气动挤压式3D生物打印机搭建与应用.pdf

ISSN1672-4305CN12-1352/N实 验 室 科 学LABORATORY SCIENCE第 26 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.26 No.3 Jun.2023 气动挤压式 3D 生物打印机搭建与应用高志刚,李晓瑞,罗 勇(大连理工大学 化工学院,辽宁 大连 116024)摘 要:3D 生物打印技术可精准控制支架的三维结构、细胞分布、生物信号,具有操作简单、成本低、生物材料使用范围广等特点。为了更好地拓展生物打印技术科教结合,在传统 3D 打印机的基础上,设计搭建了气动控制的挤压式生物打印机,测试了打印机温度控制范围,完成了温敏型生物墨水的制备并考察其可打印性。此外,利用所搭建的生物打印机,打印乳腺癌细胞 MCF7,实验结果表明所打印的细胞能够均匀地分布在三维支架中,细胞存活率可以达到 95%以上,表明所搭建的打印机能够满足生物打印要求,可应用到实验教学中。关键词:挤压式生物打印;气动控制;生物墨水;乳腺癌细胞中图分类号:G482 文献标识码:B doi:10.3969/j.issn.1672-4305.2023.03.042Construction and application of pneumatic extrusion 3D biological-printerGAO Zhigang,LI Xiaorui,LUO Yong(School of Chemical Engineering,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)Abstract:3D bioprinting technology can accurately control the structure,cell distribution and biologi-cal signals of scaffolds.It has the characteristics of simple operation,low cost and wide application range of biomaterials.In order to expand the combination of science and education of biological print-ing technology,based on the traditional 3D printer,we design and build a pneumatic controlled extru-sion biological printer,test the temperature control range of the printer,complete the preparation of temperature sensitive biological ink and investigate its printability.In addition,using the biological printer to print breast cancer cell MCF7,the experimental results show that the printed cells can be e-venly distributed in three-dimensional scaffolds,and the cell survival rate can reach more than 95%,which indicate that the printer can meet the requirements of biological printing and be applied to exper-imental teaching.Key words:extrusion bio-printing;pneumatic control;bio-ink;breast cancer cells 收稿日期:2022-04-23 修改日期:2022-11-13作者简介:高志刚,硕士,工程师,主要研究方向为药物化学和微流控芯片。E-mail:gzg1980 基金项目:2020 年辽宁省新工科项目(项目编号:ZL2020162)。3D 生物打印是一种新兴的跨学科前沿技术,可以在计算机精准控制下,将生物材料和活细胞按照预先构建的三维模型,层层堆叠得到具有生物相容性的组织工程支架或组织器官,已成为计算机学、机械工程学、材料学、生物学、医学等多个学科领域交叉的综合性技术1-2。