;9 4 变性3 0 s;5 5 退火4 5 s;7 2 延伸1 m i n,3 5个循环;7 2 反应1 0 m i n。P C R产物用1%琼脂糖凝胶电泳(1 3 0 V,2 0 0 mA)检测,回收目的D NA片段并克隆至p MD 1 8-T载体(T a K a R a,D a l i a n),转化大肠杆菌DH 5 后进行测序验证。1.3 生物信息学分析蛋白分子量、等电点(p I)等蛋白质理化性质预测采用E x P a s y数据库(h t t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t-p a r a m/);氨基酸序列比对分析使用在线软件P R A-L I N E(h t t p s:/w w w.i b i.v u.n l/p r o g r a m s/p r a l i n e w-w w/);保 守 结 构 域 分 析 使 用C o n s e r v e d D o m a i n S e a r c h S e r v i c e数据库(h t t p s:/w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c t u r e/c d d/w r p s b.c g i);基因 结构分析 使 用G e n e S t r u c t u r e D i s p l a y S e r v e r 2.0软件(h t t p:/g s d s.c b i.p k u.e d u.c n/);系统进化树构建利用软件M E G A 7.0,采用邻接法(N e i g h b o r-J o i n i n g);启动子分析用P l a n t c a r e数 据 库(h t t p:/b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t m l/);蛋白信号肽和跨膜区预测 利 用S i g n a l P-5.0(h t t p s:/s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/S i g n a l P-5.0/)和TMHMM(h t t p s:/s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/TMHMM-2.0/)。1.4 蛋白亚细胞定位回收4个M a P L A 1-2 D基因序列的双酶切目的 基 因 片 段 和 表 达 载 体p 3 5 S-G F P(p C AM I-B A 1 3 0 1骨架)进行连接后获得p 3 5 SM a P L A 1-2 D s-G F P融合表达载体,电击法转化重组质粒至农杆菌GV 3 1 0 1后作为蛋白亚细胞定位载体;分别将含有空载p 3 5 S-G F P和p 3 5 SM a P L A 1-2 D s-G F P重组质粒的农杆菌在Y E P培养基中培养至D6 0 0为1.0,然后注射本氏烟草叶片(2 0 d苗龄),每株注射23片,3个重复。暗培养1 d后正常光照培养2 d,然后取叶片下表皮在激光共聚焦显微镜(S T 8,L e c i a)下观察G F P荧光信号。1.5 q R T-P C R基因表达根据 桑 树4个M a P L A1-2D基 因 序 列 设 计q R T-P C R引物(表2),利用实时荧光定量R T-P C R检测4个M a P L A 1-2 D基因在桑树不同组织或各种非生物胁迫下的基因表达量。荧光定量P C R使用B i o-R a d C F X 9 6 T o u c h荧光定量P C R仪,q R T-P C R反应体系和扩增程序按照P r i m e S c r i p tTM R T r e a g e n t K i t(T a k a r a)试剂盒说明书操作,每个基因设置3个生物学重复和3个技术重复,以桑树A c t i n基因为内参,采用2-CT法分析基因相对表达量。表2 q R T-P C R引物序列T a b l e 2 P r i m e r s e q u e n c e s o f q R T-P C R引物名称P r i m e r n a m e引物序列P r i m e r s e q u e n c e(5 3)引物长度P r i m e r l e n g t h/b pM a A c t i n-FGA G C AA G GA GA T C A C A G C C C2 0M a A c t i n-RC C A GA C T C G T C G TA C T C G C1 9q R T-M a P L A1-2 D.1-FT G C C A T C C A G GAA C T GAA G C2 0q R T-M a P L A1-2 D.1-RG A G G G G G A A A C A A G A C A T A A G G2 2q R T-M a P L A1-2 D.2-FT G T G G T C G C A G G G T G GAA C1 9q R T-M a P L A1-2 D.2-RC AAA C T C A G G GA C A G G C AAA T2 1q R T-M a P L A1-2 D.3-FC G T G A G A A A G C A A C T A C A C A A T G2 3q R T-M a P L A1-2 D.3-RG C T GAAAA C GA T G G C T GA GA C2 1q R T-M a P L A1-2 D.4-FG G G G C T G G C T TA C TA T T TA C A C2 3q R T-M a P L A1-2 D.4-RT T C C T C G T T C C C TA C T T G C G2 02 结果与分析2.1 M a P L A 1-2 D基因克隆与序列分析以植物P L A 1典型结构域序列搜索桑树基因组数据库(N C B I:t x i d 9 8 1 0 8 5)获得M a P L A 1-2 D基因序列,设计引物(表1)进行P C R扩增,得到4个M a P L A 1-2 D基因(图1,A),命名为M a P L A 1-2 D.1M a P L A 1-2 D.4,其编码蛋白介于3 9 94 4 3个氨基酸,蛋白质分子量介于4 55 0 k D。