拟南芥NBS1互作蛋白的筛选和鉴定.pdf

引文格式：吴钒漳,孙旭东,徐慧妮.拟南芥 NBS1 互作蛋白的筛选和鉴定J.云南农业大学学报(自然科学),2023,38(4):558565.DOI:10.12101/j.issn.1004-390X(n).202202008拟南芥 NBS1 互作蛋白的筛选和鉴定*吴钒漳1，孙旭东2，徐慧妮1*(1.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500；2.中国科学院昆明植物研究所，云南昆明650201)摘要:【目的】筛选拟南芥中 NBS1 的互作蛋白，探究 NBS1 蛋白的新功能，为后续研究奠定基础。【方法】利用酵母双杂交技术筛选拟南芥 cDNA 文库，对得到的序列进行 BLAST 比对、亚细胞定位分析和基因本体注释。【结果】共有 221 个阳性克隆，测序后通过 BLAST 比对得到 97 个与 NBS1 互作的蛋白，包括膜蛋白、转运蛋白和折叠蛋白等，它们主要定位于细胞质、细胞核和叶绿体等，主要富集于 4 个分子功能、5 个细胞组分和 13 个生物过程。【结论】拟南芥中与 NBS1 互作的蛋白在刺激响应、信号转导和细胞代谢等方面发挥着重要作用，也证明 NBS1 是一种多功能蛋白，但其功能及分子机制还需进一步研究。关键词:拟南芥；NBS1；蛋白互作；酵母双杂交；基因本体注释中图分类号:Q949.748.306文献标志码:A文章编号:1004390X(2023)04055808Screening and Identifying Interaction Proteins ofNBS1 in Arabidopsis thalianaWUFanzhang1，SUNXudong2，XUHuini1(1.FacultyofLifeScienceandTechnology,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China;2.KunmingInstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Kunming650201,China)Abstract:PurposeToscreentheinteractionproteinandexplorethenewfunctionofNBS1pro-teininArabidopsis thaliana,layingthefoundationforfurtherresearch.MethodsTheyeasttwo-hybridtechnologywasusedtoscreentheinteractionproteinsofNBS1fromA.thalianacDNAlib-rary.BLASTalignment,subcellularlocalizationanalysisandgeneontologyannotationswereper-formedontheobtainedsequences.ResultsTherewere97proteinsinteractedwithNBS1in221positiveclonesbyBLASTaftersequencing,includingmembraneproteins,transportersandfoldingproteins.Theseproteinsweremainlylocalizedincytoplasm,nucleusandchloroplast,whichweremainlyenrichedinfourmolecularfunctions,fivecellularcomponentsand13biologicalprocesses.ConclusionTheproteinsinteractingwithNBS1playanimportantroleinstimulusresponse,sig-naltransductionandcellmetabolism.ItisalsoconfirmedthatNBS1isamultifunctionalprotein,butitsfunctionandmolecularmechanismneedfurtherstudies.Keywords:Arabidopsis thaliana;NBS1;proteininteraction;yeasttwo-hybrid;geneontology云南农业大学学报（自然科学），2023，38(4)：558565http:/JournalofYunnanAgriculturalUniversity(NaturalScience)E-mail:收稿日期：2022-02-16修回日期：2022-03-02网络首发日期：2023-09-06*基金项目：国家自然科学基金项目(31760582)。作者简介：吴钒漳(1995)，男，陕西府谷人，在读硕士研究生，主要从事分子生物学研究。E-mail：*通信作者 Correspondingauthor：徐慧妮(1980)，女，山东莱阳人，博士，教授，主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。