嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价.pdf

DOI:10.12131/20220266文章编号：2095 0780（2023）04 0049 09嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价林潇可1，汪玉倩2，林美珍1,3，黄东平1,3，苗宇轩1,3，林向民1,31.福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 3500022.安徽科技学院 农学院，安徽 滁州 2331003.福建农林大学/福建省农业生态过程与安全监控重点实验室，福建 福州 350002摘要：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种常见的水产致病菌，可引发人畜鱼共患疾病，对水产养殖业造成严重危害，因此预防其传播和感染是当前亟待解决的问题。为开发高效的潜在亚单位疫苗，并为防治嗜水气单胞菌病害提供理论依据，基于前期的研究结果，选取在嗜水气单胞菌强毒株LP-2中表达丰度较高的8种分泌蛋白(ORF0322、ORF3982、ORF2874、ORF1767、ORF3984、ORF2546、ORF0472、ORF1609)作为研究目标，首先利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对其进行基因表达检测，结果发现这8种分泌蛋白在细胞中均可正常表达；然后将这些蛋白进行基因克隆与表达纯化，并将纯化的重组蛋白免疫斑马鱼(Danio rerio)，连续培养28 d后，发现斑马鱼中相关免疫基因均发生上调，说明这些分泌蛋白可引起宿主发生免疫反应；最后，对这8种分泌蛋白进行免疫保护评价，细菌攻毒实验结果显示，其中6种分泌蛋白(ORF3982、ORF2874、ORF1767、ORF3984、ORF0472、ORF1609)的相对免疫保护率(Relativeimmune protection rate,RPS)大于50%，可作为候选疫苗开发。关键词：嗜水气单胞菌；分泌蛋白；斑马鱼；疫苗；免疫保护性；蛋白重组中图分类号：S 941.42文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Immune protective efficacy of recombinant vaccine againstAeromonas hydrophila secreted proteins on zebrafishLIN Xiaoke1,WANG Yuqian2,LIN Meizhen1,3,HUANG Dongping1,3,MIAO Yuxuan1,3,LIN Xiangmin1,31.School of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China2.College of Agriculture,Anhui Science and Technology University,Chuzhou 233100,China3.Fujian Agriculture and Forestry University/Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring,Fuzhou 350002,ChinaAbstract:Aeromonas hydrophila is a prevalent aquatic pathogen that poses a risk to fishery production and can cause zoonoticdiseases.Therefore,prevention of transmission and infection of A.hydrophila is a critical issue to address.To develop a poten-tial subunit vaccine and provide a theoretical basis for better preventing and treating A.hydrophila disease,we selected eightsecreted proteins(ORF0322,ORF3982,ORF2874,ORF1767,ORF3984,ORF2546,ORF0472 and ORF1609)from an