脑脂结合蛋白在胶质母细胞瘤U251细胞自噬中的调节作用.pdf

*基金项目南通大学医学院自然科学基金项目(TDYX2022014)*作者简介张惠雯袁女袁汉族袁生于 1992 年 11 月袁江苏省如皋市人袁研究方向院神经胶质细胞发生与分化及相关疾病遥*通信作者施金洪袁电话院0513-85051718袁E-mail:南 通 大 学 学 报 渊 医 学 版 冤Journal of Nantong University(Medical Sciences)2023 颐 43渊3冤DOI:10.16424/32-1807/r.2023.03.002引文格式院 张惠雯,张俊荣,施金洪.脑脂结合蛋白在胶质母细胞瘤 U251 细胞自噬中的调节作用J.南通大学学报(医学版),2023,43(3)颐207-210.胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是一种侵袭性强且易复发的脑部恶性肿瘤。虽然近年来靶向肿瘤纳米材料的研发和嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法的临床应用给 GBM 的治疗带来了新方法1-3，但GBM患者仍需接受长期的放疗和替莫唑胺等药物的辅助化疗。漫长的治疗周期和高复发率给患者本人、家庭及一线医护人员带来了沉重的负担2,4-5。脑脂结合蛋白(brain lipid binding protein,BLBP)是脂肪酸结合蛋白家族成员之一，BLBP 能促进GBM 细胞增殖，且高表达 BLBP 的 GBM 患者预后更差6。本研究在体外培养 GBM U251 细胞的基础上，应用 CRISPR/Cas9 技术敲除细胞中 BLBP 的表达，检测 U251 细胞自噬水平的变化，以期为 GBM 的基础和临床研究提供新思路。1材料和方法1.1材料来源U251 细胞、BLBP 敲除慢病毒 Lv-sgBLBP-Cas9、对照慢病毒 Lv-sgNC-Cas9 购自吉凯生物公司；DMEM/F12 培养液购自 Corning 公司；柱式总 RNA 提取纯化试剂盒、动物全蛋白提取试剂脑脂结合蛋白在胶质母细胞瘤 U251 细胞自噬中的调节作用*张惠雯1*袁张俊荣2袁施金洪3*(南通大学附属医院1护理部袁2妇产科袁南通 226001曰3南通大学医学院人体解剖学系)摘要目的院探讨脑脂结合蛋白(brain lipid binding protein,BLBP)在胶质母细胞瘤 U251 细胞自噬中的调节作用遥 方法院应用 CRISPR/Cas9 技术敲除 U251 细胞中 BLBP的表达袁检测 BLBP敲除后 U251 细胞的活力变化曰Ad-GFP-LC3b 腺病毒感染 U251 细胞后袁检测细胞中 GFP-LC3b 绿色荧光颗粒的数目曰Western Blot 检测自噬相关分子微管相关蛋白 1 轻链 3茁玉/域(microtubule associated protein 1 light chain 3 beta玉/域,LC3b玉/域)尧自噬相关基因 5(autophagy-relatedgenes 5,ATG5)尧选择性自噬接头蛋白(sequestosome1,SQSTM1)的蛋白表达水平曰Real-time PCR 检测 ATG5尧SQSTM1 的基因表达变化遥 结果院BLBP基因敲除后袁U251 细胞的活力明显下调袁GFP-LC3b 绿色荧光颗粒数目较对照组明显增多曰此外袁LC3b域的蛋白表达水平较对照组明显增高袁SQSTM1 蛋白水平明显下降袁 而 ATG5 的基因和蛋白表达水平均明显上调遥 结论院BLBP基因敲除能提高 U251 细胞的自噬水平袁BLBP 具有调节胶质母细胞瘤细胞自噬的能力遥关键词胶质母细胞瘤曰脑脂结合蛋白曰U251 细胞曰自噬中图分类号R739.41文献标志码A文章编号1674-7887渊2023冤03-0207-04Brain lipid binding protein regulates autophagy in U251 glioblastoma cell line*ZHANG Huiwen1*,ZHANG Junrong2,SHI Jinhong3*(1Department of Nursing,2Department of Gynaecology and Obstet鄄rics,the Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001;3Department of Human Anatomy,Medical School,Nan鄄tong University)AbstractObjective:To clarify the function of brain lipid binding protein(BLBP)in