与传统的细胞接种方法相比,该打印技术具有精准控制细胞分布、高通量、交叉污染几率低和重复性高等特点 3。其打印出的体外仿生组织可应用在药物筛选、活性评价、药物代谢检测和再生医学等多个领域4-5。如利用生物打印方式构建类肝组织和肾阵列,在初步试验中取得较好的效果,已经引起制药行业的兴趣6。打印机作为 3D 生物打印技术的硬件基础,直接影响生物打印墨水的选择和打印后的保真度7。目前生物打印机国内发展较快,主要包括喷墨式生物打印机、激光直写式生物打印机、光固化式生物打印机和挤压式生物打印机8-9。其中挤压式生物打印技术,因具有成本较低、设备构造简单和生物材料多样等特点,应用较为广泛,但该类打印机普遍价格昂贵。为了更好地拓展生物打印技术科研教学相结合,本文在普通 3D 打印机基础上,设计搭建了气动挤压式生物打印机,并完成乳腺癌细胞打印,并以此为本科生开展创新性实验项目,加深对生物打印前沿学科知识的认识和理解。1 挤压式生物打印1.1 挤压式打印原理挤压式生物打印是利用流体分配系统产生的动力,将生物材料从特殊结构的打印喷嘴处按照一定速度连续挤出,在运动平台上通过计算机控制而形成三维结构。目前挤压式生物打印机控制系统可以采用气压、活塞和螺杆三种方式,气压方式需要连接气源,通过调整气体输出压力而控制打印挤出速度,操作灵活简单。活塞和螺杆式结构相对复杂,均是通过机械驱动,前者可以直接控制生物墨水的打印速度,后者可以提供更多的空间控制,适用于高粘度生物墨水打印10。挤压式生物打印因纤维连续沉积层层堆叠的独特成型方式,可打印尺寸较大较厚的组织。挤压式生物打印的主要优势是可以沉积高密度的细胞,可用于多细胞微球的打印,构建的组织化器官中细胞密度可达到生理化级别。总之,挤压式生物打印成本较低,设备简单,生物材料使用范围广,打印组织的细胞密度仿生化,是药物表型筛选工业化应用最有潜力的生物打印技术11-12。1.2 挤压式生物打印墨水为了满足挤压式生物墨水的可打印性能要求以及组织生物活性需求,选取生物材料墨水时往往会选择两种甚至更多种生物材料的复合物,以达到生物相容性、机械性能和可打印性间的平衡。常见的挤压式生物材料墨水中组分主要包括天然的脱细胞外基质,透明质酸、海藻酸、壳聚糖等天然聚合物衍生物,普朗尼克和聚乳酸等合成聚合物。上述材料为了模拟细胞外基质,给细胞提供结构支撑、信号分子传递功能以及黏附作用。对于和细胞混合在一起生物材料墨水要求具有以下特点:(1)生物相容性。体现在生物材料对构建 3D 生物体的生物学和功能的积极可控的作用;(2)降解性。打印的 3D 生物体中细胞产生的蛋白酶和细胞外基质会逐渐降解和代替材料支架。同时,生物材料的降解产物必须是无毒的,与细胞是生物相容的,可以代谢并快速从体内清除;(3)可打印性。在挤压式生物打印中,可打印性的表现形式是生物材料通过挤压在喷嘴处形成连续线状,而非液滴状,且可以堆叠成 3D 结构体。这要求生物材料既不是液体,也不是固体,而是具有一定粘度的非牛顿流体,通常粘度大于 30 mPas 的生物材料才适用于挤压式生物打印13。2 气动挤压式生物打印机设计与搭建生物打印机设计上,与传统 3D 打印机相比,都包括软件系统、控制系统、3D 移动系统、墨盒以及成型平台。然而生物打印机是用来操控细胞以及水凝胶材料的,需要保证打印过程的无菌,避免细胞的机械物理损伤,墨盒与普通 3D 打印机的截然不同,因此普通的 3D 打印机无法用于生物打印研究。结合前期研究工作,本文设计一种成本较低,操作简单的气压驱动的挤压式生物打印机,其构成系统如图 1所示。图 1 气动生物打印机系统图2.1 软件系统生物 打 印 使 用 软 件 包 括 AutoCAD 软 件、3dsMAX 软件、SolidWorks 软件等,用于构建三维模型数据处理软件,将三维结构经切片软件转化为层层的二维平面图案,即含打印路径的 gcode 文件。打印机自带系统控制软件,用于读取 gcode 文件,转化为具体的打印操作。2.2 硬件系统2.2.1 三维运动平台硬件系统中的三维运动平台是 3D 打印最基本的要素,分为 X、Y 和 Z 三个方向。X 方向和 Y 方向通过控制每一层的移动方向和距离来实现图案化,Z 方向通过控制层高和层数实现三维结构的高度化。由于该部分与传统 3D 打印机硬件无区别,故采用商品化的三维运动平台。2.2.2 生物墨盒由于生物打印材料不是固体,并具有一定流动性,需要特殊墨盒装载材料。同时为防止打印过程中细胞感染,所设计的墨盒应具有良好的密闭性。所设计生物墨盒如图 2A 所示,为圆柱形中空铝制夹套,外观直径为 9 cm,高度为 11.5 cm,中心直径861 高志刚,等:气动挤压式 3D 生物打印机搭建与应用为 2 cm,用于储存生物墨水,储存量可达20 mL。