E-mail：网络首发地址：https:/ 损伤，其中 DNA 双链断裂(double-strandbreakage，DSBs)是一种非常严重的损伤，若不及时修复会影响基因组的稳定，甚至导致细胞死亡1。同源重组(homologousrecombination，HR)和非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)是植物 DSBs 修复的 2 种途径2，使基因组受到损伤后仍然能够被精确地修复。HR 主要发生在细胞周期的 S 期，以姐妹染色单体或同源染色体为模板进行修复，准确率极高；而 NHEJ发生在整个细胞周期，通过连接 DNA 末端来修复 DSBs，这种方法虽然明显快于 HR 修复，但准确率低于 HR 途径，而且会导致遗传信息丢失3。MRN 复合物是由 3 种蛋白质(MRE11、RAD50 和NBS1)组成的基因修复复合体，在 DSBs 修复的2 种途径中发挥着重要作用，参与起始修复、引发信号转导和协助修复等各个环节4-5。NBS1 是 MRN 复合物的重要组分，是细胞应答 DNA 损伤的关键蛋白，在 DNA 复制、DSBs识别、细胞周期调控和维持基因组稳定等方面具有重要作用6。NBS1 蛋白主要分为 3 个结构域：N 端、中心区和 C 端。其中，N 端包含 FHA 结构域和 BRCT 结构域，这 2 种结构域与 DNA 损伤修复和细胞周期调控相关7-9。FHA/BRCT 结构域能够直接结合磷酸化后的组蛋白 H2AX，招募MRN 复合物到 DNA 双链断裂的位点附近10-11。研究发现：BCAS2 可以与 NBS1 的 N 端互作，增强 DNA 双链断裂的修复能力12。中心区含有若干个丝氨酸残基，当 DNA 双链发生断裂时，这些丝氨酸残基会被 ATM 磷酸化，与 NBS1 一起参与细胞周期 S 期的调控13-14。NBS1 蛋白的C 端含有 MRE11 的结合位点，NBS1 通过该位点与 MRE11 结合并与 RAD50 共同组成 MRN 复合体，同时参与 MRN 复合物的核转位15。本研究通过拟南芥酵母文库筛选得到 97 个与 NBS1 互作的蛋白，为后续研究拟南芥 NBS1 蛋白的功能及其分子机制奠定基础。1 材料与方法1.1试验材料试验所用拟南芥品种为哥伦比亚(ColumbiaCol-0)，酵母培养基购自北京酷莱博科技有限公司，拟南芥的 cDNA 文库、酵母菌株 Y2HGold、Y187、大肠杆菌 DH5、酵母双杂交载体 pGADT7(AD)和 pGBKT7(BD)均为中国科学院昆明植物研究所实验室保存。1.2重组载体的构建利用 EastepSuper 总 RNA 提取试剂盒提取拟南芥总 RNA，再用 5All-In-OneRTMasterMix试剂盒合成 cDNA。以 cDNA 为模板，用 NBS1 基因特异性引物 NBS1-F：GAGGACCTGCATATG-ATGGTTTGGGGTCTCTTTCCC 和NBS1-R：CA-GGTCGACGGATCCTCAACTTCCAGAGAGAAA-CCC 扩增得到 NBS1 的基因序列。胶回收后用同源重组法将 NBS1 基因重组到 BD 载体上，再转化到大肠杆菌 DH5 中，37 过夜培养。挑取单菌落进行 PCR 扩增，将阳性克隆送至擎科生物有限公司测序。1.3重组载体的自激活检测将测序正确的 BD-NBS1 重组载体转化到酵母菌株 Y2HGold 中，用 SD/-Trp 平板筛选，同时转化 AD 和 BD 空载体作为阴性对照。将转 AD空载体的 Y187 菌株分别与转 BD 空载体和 BD-NBS1 重组载体的 Y2HGold 菌株共同培养 12h，培养液稀释后涂布于 SD/-Trp/-Leu 和 SD/-Trp/-Leu/-Ade 平板上，28 培养 23d，检测其自激活活性。1.4酵母 cDNA 文库筛选互作蛋白将转 BD-NBS1 重组载体的酵母 Y2HGold 菌株培养到 OD2600.8，再与含 cDNA 文库的 Y187菌株混合培养 24h，离心集菌后用 0.5YPDA 液体培养基 10mL 悬浮菌体，涂到 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His 平板上，28 培养 34d。挑取单菌落，吸取菌液 1L 进行 PCR 检测，将阳性克隆送至擎科生物科技有限公司测序，分析测序结果。为了验证筛选结果的可靠性，随机挑选 4 个候选蛋白，利用同源重组法将基因重组到 AD 载体上，与 BD-NBS1 质粒共同转化酵母菌株 Y2HGold，涂 SD/-Trp/-Leu 平板，28 培养 23d。挑取单菌落，然后稀释培养液，吸取菌液 1L 点至 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His 平板上，28 培养 34d。