M a P L A 1-2 D.1蛋白等电点为8.8 1,M a P L A 1-2 D.24等电点分别为5.6 2、5.9 5和5.3 8,均为不稳定蛋白和亲水蛋白(表3),且4个M a P L A 1-2 D蛋白序列中均不含有信号肽和跨膜区。基因结构分析显示,M a P L A 1-2 D.3基因序列有2个内含子,其余3个成员基因序列中均没有内含子序列(图1,B)。蛋白保守结构域分析表明M a-P L A 1-2 D 4个成员蛋白质序列都含有三酰甘油脂酶结构域(P L N 0 2 4 5 4)。蛋白质多序列比对结果表明,M a P L A 1-2 D 4个成员与拟南芥A t D A D 1和水稻O s D A D 1具有相似性,且均含有酯酶盒GH S L G结构域(图1,C)。序列进化分析表明,M a P L A 1-2 D 4个成员明显聚类在一起(图1 D),表明其进化关系非常密切;M a P L A 1-2 D与 拟 南 芥A t p P L A 1-2 D和A t D A D 1以及水稻O s D A D 1位于不同分支(图1,D),表明木本植物桑树和拟南芥、水稻的磷脂酶A 1在序列上有明显的分化。90117期 郝博文,等:桑树磷脂酶M a P L A 1-2 D亚型4个基因的克隆与胁迫应答分析A.桑树M a P L A 1-2 D.1/2/3/4基因的P C R克隆,M.D L 2 0 0 0;泳道14分别为M a P L A 1-2 D.1/2/3/4基因P C R产物;B.桑树M a P L A 1-2 D.1/2/3/4基因结构分析;C.M a P L A 1-2 D.1/2/3/4基因与拟南芥A t D AD 1、水稻O s D AD 1氨基酸序列比对,以方框标示酯酶盒基序GH S L G;D.M a P L A 1-2 D.1/2/3/4基因进化分析。图1 M a P L A 1-2 D.1/2/3/4基因克隆及序列分析A.P C R c l o n i n g o f M a P L A 1-2 D.1/2/3/4.M.D L 2 0 0 0;L a n e s 1-4 a r e t h e P C R p r o d u c t s o f M a P L A 1-2 D.1/2/3/4,r e s p e c t i v e l y;B.G e n e s t r u c t u r e a n a l y s i s o f M a P L A 1-2 D.1/2/3/4 g e n e s;C.A l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f M a P L A 1-2 D.1/2/3/4 a n d A t D AD 1 a n d O s D AD 1,b o x i n d i c a t e m o t i f GH S L G;D.P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f M a P L A 1-2 D.1/2/3/4.F i g.1 M a P L A 1-2 D.1/2/3/4 g e n e c l o n i n g a n d s e q u e n c e a n a l y s i s表3 桑树M a P L A 1-2 D蛋白理化性质T a b l e 3 P h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f M a P L A 1-2 D p r o t e i n s基因名称G e n e n a m e编码氨基酸数目N u m b e r o f a m i n o a c i d s分子量M o l e c u l a r w e i g h t等电点p I不稳定指数I n s t a b i l i t y i n d e x脂肪族氨基酸指数A l i p h a t i c i n d e x亲水性平均系数G r a n d a v e r a g e o f h y d r o p a t h i c i t y(G R AVY)M a P L A 1-2 D.13 9 94 5 2 0 98.8 14 4.5 57 5.2 4-0.5 8 3M a P L A 1-2 D.24 3 24 8 5 5 15.6 23 0.0 08 2.5 9-0.3 2 6M a P L A 1-2 D.34 4 35 0 4 0 95.9 54 4.8 28 8.8 3-0.3 8 1M a P L A 1-2 D.44 0 04 5 1 2 65.3 84 4.0 08 5.2 7-0.2 9 32.2 M a P L A 1-2 D基因启动子区功能元件分析以M a P L A 1-2 D基因4个成员的核酸序列搜索桑树基因组数据库,找到每个基因编码区所在的川桑基因组序列叠连群c o n t i g,获取起始密码子上游2 5 0 0 b p的核酸序列用于下一步元件分析。经P l a n t c a r e数 据 库 分 析M a P L A 1-2 D基 因 上 游2 5 0 0 b p D NA序列,结果表明M a P L A 1-2 D基因4个成员的启动子区含有多种生物胁迫和非生物胁迫响应相关顺式作用元件,如低温响应元件L T R、防御及胁迫响应元件(T C-r i c h r e p e a t s)、厌氧诱导元件A R E等(表4)。如表4所示,除M a P L A 1-2 D.3外,另外几个成员 的 基 因 启 动 子 区 均 含 有 干 旱 诱 导 响 应 元 件(MB S);各成员的启动子区均含有激素响应元件,如脱落酸响应元件(A B A r e s p o n s i v e e l e m e n t)、水杨酸应答元件(S A r e s p o n s i v e e l e m e n t)、茉莉酸响应元件(M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n t);M a P L A 1-2 D.2和M a P L A 1-2 D.4基因启动子还含有赤霉素应0111西 北 植 物 学 报 4 3卷答元件(GA r e s p o n s i v e e l e m e n t),M a P L A 1-2 D.1/3基因启动子还含有乙烯应答元件(E t h y l e n e r e-s p o n s i v e e l e m e n t,E R E),M a P L A 1-2 D.1基因启动子含有生长素应答元件T GA-e l e m e n t。