A.hydro-phila virulent strain LP-2 based on our previous research.The qPCR test shows that all selected proteins were expressed nor-mally,then they were cloned and purified.The cloned and purified recombinant proteins were administered to zebrafishthrough injection.After 28 days of immunization,qPCR analysis detects increasing expression of all relevant immune genes inthe zebrafish,suggesting that these recombinant proteins were capable of eliciting an immune response.In order to evaluate the第 19 卷第 4 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.42023 年 8 月South China Fisheries ScienceAug.，2023收稿日期：2022-10-06；修回日期：2023-02-15基金项目：福建大学校级自然科学基金(111ZC9051)作者简介：林潇可(2001)，男，本科生，研究方向为微生物分子生态学。E-mail:通信作者：林向民(1977)，男，教授，博士，研究方向为微生物分子生态学。E-mail:immune protection offered by the eight selected secreted proteins,a bacterial challenge experiment was conducted.The resultsshow that six of the secreted proteins(ORF3982,ORF2874,ORF1767,ORF3984,ORF0472,ORF1609)exhibited a relative im-mune protection rate(RPS)greater than 50%,indicating that they held promise as vaccine candidates against A.hydrophila infection.Keywords:Aeromonas hydrophila;Secreted protein;Danio rerio;Vaccine;Immunoprotection;Protein recombination嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属于革兰氏阴性菌，在自然界中分布广泛，是一种典型的人畜鱼共患病原菌1。该菌可感染多种淡水鱼类，导致细菌性败血症，被感染后的鱼类一般病势较猛，死亡率很高，严重危害渔业生产2-3。嗜水气单胞菌的致病性与其携带的多种毒力因子密切相关，而这些毒力因子往往外泌到细胞外，与分泌蛋白息息相关4。这些分泌蛋白主要包括外毒素和胞外酶，其中外毒素包括溶血素、肠毒素、细胞毒素、杀白细胞毒素等。其作用机理是通过结合红细胞膜表面的特殊糖蛋白受体，破坏细胞膜的渗透屏障作用，最终导致细胞破裂死亡，使血液处于低凝状态，表现出全身性出血的症状。胞外酶包括金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、乙酞胆碱脂酶等5。胞外酶的作用机理是损伤基质或细胞膜，增加其通透性，从而有利于细菌在宿主体内的扩散6。细菌通过分泌多种蛋白质来调节自身与宿主的相互作用，对细菌的毒力起着至关重要的作用。多项研究表明，分泌蛋白具有较好的免疫原性，可作为潜在疫苗开发。如尚玉曼等7对半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)源哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)分泌蛋白HutZ 进行研究，发现 HutZ 蛋白免疫后的半滑舌鳎抗体效价可达 1128，攻毒免疫保护率达 73.3%；陈雪等8发现罗非鱼(Oreochromis spp.)