2 结果与分析2.1重组载体 BD-NBS1以拟南芥 cDNA 为模板克隆 NBS1 基因，大小为 1629bp(图 1a)；单菌落 PCR 进行扩增(图 1b)第4期吴钒漳，等：拟南芥 NBS1 互作蛋白的筛选和鉴定559后成功获得 BD-NBS1 的重组载体。2.2重组载体 BD-NBS1 的自激活活性由图 2 可知：重组载体 BD-NBS1 经转化、培养后，SD/-Trp/-Leu/-Ade 平板上无菌落生长，说明 BD-NBS1 重组载体在酵母菌株 Y2HGold 中无自激活现象，可用于后续酵母文库的筛选。2.3互作蛋白的筛选结果研究共获得221 个阳性克隆，测序后通过TAIRBLAST 进行比对分析，得到 97 个与 NBS1 互作的蛋白，其亚细胞定位结果见表 1。2 000 bpa)b)Maker121 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp2 000 bpMaker121 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp注：a)RT-PCR 扩增 NBS1，1 和 2 为 RT-PCR 产物；b)BD-NBS1 菌落 PCR 扩增，1 和 2 为 BD-NBS1 重组菌落 PCR 扩增产物。Note:a)RT-PCRamplificationofNBS1,1and2areRT-PCRproducts;b)colonyPCRamplificationofBD-NBS1,1and2areBD-NBS1recombinantcolonyPCRamplificationproducts.图 1 BD-NBS1 重组载体的构建Fig.1ConstructionofrecombinantvectorBD-NBS1AD+BDAD+BD-NBS1-Leu,-Trp-Leu,-Trp,-AdeAD+BDAD+BD-NBS1图 2 BD-NBS1 自激活检测Fig.2IdentificationofBD-NBS1forauto-activation表 1 NBS1 结合蛋白及其功能分析Tab.1FunctionalanalysisofNBS1bindingproteins编号number基因座位genelocus亚细胞定位subcellularlocalization蛋白描述proteindescription功能预测functionalprediction1AT2G17720线粒体mitochondrion2-酮戊二酸和铁依赖性加氧酶蛋白2-oxoglutarateandFe(II)-dependentoxygenaseprotein铁离子结合ironionsbinding2AT1G35190细胞质cytoplasm2-酮戊二酸和铁依赖性加氧酶蛋白2-oxoglutarateandFe(II)-dependentoxygenaseprotein铁离子结合ironionsbinding3AT1G12440细胞核nucleus锌指家族蛋白zincfingerfamilyproteinDNA结合DNAbinding4AT4G37000叶绿体chloroplast红叶绿素分解代谢还原酶redchlorophyllcatabolitereductase蛋白质结合proteinbinding5AT2G21620细胞质cytoplasm腺嘌呤核苷酸水解酶adeninenucleotidealphahydrolases水解酶活性hydrolaseactivity6AT5G67560液泡vacuoleADP-糖基化因子ADP-ribosylationfactorGTP结合GTPbinding7AT3G48690细胞核nucleus/-水解酶超家族蛋白alpha/beta-hydrolasessuperfamilyprotein水解酶活性hydrolaseactivity8AT3G11680叶绿体chloroplast苹果酸转运蛋白malatetransporter转运蛋白活性transporteractivity9AT2G38710叶绿体chloroplastAMMECR1家族蛋白AMMECR1familyprotein催化活性catalyticactivity10AT5G40160叶绿体chloroplast锚蛋白重复家族蛋白ankyrinrepeatfamilyprotein蛋白质结合proteinbinding11AT3G22110线粒体mitochondria20S蛋白酶体亚基20Sproteasomealphasubunit水解酶活性hydrolaseactivity560云南农业大学学报第38卷表1(续)编号number基因座位genelocus亚细胞定位subcellularlocalization蛋白描述proteindescription功能预测functionalprediction12AT4G14440细胞核nucleus3-羟乙基辅酶A脱水酶13-hydroxyacyl-CoAdehydratase1水合酶活性hydrataseactivity13AT2G19590细胞质cytoplasmACC氧化酶ACCoxidase氧化酶活性oxidaseactivity14AT1G59910细胞核nucleus肌动蛋白结合FH2家族蛋白actin-bindingFH2familyprotein肌动蛋白结合actinbinding15AT3G05420细胞质cytoplasm酰基辅酶A结合蛋白acyl-CoAbindingprotein酰基辅酶A结合acyl-CoAbinding16AT2G41445线粒体mitochondriaMADS-box蛋白MADS-boxprotein蛋白质结合proteinbinding17AT3G28940细胞核nucleusAIG2家族蛋白AIG2familyprotein催化活性catalyticactivity18AT4G36250细胞质cytoplasm醛脱氢酶aldehydedehydrogenase醛脱氢酶活性aldehydedehydrogenaseactivity19AT5G13420叶绿体chloroplastTIM家族蛋白TIMfamilyprotein转醛酶活性transaldolaseactivity20AT3G42790细胞核nucleusALFIN家族蛋白ALFINfamilyprotein甲基化组蛋白结合methylatedhistonebinding21AT4G22260线粒体mitochondria氧化酶家族蛋白oxidasefamilyprotein氧化酶活性oxidaseactivity22AT1G19130细胞核nucleusRMLC折叠蛋白RMLCfoldprotein催化活性catalyticactivity23AT4G33780叶绿体chloroplastATP磷酸核糖转移酶ATPphosphoribosyltransferase蛋白质结合proteinbinding24AT4G32530液泡vacuoleV-ATP酶家族蛋白V-ATPasefamilyproteinATP水解活性ATPhydrolysisactivity25AT1G31770质膜plasmamembraneATP结合盒式转运蛋白ATP-bindingcassettetransporter转运蛋白活性transporteractivity26AT1G67730线粒体mitochondria-酮酰基还原酶beta-ketoacylreductase氧化还原酶活性oxidoreductaseactivity27AT5G20230质膜plasmamembrane蓝铜结合蛋白blue-copper-bindingprotein电子转移活性electrontransferactivity28AT4G33430质膜plasmamembraneBRI1相关受体激酶BRI1-associatedreceptorkinase信号受体结合signalingreceptorbinding29AT2G41010细胞核nucleus钙调素结合蛋白calmodulin-bindingprotein钙调素结合calmodulinbinding30AT4G25780细胞外extracellularCAP超家族蛋白CAPsuperfamilyprotein有机环状化合物结合organiccycliccompoundbinding31AT3G04700细胞核nucleusTPR蛋白TPRprotein蛋白质结合proteinbinding32AT3G52600细胞壁cellwall细胞壁转化酶cellwallinvertase水解酶活性hydrolaseactivity33AT3G06778细胞核nucleus伴侣DNAJ结构域蛋白chaperoneDNAJ-domainprotein蛋白质结合proteinbinding34AT3G13310叶绿体chloroplast伴侣DNAJ结构域蛋白chaperoneDNAJ-domainprotein蛋白质结合proteinbinding35AT5G18140叶绿体chloroplast伴侣DNAJ结构域蛋白chaperoneDNAJ-domainprotein蛋白质结合proteinbinding36AT1G48850细胞核nucleus分支酸合酶chorismatesynthaseFMN结合FMNbinding37AT2G18600细胞核nucleusRUB1结合酶RUB1-conjugatingenzyme转移酶活性transferaseactivity38AT1G05060叶绿体chloroplast卷曲螺旋蛋白coiled-coilprotein蛋白质结合proteinbinding39AT4G02570细胞核nucleus泛素连接酶ubiquitinligase蛋白质结合proteinbinding40AT4G34180叶绿体chloroplast环化酶家族蛋白cyclasefamilyprotein芳基甲酰胺酶活性arylformamidaseactivity41AT5G10860细胞质cytoplasm胱硫醚合酶cystathioninebeta-synthase钴离子结合cobaltionbinding第4期吴钒漳，等：拟南芥 NBS1 