表4 M a P L A 1-2 D基因启动子区序列顺式作用元件分布T a b l e 4 D i s t r i b u t i o n o f c i s-a c t i n g e l e m e n t s i n M a P L A 1-2 D g e n e p r o m o t e r r e g i o n s e q u e n c e s基因名称G e n e n a m e元件名称E l e m e n t元件基序E l e m e n t m o t i f起始位置S t a r t i n g p o s i t i o n终止位置T e r m i n a t i o n p o s i t i o n元件类型E l e m e n t t y p eM a P L A 1-2 D 1T C-r i c h r e p e a t sG T T T T C T T A C6 2 59D e f e n s e a n d s t r e s s r e s p o n s i v e n e s sT C-r i c h r e p e a t sG T T T T C T T A C1 3 3 59D e f e n s e a n d s t r e s s r e s p o n s i v e n e s sD R E c o r eG C C GA C1 1 9 46E l e m e n t s p e c i f i c a l l y b i n d s D R E BL T RC C GAAA1 2 1 26L o w-t e m p e r a t u r e r e s p o n s i v e e l e m e n tA B R EA C G T G2 4 55A B A r e s p o n s i v e e l e m e n tA B R EA C G T G9 1 35A B A r e s p o n s i v e e l e m e n tA B R EA C G T G9 8 05A B A r e s p o n s i v e e l e m e n tA B R ET A C G G T C2 2 2 57A B A r e s p o n s i v e e l e m e n tE R EA T T T T AAA7 28E t h y l e n e r e s p o n s i v e e l e m e n tE R EA T T T T AAA8 48E t h y l e n e r e s p o n s i v e e l e m e n tE R EA T T T T AAA1 4 48E t h y l e n e r e s p o n s i v e e l e m e n tE R EA T T T T AAA1 4 68E t h y l e n e r e s p o n s i v e e l e m e n ta s-1T GA C G2 4 35S A r e s p o n s i v e e l e m e n ta s-1T GA C G9 0 45S A r e s p o n s i v e e l e m e n ta s-1T GA C G9 8 25S A r e s p o n s i v e e l e m e n ta s-1T GA C G1 0 4 95S A r e s p o n s i v e e l e m e n ta s-1T GA C G1 1 8 25S A r e s p o n s i v e e l e m e n ta s-1T GA C G1 1 8 55S A r e s p o n s i v e e l e m e n tT C A-e l e m e n tC C A T C T T T T T1 3 5 49S A r e s p o n s i v e e l e m e n tT C A-e l e m e n tC C A T C T T T T T1 8 9 59S A r e s p o n s i v e e l e m e n tC G T C A-m o t i fC G T C A2 4 35M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tC G T C A-m o t i fC G T C A9 0 45M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tC G T C A-m o t i fC G T C A9 8 25M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tC G T C A-m o t i fC G T C A1 0 4 95M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tC G T C A-m o t i fC G T C A1 1 8 25M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tC G T C A-m o t i fC G T C A1 1 8 55M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tT GA C G-m o t i fT GA C G2 4 35M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tT GA C G-m o t i fT GA C G9 0 45M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tT GA C G-m o t i fT GA C G9 8 25M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tT GA C G-m o t i fT GA C G1 0 4 95M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tT GA C G-m o t i fT GA C G1 1 8 25M e J A r e s p o n s i v e e l e m e n tT GA C G-m