脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7_β-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究.pdf

Vol.43 No.7 Jul.2023上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7/-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究董海平，谢海怡，马晓晓，王震虹上海交通大学医学院附属仁济医院麻醉科，上海 200120摘要 目的探讨缺血性脑卒中后脑血管内皮细胞Wnt7/-catenin信号失活是否导致血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）完整性破坏，并研究内质网应激爆发是否介导了Wnt7/-catenin通路的抑制。方法采用线栓法阻断小鼠大脑中动脉建立大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，脑缺血60 min后拔除线栓。向MCAO模型小鼠腹腔注射内质网应激抑制剂 4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）作为 4-PBA+MCAO 组。并设置假手术组（Sham 组）。MCAO后24 h用伊文思蓝（Evans blue，EB）测定小鼠BBB的通透性，干湿法测定脑组织含水量，免疫荧光测定小鼠脑血管内皮细胞和周细胞黏附性。对人脑微细血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMECs）进行氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation，OGD）4 h，加入4-PBA培养24 h。细胞实验分为空白对照组、OGD组和OGD+4-PBA组。采用CCK-8测定细胞活力，通过检测FITC标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）的通过率来评估细胞通透性；通过ELISA测定HBMECs中血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF-）的分泌水平；采用Fluo-3 AM钙离子荧光探针检测细胞的荧光强度并评估细胞内钙离子浓度，通过CM-H2DCFDA荧光探针测量活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量以明确细胞内质网应激状态；蛋白质印迹法（Western blotting）检测HBMECs中的连接蛋白紧密连接蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）和密封蛋白5（claudin-5）、内质网应激蛋白 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）、葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12（cysteine-containing aspartate-specific proteases 12，Caspase-12）、Wnt7和-连环蛋白（-catenin）的表达水平。结果MCAO模型小鼠脑梗死区水含量较假手术组增加，EB渗出量明显增多（均P0.05），小鼠脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附性下降；腹腔注射4-PBA后MCAO模型小鼠脑水肿程度减轻，BBB的渗透性降低（均P0.05），脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附性增加。与空白对照组HBMECs比较，在OGD条件下细胞活力下降，通透性增加（均P0.05）；同时，OGD组HBMECs中连接蛋白ZO-1、claudin-5的表达水平下降，PDGF-的分泌水平减少，钙离子浓度升高，ROS含量明显上调，内质网应激蛋白CHOP、GRP78、Caspase-12的表达水平增加，Wnt7和-catenin的表达水平下降（均P0.05）。而当HBMECs的OGD模型经4-PBA处理后，OGD导致的HBMECs损伤减轻，细胞中连接蛋白的表达水平增加，HBMECs 的通透性降低，PDGF-的分泌水平增加，并且 Wnt7/-catenin 信号的活性明显恢复（均P0.05）。结论脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激爆发导致Wnt7/-catenin信号失活引起的内皮细胞损伤，是BBB破坏的关键途经。关键词内质网应激；Wnt7/-catenin；血脑屏障；缺血性脑卒中DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.07.005 中图分类号R743.33 文献标志码AMechanism of blood-brain barrier damage caused by the inhibition of Wnt7/-catenin pathway induced by endoplasmic reticulum stress in cerebrovascular endothelial cells after strokeDONG Haiping,XIE Haiyi,MA Xiaoxiao,WANG ZhenhongDepartment of Anesthesiology,Renji Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200120,China论著 基础研究基金项目 国家自然科学基金（82071290）；上海市自然科学基金（20ZR1433400）；上海市卫生健康委员会青年资助项目（20194Y0072）。作者简介 董海平（1988），女，主治医师，博士生；电子信箱：。通信作者 王震虹，电子信箱：。Funding Information National Natural Science Foundation of China(82071290);Shanghai Natural Science Foundation(20ZR1433400);Youth Funding Project of Shanghai Municipal Health Commission(20194Y0072).Corresponding Author WANG Zhenhong,E-mail:.8292023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Abstract Objective To investigate whether the inactivation of Wnt7/-catenin signaling causes the destruction of the blood-brain barrier(BBB)in cerebrovascular endothelial cells after ischemic stroke,and investigate whether endoplasmic reticulum stress bursts mediates the inhibition of Wnt7/-catenin pathway.Methods The model of middle cerebral artery occlusion(MCAO)in mice was established