DB 37∕T 3677-2019 种猪场猪瘟净化技术规范.pdf

ICS 65.020.30 B 41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 36772019 种猪场猪瘟净化技术规范 Technical Regulation of Eradication of Classical Swine Fever in Swine Breeding Farms 2019 - 08 - 30 发布 2019 - 09 - 30 实施山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 36772019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 检测方法 . 2 4.1 仪器 . 2 4.2 耗材 . 2 4.3 试剂 . 2 4.4 猪瘟病原检测 . 2 4.5 猪瘟抗体检测 . 3 5 净化群建立 . 3 5.1 净化策略 . 3 5.2 净化前的准备工作 . 3 5.3 带毒情况摸底调查 . 3 5.4 免疫 . 4 5.5 监测与淘汰阶段 . 4 5.6 净化场的评估与认定 . 5 6 净化猪群的维持 . 5 6.1 免疫 . 5 6.2 监测 . 5 7 综合生物安全措施 . 6 7.1 合理的猪场选址 . 6 7.2 生产模式 . 6 7.3 饲养管理 . 6 7.4 消毒措施 . 6 7.5 无害化处理措施 . 6 7.6 有害生物防治 . 6 7.7 档案管理 . 7 附 录 A （资料性附录） 猪瘟免疫无疫评估实验室检测方法及抽样要求 . 8 附 录 B （资料性附录） 猪瘟净化评估实验室检测方法及抽样要求 . 9 DB37/T 36772019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 山东省动物疫病预防与控制中心、 山东省畜牧总站、 山东汇众兽医科技服务公司。 本标准主要起草人：李云岗、张栋、张月、周开锋、汪洋、楚遵峰、王士荣、王敏、曹振山、刘波。 DB37/T 36772019 1 种猪场猪瘟净化技术规范 1 范围 本标准规定了种猪场猪瘟净化的检测方法与判定标准、 净化群的建立、 净化群的维持和综合生物安全措施。 本标准适用于种猪场猪瘟净化。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 17823 集约化猪场防疫基本要求 GB/T 17824.2 规模猪场生产技术规程 GB/T 16551 猪瘟诊断技术 GB/T 27540 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 GB/T 34729 猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1568 标准化规模养猪场建设规范 NY/T 1958 猪瘟流行病学调查技术规范 DB37/T 2384 种猪场消毒技术规范 NY/T 1168 畜禽粪便无害化处理技术规范 病死及病害动物无害化处理技术规范 农医发201725号 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪瘟 Classical Swine Fever，CSF 由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪的高度接触性、出血性和致死性传染病。 3.2 净化 eradication 在某一限定地区或养殖场内， 根据特定疫病的流行病学调查结果和疫病监测结果， 采取一系列措施，及时发现并淘汰各种形式的感染动物，达到消灭和清除传染源的过程。 3.3 净化评估 eradication evaluation DB37/T 36772019 2 各级动物疫病预防控制机构或其它具有公信力的第三方机构对依法开办的规模化养殖场是否符合动物疫病净化条件所进行的审查、认证等活动。 4 检测方法 4.1 仪器 4.1.1 荧光 PCR 检测仪。 4.1.2 PCR 仪和凝胶成像系统（根据实验室条件选择，替换 4.1.1）。 