互作蛋白的筛选和鉴定561表1(续)编号number基因座位genelocus亚细胞定位subcellularlocalization蛋白描述proteindescription功能预测functionalprediction42AT3G27090细胞核nucleusDCD结构域蛋白DCDdomainprotein蛋白质结合proteinbinding43AT1G17600细胞核nucleus抗病蛋白diseaseresistanceprotein蛋白质结合proteinbinding44AT3G12210细胞核nucleusDNA结合蛋白DNAbindingprotein蛋白质结合proteinbinding45AT2G34860叶绿体chloroplastDNAJ/Hsp40超家族蛋白DNAJ/Hsp40superfamilyprotein还原酶活性reductaseactivity46AT4G13830细胞核nucleusDNAJ蛋白DNAJprotein蛋白质结合proteinbinding47AT4G15910线粒体mitochondria干旱诱导蛋白drought-inducedprotein蛋白质结合proteinbinding48AT3G11600细胞核nucleusE3泛素蛋白连接酶E3ubiquitin-proteinligase蛋白质结合proteinbinding49AT1G08500细胞外extracellular早期类结瘤素蛋白earlynodulin-likeprotein电子转移活性electrontransferactivity50AT3G60360细胞核nucleus核仁小RNAsmallnucleolarRNA蛋白质结合proteinbinding51AT3G22845细胞质cytoplasmGOLD家族蛋白GOLDfamilyprotein蛋白质结合proteinbinding52AT3G15750细胞核nucleusYAE1蛋白YAE1protein蛋白质结合proteinbinding53AT2G31990高尔基体golgiapparatus外泌素家族蛋白exostosinfamilyprotein糖基转移酶活性glycosyltransferaseactivity54AT3G45970细胞壁cellwall扩展蛋白expansinprotein结构分子活性structuralmoleculeactivity55AT3G20300线粒体mitochondria离子通道蛋白ionchannelprotein蛋白质结合proteinbinding56AT4G04930细胞膜cellmembrane脂肪酸去饱和酶家族蛋白fattyaciddesaturasefamilyprotein蛋白质结合proteinbinding57AT3G10060叶绿体chloroplast肽脯氨酰顺反异构酶peptidyl-prolylcis-transisomerase蛋白质结合proteinbinding58AT5G58870叶绿体chloroplastFTSH蛋白酶FTSHproteaseATP水解活性ATPhydrolysisactivity59AT3G48680细胞质cytoplasm碳酸酐酶2gammacarbonicanhydrase2蛋白质结合proteinbinding60AT4G12870细胞外extracellular溶酶体巯基还原酶lysosomalthiolreductase氧化还原酶活性oxidoreductaseactivity61AT3G16370叶绿体chloroplast酰基水解酶超家族蛋白acylhydrolasesuperfamilyprotein水解酶活性hydrolaseactivity62AT5G20630细胞核nucleus类萌发素蛋白germin-likeprotein锰离子结合manganeseionbinding63AT3G43860细胞外extracellular糖基水解酶glycosylhydrolase水解酶活性hydrolaseactivity64AT3G10970叶绿体chloroplast卤酸脱卤酶水解酶haloaciddehalogenasehydrolase催化活性catalyticactivity65AT3G51880细胞核nucleusHMGB蛋白HMGBprotein蛋白质结合proteinbinding66AT3G29075细胞膜cellmembrane富含甘氨酸蛋白glycine-richprotein磷脂酸结合phosphatidicacidbinding67AT2G25625叶绿体chloroplast去乙酰化酶deacetylase蛋白质结合proteinbinding68AT3G61890细胞核nucleus亮氨酸拉链蛋白leucinezipperprotein蛋白质结合proteinbinding69AT3G24860细胞核nucleusTrihelix转录因子Trihelixtranscriptionfactor转录因子活性transcriptionfactoractivity70AT3G17609细胞核nucleusHY5蛋白HY5protein蛋白质结合proteinbinding71AT3G24030叶绿体chloroplast羟乙基噻唑激酶家族蛋白hydroxyethylthiazolekinasefamilyprotein蛋白质结合proteinbinding562云南农业大学学报第38卷97 个基因的基因本体注释结果(图 3)显示：NBS1 候选互作蛋白主要富集于 4 个分子功能、5 个细胞组分和 13 个生物过程。