cellular autophagy in U251 glioblas鄄toma cell line.Methods:BLBP expression was deleted by using CRISPR/Cas9 technology,and then the cells viability wasinvestigated.After treatment of Ad-GFP-LC3b,the GFP-LC3b puncta number was measured.The proteins level of autophagy-related markers microtubule associated protein 1 light chain 3 beta玉/域(LC3b玉/域),autophagy-related genes 5(ATG5),sequestosome1(SQSTM1)were determined by Western Blot,while the gene levels of ATG5,SQSTM1 were detected by Real-time PCR.Results:In BLBP knockout cells,the cells viability was decreased,but the number of GFP-LC3b puncta wasincreased.The protein level of LC3b域 was elevated in BLBP knockout U251 cells than that in control cells,but SQSTM1was downregulated;both protein and gene level of ATG5 were upregulated in BLBP knockout cells.Conclusion:BLBP defi鄄ciency in U251 cells promotes the cellular autophagy,and BLBP can regulate the autophagy in glioblastoma cells.Key wordsglioblastoma;brain lipid binding protein;U251 cell;autophagy207窑窑南 通 大 学 学 报(医 学 版)2023 颐 43渊3冤注：A，Sanger 测序；B，BLBP基因敲除后检测细胞中 BLBP 蛋白表达情况；C，BLBP基因敲除后，检测细胞活力(*P0.001)。图 1BLBP基因敲除下调细胞活力CABsgBLBPsgNCBLBP茁-actinsgBLBPsgNC*120.0100.080.060.040.0-17 ku-42 ku盒、兔抗 茁-actin 购自上海生工生物工程有限公司；兔抗 BLBP 购自 Millipore 公司；CCK-8 检测试剂盒、cDNA 第一链合成试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、兔抗 AKT、兔抗p-AKT(Ser473)、GFP-LC3b 融合表达腺病毒(Ad-GFP-LC3b)购自碧云天公司；兔抗自噬相关基因(autophagy-related genes,ATG5)、兔抗微管相关蛋白 1 轻链 3茁玉/域(microtubule associated pro原tein 1 light chain 3 beta玉/域,LC3b玉/域)购自 CST公司；兔抗选择性自噬接头蛋白(sequestosome 1,SQSTM1)购自 GeneTex 公司。1.2方法1.2.1细胞培养U251 细胞以 1伊105个/孔的密度接种于 6 孔细胞培养板，每孔加入 2 mL 含有 10%FBS的 DMEM/F12 培养液；次日，每孔按感染复数(multi原plicity of infection,MOI)为 20 的比例加入 BLBP 敲除慢病毒 Lv-sgBLBP-Cas9(sgBLBP 组)和对照慢病毒Lv-sgNC-Cas9(sgNC 组)；24 h 后，吸除含有病毒的细胞上清，更换新鲜培养液继续培养。72 h 后，胰酶消化 sgBLBP 组细胞，计数 100 个细胞于 9.6 mL 新鲜培养液中，混匀后接种于 96 孔细胞培养板，每孔含有100 滋L 细胞悬液，每隔 3 d 更换新鲜培养液；14 d后，胰酶消化 96 孔板中培养所得的单细胞克隆，并送至上海生工生物工程有限公司进行 Sanger 测序；测序比对验证后，将符合要求的单细胞克隆，重新接种于 6 孔板进行扩增培养。