外环部分上下两端各自设置 1 个管路接口,连接冷却循环水,进而达到控制墨盒温度的目的。图 2 气动生物打印机的生物墨盒和喷嘴实物图2.2.3 生物打印喷嘴喷嘴是挤出式打印机重要组成部分,直接影响打印材料的效果和精度。生物打印多为打印细胞,其大小通常是微米量级,故喷嘴的内径设计为0.4 mm。喷嘴材料为铝制,包括入口、中间和出口三个部分,如图 2B 所示。入口处有螺纹,可以与生物墨盒套筒很好地密封连接。中间形状是椭圆锥形,使得生物墨水在挤压时受到的剪切力逐步增加,避免了剪切力的急剧增大引起的细胞损伤。出口设计成平的,并连接一次性输液针头,便于纤维材料塑形。2.2.4 动力系统气动挤压式生物打印机动力主要是气压,因此需要气瓶作为气源。压力的大小会影响生物材料的挤出速度以及挤出量,需要可视化的气压阀调整控制气压大小。本打印机选择稳定、不聚合的氩气作为气压源,同时打印过程中为了便于调整气压,如图 3A 和图 3B 所示,在打印机上安装气压阀,可以提高气压调整的操作友好性,有利于打印过程中流体驱动压力的随时调整。同时,在生物墨盒上方的密封盖处外接气路管道接口,通过 PVC 软管与气源连接。为了提高气体的密封性,如图 3C 所示,在密封盖下方加一个白色垫圈,在密封盖螺纹对接处缠绕聚四氟乙烯。此外生物墨盒还可通过钢制管道与空气连通,打印完成后,打开管道出口处的气阀,释放墨盒内气压,便于密封盖的打开以及墨盒内部的后续清洗消毒。图 3 气动式挤压生物打印机的气源控制系统2.2.5 成型平台为了提高温敏型生物墨水成型性,成型平台需要控制温度,其材质选择铝制的,尺寸是 23015010 mm,中心含有可灌流液体的管道,外接两个管路接口,边角下方设计四个弹簧,可用于初始校准以及打印过程中的高度微调。2.2.6 控温系统打印机温度控制采用水作为导热介质通入到生物墨盒中空部分和成型平台中心管道,通过恒温循环水槽控制打印机温度。恒温循环水槽的出水口和入水口与生物墨盒和成型平台外接口之间通过聚氯乙烯软管连接,软管接口处截面需平整圆滑,避免漏液。3 打印机性能考察3.1 打印机温度精度考察由于温度控制对打印效果影响较大,故首先测试打印机温度控制精度,生物墨盒和成型平台设置 5,15,25,35和 40等五个温度,其实际温度与测定值误差范围均在 0.1 以内,控制较为精准。同时该温度范围适用于细胞生存,以及温敏型水凝胶打印和交联成型。3.2 生物墨水制备及流变性质评价羟乙基纤维素(HEC)-明胶(GelMA)复合墨水的制备是将 HEC 添加至 6.5%(w/v)GelMA 生理盐水溶液中,于 70 的恒温水浴锅中磁力搅拌 2 小时,最终形成的 HEC/G 墨水中 HEC 的浓度为 3%。墨水的流变学性质应用旋转流变仪检测,其中旋转板的直径是 40 mm,与放置墨水的样品台的间隙距离设置为 100 m,检测温度设置为 25。测试前,将墨水放置在 40 水浴锅中温育15 min,使其完全液化。一次性无菌注射器吸取液化的墨水 3 mL 放置在样品台中心位置,将旋转板降至预设高度,使墨水均匀铺满间隙。为了确保墨水流变学行为是在设定温度条件下,静置 20 min 后,再进行流变学相关测试。弹性模量 G表征的是生物墨水凝胶网络形成的稳固程度,G是生物墨水的粘流模量,表征的是生物墨水容液化的程度。本实验所制备的生物墨水流变性结果如图 4 所示,在需要的应变范围内,弹性模量 GG,说明生物墨水的弹性行为要强于粘性行为,在打印完成后可以保持立体构型不变,不会发生坍塌的状况,具有一定的机械强度。961图 4 复合生物材料墨水的粘弹模量3.3 打印成型性评价将 10 mL 生物材料墨水中添加几滴红墨水,装载至生物墨盒中,放入活塞,拧紧密封盖,关闭墨盒部分与空气连通的气压阀。旋转成型平台下方的弹簧旋钮,调整平台高度和水平度。30 min 后,将 SD卡插入打印机卡槽,根据打印机上电子屏面板提示,操作右侧上下左右按钮,开始打印。同时设定气压输出为 0.2 MPa。打印完成后,喷洒 CaCl2溶液,作用 3 min,凝胶交联完成。打印效果如图 5 所示,固化后的三维结构转移到 75381 mm 的玻璃基板上,打印的三维结构厚度均为 2 mm。其中既有实心三维结构,也有环状结构,图案化包含圆形、三角形、方形、五角星型,其二维横向尺寸为 1515 mm。图中三维支架结构的网格形状有六边形、方形、三角形,支架 XY 平面尺寸为 2020 mm,支架纤维宽度为 1.5 mm。图中的三维结构 XY 平面尺寸为 1010 mm,支架纤维宽度为700 m。从图中可以看到,不同三维结构棱角分明,形状维持良好,这表明改装的气动式挤压生物打印机具有打印生物墨水材料的功能,尤其是温敏型水凝胶;而且可打印不同尺寸、不同结构的三维模型。