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)分泌蛋白 LrrG 的相对免疫保护率达 69.28%。然而细菌中分泌蛋白的数量庞大，目前仅部分分泌蛋白的免疫原性得到了关注9。本研究在课题组前期分泌蛋白蛋白质组学研究基础上，选取嗜水气单胞菌强毒株 LP-2 中的 8 种分泌蛋白制备亚单位疫苗，并探究其免疫原性，以期开发出高效的潜在亚单位疫苗，为更好地防治嗜水气单胞菌病害提供理论依据。1 材料与方法 1.1 实验材料斑马鱼(Danio rerio)购自福州市花鸟市场，选购标准为体长(31)cm、体质量(0.30.1)g，喂养1 周使鱼稳定，期间每天进行投喂、换水并 24 h 供氧。本实验中所用到的质粒 pET-32a(+)以及嗜水气单胞菌强毒株 LP-2 均保存于本实验室。大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞购于北京全氏金生物技术有限公司；氨苄青霉素(AMP)、酵母粉、氯化钠、胰蛋白酶胨购于生工生物工程(上海)股份有限公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自 Omega 公司；本实验所需的限制性内切酶与连接酶均购于日本 TaKaRa 公司。引物由福州擎科生物公司合成。1.2 实验方法1.2.1分泌蛋白通过实验室前期研究结果，选取 8 种分泌蛋白作为本研究的实验对象(表 1)。1.2.2qPCR 验证基因表达挑取 LP-2 单克隆至 5 mL 新鲜 LB 培养基中，30、200 rmin1培养 16 h，取出 3 mL 于 4、12 000 rmin1离心 1 min。去除上清后，加入 1 mLTrizol，涡旋振荡 15 s，室温下静置 5 min。加入0.2 mL 氯仿，振荡 15 s 后静置 3 min。于 4、12 000 rmin1 离心 10 min 后吸取上层水相转至新管中。再加入 0.5 mL 异丙醇轻轻颠倒混匀，室温下静置 10 min 后于 4、12 000 rmin1离心 10 min，吸去上清。最后用 1 mL 75%(体积分数)乙醇洗涤后于 4、7 500 rmin1 离心 5 min。吸干乙醇后在室温下干燥 10 min。随后用 100 L DEPC 水溶解提取得到的 RNA，在反转录后利用 AppliedBiosystems Quant Studio 6 Flex 实时荧光定量 PCR仪验证基因 mRNA 的表达水平10。1.2.3PCR 扩增以嗜水气单胞菌 LP-2 菌株总 DNA 组作为扩增模板，利用 Primer premier 软件对目的基因进行克隆引物的设计。PCR 反应程序为 95 3 min；95 15 s，55 15 s，72 延伸 30 skb1，循环 30 次；72 10 min。用凝胶回收试剂盒回收扩增所得目的基因产物，20 保存备用11。1.2.4构建表达质粒将用 Hind III 和 EcoR I 限制性内切酶酶切后50南 方 水 产 科 学第 19 卷的 pET-32a 和回收所得的目的基因用 T4 连接酶进行连接。将上述重组质粒转化至 E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经 1 h 活化后，将菌体涂布在含100 gmL1 AMP 的固体 LB 培养基上，37 培养12 h 后挑取单克隆菌进行 PCR 验证12。1.2.5重组菌株的表达和纯化将上述步骤中的阳性菌株转接至 5 mL 液体培养基中培养 16 h 后，再转接至含 100 gmL1 AMP的 200 mL 液体 LB 培养基中。在 200 rmin1、37 条件下培养至 OD600 nm为 0.40.6，加入1 mmolL1 IPTG，16 低温诱导 68 h。将上述菌液于 4、8 000 rmin1 离心 10 min，弃去上清液，用 10 mL 1磷酸缓冲盐溶液(PBS 缓冲液)将沉淀重悬，如此重复 3 次。用 10 mL 5 mmolL1咪唑溶液，对收集的菌体进行 30 min 的超声破碎。将破碎后的产物在 4、10 000 rmin1离心10 min 并收集上清液。将上清液与 Ni-NTA 树脂柱在 4、10 rmin1条件下结合 68 h；用不同浓度的咪唑溶液对目的蛋白进行梯度洗脱，将获得的洗脱液经 SDS-PAGE 检测，筛选出蛋白浓度高的洗脱液，于20 保存13。1.2.6蛋白免疫将培养稳定的斑马鱼随机分为 10 组，其中每组 25 尾。将上述步骤中获得的 1 gL1 的 8 种目的蛋白与对照组 PBS 及 TrxA 融合蛋白(载体融合蛋白，用于排除标签及载体自身影响)分别与弗氏不完全佐剂以 11(VV)的比例进行混合。