分子功能包括蛋白质结合、氧化还原酶活性、催化活性和水解酶活性；细胞组分包括细胞质、叶绿体、内质网、染色体和液泡；生物过程包括细胞死亡、响应茉莉酸、响应脱落酸、胚胎后发育、囊泡介导的转运、响应光刺激、响应辐射、信号转导、叶片发育、响应氧化胁迫、脂质生物合成过程、代谢过程和响应温度刺激。表1(续)编号number基因座位genelocus亚细胞定位subcellularlocalization蛋白描述proteindescription功能预测functionalprediction72AT5G50600叶绿体chloroplast羟基类固醇脱氢酶hydroxysteroiddehydrogenase脱氢酶活性dehydrogenaseactivity73AT1G65430细胞核nucleus含IBR结构域蛋白IBRdomain-containingprotein连接酶活性ligaseactivity74AT5G02820细胞核nucleusDNA拓扑异构酶DNAtopoisomerase蛋白质结合proteinbinding75AT5G13220细胞核nucleus茉莉酸锌结构域蛋白jasmonate-zim-domainprotein蛋白质结合proteinbinding76AT1G73325细胞外extracellular蛋白酶抑制剂proteaseinhibitor抑制剂活性inhibitoractivity77AT1G17620细胞核nucleus富含羟脯氨酸的糖蛋白hydroxyproline-richglycoprotein蛋白质结合proteinbinding78AT4G21750细胞核nucleus分生组织蛋白meristemprotein蛋白质结合proteinbinding79AT4G11060叶绿体chloroplast单链DNA结合蛋白single-strandedDNAbindingprotein蛋白质结合proteinbinding80AT5G40440叶绿体chloroplast丝裂原活化蛋白激酶mitogen-activatedproteinkinase蛋白质结合proteinbinding81AT4G09460细胞核nucleusMYB结构域蛋白MYBdomainprotein蛋白质结合proteinbinding82AT2G29290细胞膜cellmembraneNADP结合蛋白NADP-bindingprotein催化活性catalyticactivity83AT1G18800细胞核nucleusNAP1相关蛋白NAP1-relatedprotein组蛋白结合histonebinding84AT4G01900叶绿体chloroplast氮调节蛋白nitrogenregulatoryprotein蛋白质结合proteinbinding85AT5G53190质膜plasmamembraneSWEET家族蛋白SWEETfamilyprotein蛋白质结合proteinbinding86AT2G34720细胞核nucleus核因子YnuclearfactorY蛋白质结合proteinbinding87AT1G45248线粒体mitochondria核仁组蛋白甲基转移酶nucleolarhistonemethyltransferase甲基转移酶活性methyltransferaseactivity88AT3G52220细胞核nucleus细胞免疫球蛋白类受体蛋白immunoglobulin-likereceptorprotein蛋白质结合proteinbinding89AT1G67100细胞核nucleus含LOB结构域蛋白LOBdomain-containingprotein蛋白质结合proteinbinding90AT3G32980细胞外extracellular过氧化物酶超家族蛋白peroxidasesuperfamilyprotein血红素结合hemebinding91AT5G19620叶绿体chloroplast外膜蛋白outerenvelopeprotein蛋白质结合proteinbinding92AT1G25260细胞核nucleus核糖体蛋白ribosomalprotein蛋白质结合proteinbinding93AT2G47340细胞质cytoplasm植物转化酶plantinvertase果胶酯酶活性pectinesteraseactivity94AT2G45790细胞质cytoplasm磷酸甘露聚糖酶phosphomannomutase蛋白质结合proteinbinding95AT1G75770细胞核nucleus假设蛋白hypotheticalprotein蛋白质结合proteinbinding96AT3G27906细胞核nucleus假设蛋白hypotheticalprotein蛋白质结合proteinbinding97AT2G43340细胞核nucleus假设蛋白hypotheticalprotein蛋白质结合proteinbinding第4期吴钒漳，等：拟南芥 NBS1 互作蛋白的筛选和鉴定5632.4互作蛋白的回复验证由图 4 可知：随机挑选的 4 个候选蛋白经基因重组、转化酵母菌株 Y2HGold、涂布和培养后菌落能够正常生长，说明候选蛋白与 NBS1 蛋白存在相互作用，筛选结果可靠。