4.1.3 高速台式冷冻离心机：可控温至 4 、离心速度可达 12 000 r/min 以上。 4.1.4 组织研磨器或者研钵。 4.1.5 普通冰箱。 4.1.6 微量移液器：0.2 L2 L，1 L10 L，10 L100 L，20 L200 L，100 L1 000 L。 4.1.7 酶标仪。 4.1.8 恒温箱。 4.1.9 高压灭菌锅。 4.2 耗材 4.2.1 1.5 mL 离心管。 4.2.2 0.2 mL PCR 薄壁管。 4.2.3 酶标板，移液器吸头。 4.3 试剂 4.3.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 4.3.2 商品化 RNA 抽提试剂，于 4 保存。 4.3.3 无水乙醇，-20 预冷。 4.3.4 75 %乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20 预冷。 4.3.5 dNTPs：含 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 10 mmol/L，-20 保存，避免反复冻融。 4.3.6 普通 PCR 引物参照 GB/T 16551。 4.3.7 荧光 PCR 引物和探针参照 GB/T 27540。 4.3.8 酶标检测试剂 等效采用 GB/T 34729 商品化试剂盒。 4.4 猪瘟病原检测 4.4.1 采样准备 扁桃体采样器、灭菌0.5 mL离心管、灭菌棉签或牙签、3 % NaOH溶液、手电筒、记号笔、采样记录表等。 4.4.2 样品类型 公猪精液；生产母猪、后备种猪扁桃体；非正常生产母猪流产胎儿的淋巴结、脾脏、脐带血；病死猪扁桃体、脾脏、肾脏、淋巴结等。 4.4.3 采样要求 DB37/T 36772019 3 4.4.3.1 参照 NY/T 541 执行。 4.4.3.2 采样器械应用 3 % NaOH 溶液消毒处理，并用水清洗干净后再采下一份，防止交叉感染。 4.4.3.3 最好避开猪瘟疫苗免疫后的 30 d 内。 4.4.3.4 采样迅速。样品加冰送专业实验室检测。 4.4.4 核酸检测 4.4.4.1 依据 GB/T 16551 或 GB/T 27540 检测猪瘟病毒核酸。 4.4.4.2 猪瘟病毒核酸阳性样品进行病毒基团扩增并测序。测序结果与疫苗基因序列对比，淘汰野毒感染阳性猪。判定其分支，评定现有疫苗的保护能力。 4.4.5 阳性猪处理 对野毒感染阳性猪扑杀或淘汰处理。 4.5 猪瘟抗体检测 4.5.1 采样 前腔静脉采血，分离血清。血清置于-20 冰冻保存（3 d内检测的宜放于2 8 冷藏保存）。采血过程及制备样品过程要防止污染并规范标记。 4.5.2 抗体检测 依据GB/T 34729执行。按照等效商品化试剂盒说明书操作并判定结果。优先使用猪瘟病毒抗体阻断ELISA试剂盒检测猪瘟抗体。 4.5.3 群体免疫抗体合格标准 基础猪群免疫后3 w的猪瘟抗体阳性率达到90 %以上。 5 净化群建立 5.1 净化策略 5.1.1 猪瘟疫苗免疫，确保免疫效果。种猪群带毒猪检疫剔除，逐步引入猪瘟阴性的后备种猪，建立和维系猪瘟阴性群，实现种猪猪瘟净化目标。停止免疫，达到非免疫无疫。 5.1.2 从种猪场、公猪站源头抓起，坚决淘汰野毒感染阳性带毒猪和多次免疫抗体不合格猪，切断猪瘟流行的恶性循环。 5.1.3 可选择使用猪瘟 E2 基因疫苗并配套使用市场化的非 E2 蛋白 ELISA 试剂盒，有效区分猪瘟野毒和疫苗毒，减少扁桃体采样应激，有助于种猪场的猪瘟净化。 5.2 净化前的准备工作 组成专门的净化技术小组，具体实施猪场的净化工作。按照NY/T 1958开展猪瘟流行病学调查。制定详细的监测技术方案、净化措施和适宜的免疫程序。开展针对性技术培训。 5.3 带毒情况摸底调查 5.3.1 采样数量及频次 DB37/T 36772019 4 5.3.1.1 免疫猪瘟疫苗免疫后 30 d 的种公猪、生产母猪和后备种猪采集扁桃体和全血，检测猪瘟病原和抗体情况。抽样要求和数量参照附录 A 中表 A.1、表 A.2 进行。置信度 95 %，预期流行率 5 %。根据野毒感染情况，确定具体净化方案。 5.3.1.2 对所有种公猪采集精液。 