充分乳化后对斑马鱼进行腹腔注射，每尾注射蛋白量为5 g。14 d 后进行再次免疫，步骤与第一次相同，观察 14 d 并记录结果14。1.2.7蛋白免疫后斑马鱼免疫反应检测从上述 10 组斑马鱼中随机各取 10 尾的内脏，分别于液氮中冷冻研磨后利用 Trizon 法提取RNA。具体方法见 1.2.2 qPCR 验证基因表达。使用 PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa，日本)将1 g RNA 逆转录成 cDNA，以-actin 基因作为内参，再采用 Applied Biosystems Quant Studio 6 Flex实时荧光定量 PCR 仪对表 2 中的免疫相关基因进行检测15，实验重复 3 次，引物如表 2 所示。表1 本研究中选取的分泌蛋白及引物序列Table 1 Secreted proteins and their primer pairs used in this study序号No.基因Gene蛋白质Protein核苷酸长度Nucleotide length/bp蛋白描述Protein description引物序列(53)Primer sequence(53)1orf0322ORF03221 065假定蛋白Hypothetical proteinF:GGGGAATTCATGAGGAATCAGGCTGTCATTTTGTR:CCCAAGCTTTCAGGGCCTGGTGGGGGCG2orf3982ORF3982543P型菌毛蛋白 PapAF:AAAGAATTCATGAAAGCTAACAAGAATCTGGTTGR:CCCAAGCTTTTACTCGTAGGAGAGAGTAAAGTTG3orf2874ORF28741 866溶细胞素和溶血素、溶血素、孔道形成蛋白Cytolysin and hemolysin,HlyA,Pore formingF:GGGGAATTCATGAAAAACAAAAAACCACGCAAATR:CCCAAGCTTTCAGTGACTGGCCGGTGGC4orf1767ORF17671 482假定蛋白Hypothetical proteinF:AAAGAATTCATGAAGACTTTTAAGGTTTCAATTAR:AAAAGGCTTTTAGCGGTTGACGTATTCCTCAA5orf3984ORF39842 748微生物胶原酶Microbial collagenaseF:AAAGAATTCATGAACAATCTGGGTACCAGGTTR:AAAAGGCTTTCAGTGGGAGGAGTCGTTGG6orf2546ORF2546519宿主细胞蛋白 HcpF:CCCGAATTCATGCCAACTCCATGTTATATCAGCAR:GGGAAGCTTTTACGCCTCGATCGGCGCA7orf0472ORF0472930溶血素 HemolysinF:GGGGAATTCATGTTTGGCGACAGCCTCTCCR:CCCAAGCTTTCAGTGGGCGAGGAACTCGTAT8orf1609ORF16091 875假定细胞外丝氨酸蛋白酶Putative extracellular serine proteaseF:GGGGAATTCATGAGAAAAACATCGTTAGCGTTGGR:CCCAAGCTTTCATGAGCGGGCGGCATCG表2 免疫相关基因表达的引物Table 2 Primers for expression of immune-related genes序号No.基因Gene引物序列(53)Primer sequence(53)1LyzF:GATTTGAGGGATTCTCCATTGGR:CCGTAGTCCTTCCCCGTATCA2IL1F:TGGACTTCGCAGCACAAAATGR:GTTCACTTCACGCTCTTGGATC3MHC IF:GGAGTTCACCTTGCTTATGCR:CCCTCTGACCCATTCTTGT4MHC IIF:TGACTCAACTGTCCGTGATAR:CCATTAGCCATCTCCATAGTG5IL8F:GTCGCTGCATTGAAACAGAAR:CTTAACCCATGGAGCAGACC6IL10F:TCACGTCATGAACGAGATCCR:CCTCTTGCATTTCACCATATCC7IL15F:ACAGAGGAAGAAGCCTACAGR:GCGATGAAGACGAGAAAGAC第 4 期林潇可等:嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价511.2.8斑马鱼攻毒将 LP-2 于 37、200 rmin1下活化过夜后转接至 5 mL LB 液体培养基中，培养至 OD600 nm为 1.0 时，用 1PBS 将菌液稀释至 1105 CFUmL1(25 倍斑马鱼半数致死量)后向每尾鱼的腹腔中注射 10 L 菌液，每组设 3 次平行实验，实验重复2 次。