图 5 打印的 3D 支架效果图4 乳腺癌细胞生物打印4.1 乳腺癌细胞培养乳腺癌细胞 MCF7 的培养液是含 10%(w/v)NBCS 的 DMEM/F-12,每隔 2 天换液一次,于 37 培养箱中孵育培养。待细胞在培养皿的生长密度达到 90%时,对细胞进行消化传代,具体操作如下:吸弃培养液,加入不含血清的 DMEM/F-12,轻轻漂洗皿底,吸弃培养基,加入胰酶作用 2 min,吸弃胰酶,加入培养液,用枪头吹打混匀,形成单一的细胞悬液。4.2 乳腺癌细胞打印细胞悬液和生物材料墨水按照 1 10 的体积比例混匀,形成细胞密度为 1107个/mL 的生物墨水。将生物墨盒、喷嘴、成型平台、活塞和生物打印机外周结构用 75%乙醇清洗消毒,放置超净工作台中,紫外照射灭菌。设置控温温度为 15,生物墨盒中装载生物墨水,SD 卡插入打印机卡槽,选择网格支架进行打印。打印完成后,喷洒 CaCl2溶液,作用 3 min,不含血清的 DMEM/F-12 空培养基漂洗三维组织三次,加入培养液置于孔板中孵育。4.3 细胞荧光染色打印后显微镜下观察如图 6A 和图 6B 所示,Ho-echst 试剂添加至含三维组织的孔板中,培养箱孵育15min 后,PBS 漂洗三次,置于荧光显微镜下观察拍照,结果如图 6C 所示,可以看到细胞核与 Hoechst 作用,发出蓝色荧光,均匀地分布在三维支架中。图 6 支架中打印细胞荧光图像Calcein-AM/PI 试剂添加至另一含三维组织的孔板中,培养箱孵育 15 分钟后,PBS 漂洗三次,置于荧光显微镜下观察拍照,如图 6D、图 6E 和图 6F 所示。进入活细胞的 Calcein-AM 被胆碱酯酶水解,释放 Calcein,显示绿色荧光;PI 可以透过通透性增加的死细胞细胞膜,与细胞核中的碱基对结合,使得死细胞核发出红色荧光。Image-Pro Plus 软件统计图071 高志刚,等:气动挤压式 3D 生物打印机搭建与应用中活细胞和死细胞的数量,结果显示细胞的存活率 95%以上,表明搭建的气动式生物打印机具有打印活细胞的功能,可应用于三维细胞支架或三维组织的构建中。5 结语本文初步搭建了气动控制的挤压式生物打印机,该机可精准控制生物墨水挤出量、可温控生物墨盒和成型平台、可微调成型平台的高度、可无菌操作,适用于打印的生物材料种类多,能够满足生物打印要求,有广泛的应用前景。但同时该设备也存在一些不足,如气动控制存在延迟性,在打印初始阶段,导致成型平台上打印路径的缺失,三维结构不完整,喷嘴是尺寸单一,分辨率较低等问题。期望在接下来的工作中,能够很好地解决上述问题,开发出更加低廉的生物打印机,应用到实验教学中。参考文献(References):1 石静,钟玉敏.组织工程中 3D 生物打印技术的应用J.中国组织工程研究,2014,18(2):271-276.2 王雪欣,张明谏,李小兵,等.3D 生物打印在组织/器官类似物制造领域的应用J.中国组织工程研究,2018,22(10):1611-1617.3Derby B.Printing and prototyping of tissues and scaffoldsJ.Science,2012,338(6109):921-926.4 周青青.基于细胞 3D 打印技术的药物肝毒性模型研究D.杭州:杭州电子科技大学,2016.5 张小翠,陈鹏.3D 生物打印技术及其在组织工程中的应用J.临床与病理杂志,2017,37(7):1496-1499.6 Vaidya M.Startups tout commercially 3D-printed tissue for drug screeningJ.Nature Medicine,2015,21(1):2-4.7 Choudhury D.,Anand S.,Naing M.W.The arrival of commer-cial bioprinters-Towards 3D bioprinting revolutionJ.Interna-tional Journal of Bioprinting,2018,4(2):139.8 张一帆,张佳颖,徐铭恩,等.基于同轴细胞打印双网络生物墨水优化及类血管支架的打印J.中国组织工程研究,2020,24(22):3553-3558.9 Pereira R.F.,Bartolo P.J.3D bioprinting of photocrosslinkable hydrogel constructs J.Journal 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