5.3.1.3 对生产母猪先分析全群生产母猪生产记录。将生产记录不佳的种猪，如产仔少、流产或有过产死胎、病胎、弱胎或仔猪成活率低的母猪直接淘汰处理。每批次母猪都要在哺乳结束进行分析淘汰。 5.3.1.4 哺乳仔猪、保育猪、育肥猪抽样比例 5 %。采集扁桃体和全血。 5.3.2 监测结果处置 5.3.2.1 抗体检测 掌握猪群中猪瘟抗体合格率和抗体整齐度、离散度情况。对猪瘟抗体不合格的种猪进行补免，经 2 次免疫猪瘟抗体仍不合格的猪予以淘汰。 5.3.2.2 病毒核酸检测 猪瘟病毒野毒感染阳性猪扑杀或淘汰处理。 5.3.2.3 净化方案确定 根据感染情况，调整、细化、完善净化方案。 5.4 免疫 5.4.1 疫苗选择 筛选免疫原性好的商品化猪瘟弱毒活疫苗进行免疫接种。 5.4.2 免疫程序 5.4.2.1 种公（母）猪每年普免 23 次，或经产母猪跟胎免疫，在产前 3 w4 w 或产后 2 w 免疫。 5.4.2.2 后备种猪配种前 4 w 加强免疫 1 次。 5.4.2.3 仔猪 35 d45 d 首免，70 d80 d 二免，或者根据抗体检测结果，确定首免及二免的时间，以抗体合格率在 90 %以上为标准。 5.4.3 免疫评估 5.4.3.1 如果猪群猪瘟抗体合格率在 90 %以上，直接进入“监测与淘汰阶段”。对猪群抗体不合格的猪进行二次免疫（在第一次免疫后 4 w 进行二免），免疫 4 w 后再检测猪瘟抗体，抗体阳性猪保留，阴性猪淘汰。 5.4.3.2 如果猪群猪瘟抗体合格率在 90 %以下，则对全群再次免疫，再次检测猪瘟抗体，抗体阳性猪保留，阴性猪淘汰。直到合格后才可以进入“监测与淘汰阶段”。 5.5 监测与淘汰阶段 5.5.1 带毒状况监测 猪瘟病毒检测阳性者，应淘汰处理；猪瘟病毒检测阴性且免疫抗体合格者，可作为种猪保留。 5.5.2 生产母猪 按100 %的比例采集扁桃体。母猪第1年检测2次，以后每年1次。检测结果为阳性的，判为野毒感染阳性猪进行扑杀或淘汰。 5.5.3 种公猪 全群采集精液，对阳性猪进行扑杀或淘汰。公猪每年至少2次。 DB37/T 36772019 5 5.5.4 后备种猪的监测与补充 对后备种猪在转入种猪群前1 w2 w逐头采取扁桃体和血液样本，进行猪瘟病毒和抗体的检测，猪瘟病毒阴性，抗体合格的留种，抗体不合格者补免一次，仍不合格者淘汰。 5.5.5 引种监测 按照有关规定从猪瘟病原阴性净化猪场引进猪只。逐头采取扁桃体样本，进行猪瘟病毒核酸监测，病原阴性的隔离饲养45天以上经检测合格后才可混群饲养。 5.5.6 生产记录不佳的种猪 参考4.4.2采样。做猪瘟病毒核酸检测，根据检测结果，淘汰种猪。 5.5.7 假定猪瘟阴性群判定 5.5.7.1 一般经三轮监测淘汰，猪群成为“假定猪瘟阴性群”。 5.5.7.2 净化实施完成后连续 2 年内，生产成绩正常稳定。 5.5.7.3 每年 1 次，按种公猪 100 %比例、母猪 10 %比例采集血液、扁桃体或精液，进行猪瘟病毒和免疫抗体监测。如抽检种猪群猪瘟病毒全部阴性且群体抗体水平符合合格标准可视为假定猪瘟阴性群。 5.6 净化场的评估与认定 5.6.1 猪瘟净化评估标准 5.6.1.1 免疫无疫标准 5.6.1.1.1 生产母猪、后备种猪抽检，猪瘟病毒抗体合格率 90 %以上。 5.6.1.1.2 种公猪、生产母猪和后备种猪抽检，猪瘟病原检测均为阴性。 5.6.1.1.3 连续两年以上无临床病例。 5.6.1.2 净化标准 5.6.1.2.1 种公猪、生产母猪和后备种猪抽检，猪瘟病毒抗体检测均为阴性。 5.6.1.2.2 停止免疫两年以上，无临床病例。 5.6.2 抽样要求 评估专家小组负责设计抽样方案并监督抽样。 样本方案和检测方法参见附录A、 附录B。 置信度95 %，预期流行率3 %。 6 净化猪群的维持 6.1 免疫 参照5.4.2免疫程序接种猪瘟疫苗。 6.2 监测 6.2.1 日常监测 DB37/T 36772019 6 6.2.1.1 每年对净化猪群进行 2 次抽检。每次采集扁桃体和血清样品，抽样比例参考表 A.1。置信度95 %，预期流行率 3 %。检测方法按 4.4 及 4.5 执行。 6.2.1.2 个体免疫抗体水平符合 4.5.2 且群体免疫抗体水平符合 4.5.3 者，为免疫抗体合格。 