观察 14 d 并记录结果16。1.2.9数据处理及统计柱状图和折线图使用 GraphPad Prism 8 软件绘制，显著性差异利用 One-Way ANOVA 计算获得。相对免疫保护率(Relative percentage survival,RPS)=(对照组死亡率免疫组死亡率)/对照组死亡率 100%。2 结果 2.1 分泌蛋白 mRNA 转录水平利用 qPCR 技术对所选的 8 种基因进行检测，将获得的 qPCR 数据减去内参 16S RNA 后，绘制柱状图并对它们进行相对 mRNA 水平分析。结果显示，8 种基因(orf0322、orf3982、orf2874、orf1767、orf3984、orf2546、orf0472、orf1609)相对 mRNA 水平均大于 10，表明这 8 种基因在 LP-2 菌株中均已表达(图 1)。2.2 基因扩增以嗜水气单 胞 菌 强 毒 株 L P-2 的 基 因 组DNA 作为模版，利用目的基因引物进行 PCR 扩增，获得片段大小分别为：orf0472 930 bp、orf16091 875 bp、orf03221 065 bp、orf3982543 bp、orf39842 748 bp、orf28741 866 bp、orf2546519 bp和 orf17671 482 bp。PCR 扩增出来的 DNA 片段经琼脂糖核酸凝胶电泳检测，其结果与分泌蛋白基因片段大小预期相符(图 2)。2.3 重组菌 PCR 验证结果用 EcoR I 和 Hind III 将克隆的目的片段和载体 pET-32a 双酶切后，回收目的片段，将载体与目的片段连接后得到重组质粒，并将其转化进入感受态细胞 E.coli BL21 后，得到的阳性菌株进行菌液PCR。对 PCR 产物进行电泳的结果验证说明该重组菌成功，含有所需克隆基因片段(图 3)。2.4 蛋白纯化将得到的高表达重组菌株经过 IPTG 大量诱导表达并用 Ni-NTA 树脂柱纯化后，样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。如图 4 所示，目的蛋白条带单一，大小与预期相符，蛋白纯化成功。2.5 重组蛋白免疫相关基因表达采用 Trizol 法在斑马鱼进行蛋白免疫处理28 d 后提取其内脏 RNA，并利用 qPCR 技术检测其中 7 种免疫相关基因(IL15、IL10、IL8、IL1、MHCII、MHCI 和 Lyz)的表达情况(图 5)。通过比较注射目的蛋白组与 PBS、TrxA 对照组，发现斑马鱼中相关免疫基因大多发生了上调(变化倍数2)，其中 Lyz 和 MHCII 基因表达量上升最为显著，ORF3982、ORF2874、ORF3984、ORF1767 和0102030相对 mRNA 水平Relative mRNA levelorf3982orf3984orf1609orf1767orf0322orf0472orf2546orf2874基因 Gene图1 8 种分泌蛋白在嗜水气单胞菌 LP-2 菌株中的mRNA 表达结果Fig.1 mRNA expression results of eight excretedproteins in LP-2 strainM 1 2 3 4 5 6 7 8bp2 0001 000 750500250100M.2 000 Marker;1.orf0472;2.orf1609;3.orf0322;4.orf3982;5.orf3984;6.orf2874;7.orf2546;8.orf1767.图2 8 个目的基因 PCR 扩增结果Fig.2 PCR amplification results of eight target genesM 1 2 3 4 5 6 7 8bp2 0001 000750500250100M.2 000 Marker;1.orf0472;2.orf1609;3.orf0322;4.orf3982;5.orf3984;6.orf2874;7.orf2546;8.orf1767.