1.2.2Western Blot测序验证后的 U251 细胞培养24 h 后，按本课题组报道的方法7提取细胞蛋白并测定蛋白浓度后，检测 LC3b玉/域(1颐1 000)、ATG5(1颐1 000)、SQSTM1(1颐1 000)、AKT(1颐1 000)、p-AKT(Ser473)(1颐1 000)等蛋白在细胞中的表达情况。1.2.3细胞活力检测U251 细胞以 5伊103个/孔的密度接种于 96 孔板培养，每孔加入 90 滋L DMEM/F12培养液和 10 滋L CCK-8 检测试剂，37 益孵育 1 h后，酶标仪检测各组细胞的吸光度(optical density,OD)，并计算细胞活力7。1.2.4Real-time PCR提取细胞总 RNA，并将 RNA反转录为 cDNA。按本课题组报道的方法8建立20 滋L 反应体系并进行 PCR 检测。所用引物如下：SQSTM1 上游：5忆-GGCATCCGCAATGTTGGTTT-3忆，下游：5忆-GGTTCCCCTAAGGCACTTTT-3忆；ATG5 上游：5忆-ATATGAAGGCACACCCCTGA-3忆，下游：5忆-TCATTCTGCAGTCCCATCCA-3忆；茁-actin 上游：5忆-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3忆，下游 5忆-CA-CCTTCACCGTTCCAGTTTT-3忆。1.2.5GFP-LC3b 绿色荧光检测24 孔板中以 2伊104个/孔接种 U251 细胞，每孔加 0.5 mL 含有 10%FBS 的 DMEM/F12 培养液；次日，更换 0.5 mL 的新鲜培养液，并按 MOI为 40的比例加入 Ad-GFP-LC3b；24 h 后，除去含有病毒的培养液，每孔加入 0.5 mL新鲜培养液，继续培养 24 h 后，于荧光显微镜下观察并计数细胞中绿色荧光颗粒的数目。1.2.6统计学方法所得数据以x 軃 依s 表示，并用GraphPad Prism 8.0 软 件 进行独立 样本 t 检 验。Shapiro-Wilk 法对所得数据进行正态性检验，参数检验使用非配对 t 检验或 Welch忆s 校正非配对 t 检验，非参数检验使用 Mann-Whitney 秩和检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1BLBP 基因敲除下调细胞活力Sanger 测序结果表明，sgBLBP 组的细胞存在 8 bp 的序列(CG原GTAATT)删失(图 1A)，所至的移码突变使 BLBP 不能在 U251 细胞中正常表达(图 1B)。细胞活力检测结果表明，sgBLBP 组细胞活力较 sgNC 组明显下降(图1C)。2.2BLBP 基因敲除促进细胞自噬Western Blot检测结果发现，sgBLBP 组细胞的 p-AKT(Ser473)表达水平明显下降(图 2A)，推测 BLBP 基因敲除后U251 细胞的活力下调，与 BLBP 对 PI3K/AKT 信号208窑窑通路的调控有关。此外，sgBLBP 组细胞中 LC3b域(16 ku)的表达水平较对照组明显增高(图 2A)；在Ad-GFP-LC3b 感染后的细胞中(图 2B)，sgBLBP 组中的 GFP-LC3b 绿色荧光蛋白颗粒数也较 sgNC 组明显增多(图 2C)。以上结果表明，BLBP 基因敲除能够促进细胞的自噬水平。3讨论GBM 是脑部最常见的原发性恶性肿瘤，好发于成年人，患者的平均总体生存期(overall survival,OS)只有 15 个月2；BLBP 能促进 GBM 细胞的增殖，高表达 BLBP 的 GBM 患者 OS 也较低表达 BLBP 的患者更短6。本课题组前期研究9表明，BLBP 基因敲除能够下调胶质瘤细胞的增殖能力，本研究进一步发现BLBP 基因敲除后 p-AKT(Ser473)表达水平下调，说明 BLBP 对细胞活力的影响可能与其对 PI3K/AKT信号通路的调节有关。PI3K/AKT 是一条经典的与细胞生存相关的信号通路，不仅参与了细胞存活、增殖、分化等过程，还参与调节了细胞自噬10-11。近期研究12-14表明 GBM的发生与细胞自噬密切相关，自噬相关分子 SQSTM1、ATG5 能通过调节细胞凋亡的方式来影响 GBM 的生物学功能。本研究中，BLBP 基因敲除后，U251 细胞的自噬能力明显增强；SQSTM1 蛋白表达下调，基因表达无变化；而 ATG5 的蛋白和基因表达水平均明显上升。SQSTM1 是一种重要的选择性自噬接头蛋白，在溶酶体降解过程中，与底物结合的 SQSTM1 会被蛋白水解酶降解；因此，自噬水平上升时 SQSTM1会减少，而 SQSTM1 的增加则被认为是自噬活性受到抑制的标志14。本研究中，BLBP 基因敲除的 U251细胞中 SQSTM1 蛋白表达下调，进一步说明 BLBP具有调节细胞自噬的能力。