3 讨论在植物细胞生长过程中，其 DNA 随时都可能受到外界因素(如紫外线和电离辐射)和内源因素(如 DNA 复制错误和活性氧)的损伤16，进而可能导致某些功能丧失，严重的甚至导致细胞死亡。前期研究发现：DNA 修复途径在不同物种之间是高度进化保守的17。DSBs 是一种非常严重的 DNA 损伤，主要通过 HR 途径和 NHEJ 途径修复2。在 DSBs 修复过程中，MRN 复合物有着重要作用。NBS1 蛋白是 MRN 复合物的关键组成部分，它是一种多功能蛋白，参与各种 DNA损伤反应，如 DSBs 识别、细胞周期调控和维持基因组稳定等6。为进一步研究 NBS1 蛋白的功能及其分子机制，通过筛选拟南芥酵母文库，获得了 97 个 NBS1的互作蛋白。这些蛋白参与了刺激响应、细胞死亡和信号转导等过程，证明 NBS1 是一种多功能蛋白。在这些互作蛋白中，发现 1 个 MYB 家族蛋白。MYB 家族是植物中最大的转录家族之一，广泛参与植物代谢和生物调控18。MYB 蛋白可分为4R-MYB、3R-MYB、1R-MYB 和R2R3-MYB4 类，其中，R2R3-MYB 类蛋白数量最多，参与植物代谢及抗病等过程19。有研究发现：As-pf2-like(VDAL)蛋白与E3连接酶PUB25和PUB26相互作用，可防止 MYB6 降解，从而提高植物对黄萎病的抵抗力20。蛋白质翻译后修饰(磷酸化、糖基化、泛素化和甲基化等)是近年研究的热点，几乎参与细胞所有的生命活动过程，在植物体内发挥着重要的调控作用21。前期也有研究发现：E3 连接酶RNF20 可以与 NBS1 相互作用，共同参与 DNA双链修复22。本研究筛选出 1 个与泛素化有关的E3 连接酶 GIR2，其能否与 NBS1 形成转录调控网络还需要进一步研究。蛋白质结合 protein binding催化活性 catalytic activity水解酶活性 hydrolase activity细胞质 cytoplasm叶绿体 chloroplast内质网 endoplasmic reticulum染色体 chromosome液泡 vacuole细胞死亡 cell death响应茉莉酸 response to jasmonic acid响应脱落酸 response to abscisic acid胚胎后发育 post-embryonic development囊泡介导的转运 vesicle-mediated transport响应光刺激 response to light stimulus响应辐射 response to radiation信号转导 signal transduction叶片发育 leaf development响应氧化胁迫 response to oxidative stress脂质生物合成过程 lipid biosynthetic process代谢过程 metabolic process响应温度刺激 response to temperature stimulus氧化还原酶活性 oxidoreductase activity分子功能 molecular function细胞组成 cellular component生物进程 biological process注释annotations00.51.01.52.02.53.03.54.04.5图 3 AtNBS1 候选互作蛋白基因本体注释Fig.3GeneontologyannotationofAtNBS1candidateinteractionproteinsBD+AD3BD-NBS1+AD3BD+AD6BD-NBS1+AD6BD+AD7BD-NBS1+AD7BD+AD9BD-NBS1+AD9图 4 酵母双杂交回复验证Fig.4Confirmationofpositiveinteractionbyyeasttwo-hybrid564云南农业大学学报第38卷 4 结论NBS1 蛋白在植物的生长发育过程中发挥着重要作用，除了参与 DNA 损伤修复之外，其他功能尚不清楚。本研究利用酵母双杂交技术筛选cDNA 文库，得到 97 个 NBS1 的互作蛋白，这些蛋白参与胚胎发育、信号转导和细胞代谢等生物过程，但 NBS1 是否参与这些生物过程还需要通过分子生物学及遗传学方法进一步研究。参考文献宋囡,石磊.DNA损伤修复的分子机理研究进展J.西南医科大学学报,