图3 高表达重组菌株菌液 PCR 验证结果Fig.3 PCR verification results of recombinant strain withhigh expression52南 方 水 产 科 学第 19 卷ORF1609 的 Lyz 基因分别上调了约 56.4、3.1、7.8、5.7 和 41.2 倍；MHCII 基因分别上调了约 51.2、50.7、17.9、25.8 和 11.9 倍。IL10、IL8 和 IL15基因的表达量也显著升高。2.6 攻毒实验免疫保护评价分别用 5 g 目的蛋白、PBS 和 TrxA(载体融合蛋白)注射斑马鱼腹腔，继续饲养 28 d 后再用强毒株 LP-2 菌株进行攻毒实验并观察 2 周。如图 6 所示，攻毒实验后，注射了 PBS 和 TrxA 蛋白的斑马鱼在 3 d 内逐渐开始死亡，而注射某些特定目的基因蛋白的斑马鱼成活率较高，说明某些分泌蛋白的相对免疫保护率(Relative immune protection rate,RPS)较高。在腹腔注射模式下，TrxA 的 RPS 为(3.02.6)%，而分泌蛋白 ORF1767、ORF3982、ORF1609、ORF2874、ORF3984、ORF0472 的RPS 均大于 50%，具有较好的相对免疫保护率，说明这几个分泌蛋白的免疫保护效果良好，能够作为未来潜在的候选亚单位疫苗。3 讨论嗜水气单胞菌是我国水产养殖鱼类暴发性传染病的主要病原菌之一17，其还可以感染人和动物，引发人类急性肠胃炎等疾病18。以往渔业生产中常用抗生素手段来预防和控制嗜水气单胞菌感染，虽有一定的防治效果，但也出现了耐药性、药物残留、抑制鱼类免疫系统等问题19。疫苗作为一种高效安全的治疗方式，是防治嗜水气单胞菌的理想手段，亚单位疫苗因其安全性高、治疗效果好且成本低等优点而成为当今的研究热点20。研究显示，分泌蛋白是嗜水气单胞菌主要的毒力因子之一，能够激发宿主产生高水平的保护性抗体。同时细菌分泌蛋白具有较好的免疫原性，可作为一种潜在的疫苗候选蛋白21-23。但嗜水气单胞菌中的分泌蛋白数量庞大，目前还有较多分泌蛋白的免疫原性未得到很好的研究。本研究在实验室前期研究基础上选取了 8 种分泌蛋白(ORF2546、ORF0472、ORF1609、ORF2874、ORF3982、ORF3984、ORF1767、ORF0322)为研究对象，首先验证了这些蛋白在嗜水气单胞菌强毒株 LP-2 中的转录情况，结果显示它们的相对 mRNA水平均为正值，说明上述 8 种蛋白在 LP-2 菌株中均发生了表达；然后利用克隆表达等分子学手段获得了纯化的分泌蛋白，并将上述蛋白注入斑马鱼腹腔中，利用 qPCR 检测斑马鱼中相关免疫基因的转录水平，发现其中 7 个免疫相关基因(IL15、IL10、IL8、IL1、MHCII、MHCI 和 Lyz)均发生了显著上调。结果表明，这些免疫基因在宿主的免疫反应过程中起着关键作用。如 IL10 是一种免疫调节性细胞因子，主要由 Th2 细胞产生，能抑制Th1 细胞释放细胞因子(IFN 和 IL2 等)。IL10 还可以抑制炎症介质因子的分泌，在体液免疫中起重要作用。Zhang 等24将 rOmpF 和 rOmpK 蛋白注入欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)中，发现 IL10 基因表达上调，说明 IL10 可能在蛋白诱导的免疫应答中发挥了抗炎作用。MHCII 和 MHCI 的主要功能是作为抗原呈递分子参与特异性免疫应答，并调节分子参与固有免疫应答，在特异性免疫应答中起到重要作用。Dash 等25通过将 rOmpR 蛋白注入露M1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7 M 8 11666.2453525kDM.2 000 Maker;1.ORF0472;2.ORF1609;3.ORF0322;4.ORF3982;5.ORF3984;6.ORF2874;7.ORF2546;8.ORF1767.图4 纯化蛋白 SDS-PAGE 结果Fig.4 SDS-PAGE results of purified protein第 4 期林潇可等:嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价53斯塔野鲮(Labeo rohita)后，发现 MHCII 基因表达显著上调，其作用可能是加速抗原呈递并刺激 T辅助细胞，从而加强对细菌的免疫应答。为探究本实验所选分泌蛋白是否可以作为候选疫苗，评估了 8 种分泌蛋白对斑马鱼的免疫保护性。