6.2.1.3 抽样复查如猪瘟病原检测出现阳性，应重新对种猪群开展净化。 6.2.2 后备猪和引种的检测 做好后备猪的检测和引进猪只的检疫，方法同5.5.4和5.5.5。 6.2.3 生产记录不佳的种猪检测 要及时收集病死猪及母猪所生产的弱仔猪、死胎、流产胎儿，样品采集及检测方法同4.4。如果猪瘟病毒核酸检测阳性，则检测对应的亲本母猪野毒感染状况，阳性者淘汰。 应重新按照“净化群建立”对种猪群开展净化。 7 综合生物安全措施 7.1 合理的猪场选址 按NY/T 1568执行。 7.2 生产模式 参照GB/T 17823执行。执行自繁自养、全进全出及“两点式”或“三点式”的生产模式。 7.3 饲养管理 7.3.1 按照 GB/T 17824.2 执行，加强饲养管理，减少应激。严格防疫体系，避免接触到传染源而发生再次感染。 7.3.2 专门的公猪站管理。确保公猪阴性，防止人工授精感染。 7.3.3 病猪与带毒猪严格隔离，阻断批间传播。 7.3.4 严格引种、转场猪隔离，阻断猪场间传播。 7.4 消毒措施 7.4.1 参照 DB37/T 2384 执行。严格做好人员、物品、用具、车辆、猪舍内外环境以及粪便排泄物和污水的消毒。 7.4.2 大门口设置车辆消毒系统，做好运输工具的消毒。饲料运输设置饲料中转站，饲料车不进入场区内，直接喷入饲料中转站，再由场内转运车进行转运。运猪车辆严格消毒，场内有专门的车辆对接。 7.4.3 员工及外来人员进入猪场要洗澡更衣，进入猪舍需再次洗澡更衣。在猪场内不能随意走动。 7.5 无害化处理措施 7.5.1 病死猪及母猪所生产的弱仔猪、死胎、流产胎儿按农医发201725 号病死及病害动物无害化处理技术规范的规定执行。 7.5.2 粪便处理按 NY/T 1168 的规定。 7.6 有害生物防治 定期开展杀虫、灭鼠、防蝇、驱鸟工作。 DB37/T 36772019 7 7.7 档案管理 规范记录净化监测的相关档案记录和抽样监测记录。记录保存不少于2年。 DB37/T 36772019 8 A A 附 录 A （资料性附录） 猪瘟免疫无疫评估实验室检测方法及抽样要求 表A.1 猪瘟免疫无疫评估实验室检测方法及抽样要求 检测项目 检测方法 抽样种群抽样数量 样本类型病原学检测 荧光定量 PCR 种公猪 生产公猪存栏 50 头以下，100 %采样；生产公猪存栏 50头以上，按照证明无疫公式计算（置信度 95 %，预期流行率 3 %） 。 将采样数量按照存栏比例分配到不同栋舍后随机抽样。 扁桃体 生产母猪后备种猪按照证明无疫公式计算采样数量（置信度 95 %，预期流行率 3 %） ；随机抽样，覆盖不同猪群。 扁桃体 抗体检测 ELISA 生产母猪按照预估期望值公式计算采样数量（置信度 95 %，预期合格率 90 %，相对误差 10 %） 。将采样数量按照存栏比例分配到不同栋舍后随机抽样。 血清 后备种猪按照预估期望值公式计算采样数量（置信度 95 %，预期合格率 90 %，相对误差 10 %） 。将采样数量按照存栏比例分配到不同栋舍后随机抽样。 血清 表A.2 猪瘟净化抽样参考数量 群体数量 （N） 感染情况评价 感染情况评价 预期流行率（P） 预期流行率（P） 3 %（猪） 5 %（猪） 50 43 37 100 63 47 150 73 51 200 78 54 300 84 56 400 88 58 500 90 59 750 93 60 1000 94 60 1500 96 61 2000 96 61 3500 97 62 5000 98 62 7500 98 62 10000 98 62 99 62 DB37/T 36772019 9 B B 附 录 B （资料性附录） 猪瘟净化评估实验室检测方法及抽样要求 表B.1 猪瘟净化评估实验室检测方法及抽样要求 检测项目 检测方法 抽样种群 抽样数量 样本类型 抗体检测 ELISA 种公猪 生产公猪存栏 50 头以下，100 %采样；生产公猪存栏 50 头以上，按照证明无疫公式计算 （置信度 95 %， 预期流行率 3 %） 。将采样数量按照存栏比例分配到不同栋舍后随机抽样。 血清 生产母猪 后备种猪 按照证明无疫公式计算采样数量（置信度 95 %，预期流行率 3 %） ；随机抽样，覆盖不同猪群。 血清 _