ATG5 是自噬形成的重要调节分子，在自噬发生的早期阶段，ATG5 能够与其他自噬相关分子(ATG12、ATG16)形成复合物以促注：A，Western Blot 检测 p-AKT(Ser473)、AKT、LC3b玉/域的表达(*P0.05,*P0.01,*P0.001)；B，感染 Ad-GFP-LC3b，检测细胞中GFP 阳性绿色荧光颗粒，Bar=20 滋m(*P0.05)。图 2BLBP基因敲除促进细胞自噬AB茁-actinsgBLBPsgNC*p-AKT(Ser473)AKTLC3b玉/域*-60 ku-60 ku-18 ku-16 ku-42 ku6.04.02.00.020.015.010.05.00.0sgBLBPsgNC注：A，BLBP基因敲除细胞中，SQSTM1 蛋白表达下降，ATG5 蛋白表达水平增高，*P0.05；B，BLBP基因敲除细胞中，ATG5 基因水平增高，而 SQSTM1 基因无变化，*P0.05。图 3BLBP基因敲除上调 ATG5 的表达AB茁-actin-42 kusgBLBPsgNCsgBLBPsgNC*ATG5SQSTM1-55 ku-62 ku*6.04.02.00.010.07.55.02.50.0张惠雯，等.脑脂结合蛋白在胶质母细胞瘤 U251 细胞自噬中的调节作用2.3BLBP 基因敲除上调 ATG5 的表达水平为阐明 BLBP 对自噬的调节机制，进一步检测了自噬相关分子 SQSTM1 和 ATG5 的表达情况。Western Blot结果表明，sgBLBP 组中 SQSTM1 的蛋白表达水平明显下调，而 ATG5 的蛋白表达水平明显上升(图 3A)；Real-time PCR 结果表明，sgNC 和 sgBLBP 两组细胞中 SQSTM1 基因表达水平无明显改变，而 sgBLBP 组中 ATG5 的基因表达水平明显较 sgNC 组增高(图3B)。上述结果表明，BLBP 可能参与了自噬相关分子ATG5 转录水平的调控。209窑窑南 通 大 学 学 报(医 学 版)2023 颐 43渊3冤进自噬体的形成；此外，ATG5 复合物与自噬体膜的结合还能促进 LC3 向自噬体的募集15。本研究明确了 BLBP 能够调节 U251 的细胞自噬，推测其机制与 BLBP 对 PI3K/AKT 信号通路和自噬相关分子 ATG5 的转录调控有关。然而 BLBP 基因敲除后 U251 细胞自噬水平的增加，在细胞增殖、迁移、存活等生物学过程中的具体作用仍不明确。自噬在 GBM 中的作用仍有争议：一方面，自噬被认为能够抑制 GBM 细胞的迁移和侵袭16；另一方面，自噬也被认为能够促进 GBM 细胞的存活并减少细胞凋亡12。GBM 细胞具有多样性和复杂性等特点17-20，在GBM 发展的不同阶段，各种病理相关分子的表达波动，动态调控了自噬的水平；此外，肿瘤所处的微环境变化，也是影响细胞自噬水平的一个重要因素。因此，研究 GBM 发生、发展各阶段自噬水平的变化，以及肿瘤不同阶段自噬相关分子的表达水平，能为临床更好地诊断和治疗GBM 提供新思路。参考文献1POWER E A,RECHBERGER J S,GUPTA S,et al.Drugdelivery across the blood-brain barrier for the treatment ofpediatric brain tumors-an updateJ.Adv Drug Deliv Rev,2022,185:114303.2BAGLEY S J,KOTHARI S,RAHMAN R,et al.Glioblas鄄toma clinical trials:current landscape and opportunities forimprovementJ.Clin Cancer Res,2022,28(4):594-602.3DAUBON T,HEMADOU A,ROMERO GARMENDIA I,etal.Glioblastoma immune landscape and the potential ofnew immunotherapiesJ.Front Immunol,2020,11:585616.4LEE D H,RYU H W,WON H R,et al.Advances in epi鄄genetic glioblastoma therapyJ.Oncotarget,2017,8(11):18577-18589.5HOTTINGER A F,STUPP R,HOMICSKO K.Standards ofcare and novel approaches in the management of glioblas鄄toma multiformeJ.Chin J 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