攻毒实验结果表明，ORF1767、ORF3982、ORF1609、ORF2874、ORF3984 和 ORF0472 蛋白能够显著提升斑马鱼成活率，相对免疫保护率均高于 50%，Lyz01020304050*MHC I012345磷酸缓冲盐溶液 PBS*MHC II010203040506070*IL-103691215*IL-805101520*IL-100246810*IL-1503691215*相对 mRNA 水平Relative mRNA level相对 mRNA 水平Relative mRNA level相对 mRNA 水平Relative mRNA level相对 mRNA 水平Relative mRNA level相对 mRNA 水平Relative mRNA level相对 mRNA 水平Relative mRNA level相对 mRNA 水平Relative mRNA levelorf3982orf2874orf3984orf0472orf1767orf2546orf0322orf1609TrxA图5 斑马鱼的免疫相关基因表达结果注：*.P0.05；*.P0.01；*.P0.005。Fig.5 Expression results of immune-related genes in zebrafishNote:*.P0.05；*.P0.01；*.P0.005。54南 方 水 产 科 学第 19 卷而 ORF2546 与 ORF0322 的免疫保护率较低。经序列比对后发现，orf3982 和 orf2874 与多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)中的 ExbD 蛋白具有高度同源性。ExbD 蛋白作为 TonB 系统的重要组成部分，对革兰氏阴性菌摄取外界营养物质起至关重要的作用，ExbB 与 ExbD 形成依赖 TonB的外膜转运系统，参与革兰氏阴性菌中铁、碳水化合物、血红素、维生素 B12 以及多种重要物质的转运过程26。ExbD 主要由二级结构中较稳定的-螺旋和无规则卷曲构成，因其卷曲折叠易暴露在蛋白外层，有利于形成优势的细胞抗原表位27。目前有关 ExbD 蛋白的免疫原性报道较少见，本实验中两个蛋白 ORF3982 和 ORF2874 在进行斑马鱼腹腔注射实验后的相对免疫保护率分别为(71.22.6)%和(57.62.6)%，免疫保护效果良好，其在宿主发生免疫应答过程中发挥着重要作用，可作为候选疫苗开发。在腹腔注射免疫模式下，ORF1767 蛋白明显增强了斑马鱼的免疫应答反应，相对免疫保护率为(77.34.5)%，在所选蛋白中效果最好。经序列比对后发现，ORF1767 与棘阿米巴原虫(Acanthamoeba)中的 Hsp20 蛋白具有高度同源性，Hsp 蛋白具有分子伴侣的功能，在参与细胞骨架调节的同时，还可诱导细胞免疫和体液免疫应答，在多种原虫中具有良好的免疫原性28。本实验中的 ORF1767 蛋白与Hsp20 蛋白相似，在斑马鱼中也具有较好的免疫原性，可以作为抵抗嗜水气单胞菌亚单位候选疫苗。ORF3984 是一种微生物胶原酶，胶原酶可在生理 pH 和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其他蛋白质组分29。目前已知的微生物胶原酶多来自原核生物，在微生物侵袭有机体过程中，胶原酶发挥了降解特定细胞膜和细胞外基质的作用。微生物胶原酶对革兰氏菌具有一定的抗菌作用，Douglas 和 Patrzykat 等29研究发现胶原酶 CAPs 可能与先天免疫的其他分子协同作用，调节先天和适应性免疫系统，从而在宿主保护的各种机制之间提供联系。本实验中ORF3984 的相对免疫保护率为(56.15.2)%，有良好的免疫保护效果，能作为一种潜在的候选疫苗，可为嗜水气单胞菌胶原酶的免疫原性研究提供基础。ORF0472 是一种溶血素。溶血素能够导致细胞膜损伤、细胞活力下降以及细胞溶解或裂解，还可以通过在靶细胞膜上形成穿膜蛋白孔道引起细胞渗透性红细胞溶解以及单核细胞、粒细胞、内皮细胞和上皮细胞裂解30。溶血素在多种宿主体内具有免疫原性，张翠娟等31将体外表达的嗜水气单胞菌溶血素制成的类毒素疫苗免疫小鼠，获得了较高的保护效力。此外，王海丽等32通过克隆表达猪链球菌(Streptococcus suis)溶血素基因，证实了其可作为猪链球菌病基因工程疫苗靶标的可能性。本实验将 ORF0472 注入斑马鱼体内，大大降低了嗜水气单胞菌强毒株 LP-2 对斑马鱼的致死率，相对免疫保护率为(54.54.5)%，具有较好的免疫保护效果，与上述结论一致。因此，ORF0472 可以作为一种良好的亚单位疫苗候选分子来抵抗嗜水气单胞菌的侵染和传播。ORF1609 是一种胞外丝氨酸蛋白酶。研究发现，在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中，由 prtP编码的细胞外膜丝氨酸蛋白酶 lactocepin 除了有水解蛋白质、抗炎等功能外，还能介导乳酸菌的黏附作用32。此外，还有报道称，丝氨酸蛋白酶是一种与炎症相关的多功能酶，通常参与促炎细胞因子123456789 10 11 12 13 14020406080100orf3982orf2874orf3984orf0472orf1767orf2546RPS=(71.22.6)%RPS=(57.62.6)%RPS=(56.15.2)%RPS=(77.34.5)%RPS=(65.23.6)%RPS=(3.02.6)%orf0322orf1609TrxA磷酸缓冲盐溶液 PBSRPS=(54.54.5)%RPS=(16.75.2)%RPS=(18.14.5)%t/d成活率 Survival rate/%图6 攻毒后注射免疫下接种的斑马鱼的累积成活率及相对免疫保护率Fig.6 Cumulative survival rate and relative immune protection rate(RPS)of zebrafish inoculated withinjection immunization after challenge第 4 期林潇可等:嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价55的产生和巨噬细胞等免疫细胞的激活，在免疫过程中发挥着重要作用33-34。本实验中 ORF1609 显著降低了嗜水气单胞菌 LP-2 菌株对斑马鱼的毒力，相对免疫保护率为(65.23.6)%，具有较好的免疫应答反应，说明其适宜作为抗嗜水气单胞菌的候选疫苗，也为丝氨酸蛋白酶免疫保护性的研究奠定了基础。ORF0322 是一种未知蛋白，本实验通过腹腔注射对这种分泌蛋白进行了免疫反应，发现 ORF0322蛋白的免疫保护性较差，相对免疫保护率仅为(16.75.2)%，不具有良好的免疫原性。ORF2546是一种 Hcp 家族蛋白，章美娟等35研究发现 Hcp1蛋白会优先与宿主体内抗原呈递细胞结合，通过增加对辅助 T 细胞的摄取和抗原呈递来增强其免疫原性，从而产生相应的抗体。但本实验中 ORF2546的相对免疫保护率仅为(18.14.5)%，原因可能是纯化过程中得到的蛋白纯度较低，或在注射蛋白时蛋白未与佐剂混合均匀，导致未达到较好的免疫保护效果。4 结论本研究通过构建高表达载体将嗜水气单胞菌强毒株 LP-2 中的 8 种分泌蛋白(ORF2546、ORF0472、ORF1609、ORF2874、ORF3982、ORF3984、ORF1767和 ORF0322)进行过表达，并成功地纯化出了单一且浓度较高的目的蛋白。然后通过腹腔注射法对斑马鱼进行免疫与攻毒实验，观察其免疫应答反应并计算上述 8 种目的蛋白对斑马鱼的相对免疫保护率。结果发现，部分分泌蛋白可使斑马鱼体内免疫相关基因表达量显著提升，揭示一部分分泌蛋白引起斑马鱼免疫应答，可作为潜在疫苗开发。此外，攻毒实验还发现，6 种蛋白对斑马鱼的相对免疫保护率超过 50%，分别为 ORF1767(77.34.5)%、ORF3982(71.22.6)%、ORF1609(65.23.6)%、ORF2874(57.62.6)%、ORF3984(56.15.2)%和ORF0472(54.54.5)%。研究结果表明这 6 种蛋白具有较强的免疫保护作用，是较佳的嗜水气单胞菌亚单位候选疫苗。参考文献：沈锦玉.嗜水气单胞菌的研究进展 J.浙江海洋学院学报(自然科学版),2008(1):78-86.1杨守明,王民生.嗜水气单胞菌及其对人的致病性 J.疾病控2制杂志,2006(5):511-514.LIN L,WANG Y Q,SRINIVASAN R,et al.Quantitative proteo-mics reveals that the protein components of outer membrane ve-sicles(OMVs)in Aeromonas hydrophila play protective roles inantibiotic resistanceJ.J Proteome Res,2022,21(7):1707-1717.3葛慕湘,张文香,丁咚.鱼类嗜水气单胞菌致病性与毒力因子相关性研究进展 J.科学养鱼,2017(10):59-61