by a monofilament nylon suture with a round tip,which was used to temporarily occlude the middle cerebral artery for 60 min.MCAO model mice were intraperitoneally injected with the endoplasmic reticulum stress blocker 4-phenylbutyric acid(4-PBA)as 4-PBA+MCAO group.Sham surgery group(Sham group)was set.Twenty-four hours after MCAO,Evans blue(EB)was used to measure the BBB permeability.The brain water content was calculated by dry-wet weight ratio,and the adhesion of cerebrovascular endothelial cells and pericytes in mice was measured by immunofluorescence.Human brain microvascular endothelial cells(HBMECs)were used to establish an oxygen and glucose deprivation(OGD)model for 4 h,and then cultured with 4-PBA for 24 h.Cells were divided into blank control group,OGD group,and OGD+4-PBA group for CCK-8 assay to determine the cell viability.FITC-labeled bovine serum albumin(FITC-BSA)was used to detect the cell permeability.The secretion of platelet-derived growth factor (PDGF-)was measured by ELISA.Fluo-3 AM fluorescence probe was used to detect the fluorescence intensity of cells to assess intracellular Ca2+concentration,and reactive oxygen species(ROS)content was measured by CM-H2DCFDA fluorescence probe to clarify the endoplasmic reticulum stress state.Western blotting was used to examine the expression of connexins,including zonula occludens-1(ZO-1)and claudin-5,the expression of endoplasmic reticulum stress proteins,including CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein(CHOP),glucose-regulated protein 78(GRP78),and cysteine-containing aspartate-specific proteases-12(Caspase-12),and the expression of Wnt7/-catenin in HBMECs.Results Compared with the Sham group,the brain water content of the infarction area of mice increased after MCAO,and the exudation of EB increased significantly(both P0.05).The adhesion between cerebrovascular endothelial cells and pericytes in mice was reduced after the occurrence of MCAO.After intraperitoneal injection of 4-PBA in mice with MCAO,the degree of brain edema and the exudation of EB were reduced(both P0.05),and the adhesion between cerebrovascular endothelial cells and pericytes increased.Compared with the HBMECs of the blank control group,the viability of HBMECs after OGD decreased,and the permeability of HBMECs increased(both P0.05).OGD condition also led to decreased expression of connexins(ZO-1 and claudin-5),decreased secretion of PDGF-in HBMECs,increased expression of endoplasmic reticulum stress proteins(CHOP,GRP78 and Caspase-12),up-regulated intracellular Ca2+concentration and ROS content,and decreased expression of Wnt7 and-catenin in HBMECs(all P0.05).After HBMECs were cultured with 4-PBA,the damage of HBMECs caused by OGD was reduced,and the expression of connexins increased.The permeability of HBMECs was reduced,and the secretion of PDGF-was promoted(all P0.05).After 4-PBA treatment,the activity of Wnt7/-catenin signaling was significantly restored in the OGD model of HBMECs(P0.05).Conclusion Wnt7/-catenin signaling inactivation caused by endothelial reticulum stress bursts leads to cerebrovascular endothelial cell damage,which is the crucial pathway of BBB destruction after stroke.Key words endoplasmic reticulum stress;Wnt7/-catenin pathway;blood-brain barrier(BBB);ischemic stroke脑卒中当前已成为威胁我国居民健康的主要原因之一，是造成我国减寿年数高的首位病因1。高达 67.3%80.5%的脑卒中为缺血性脑卒中（脑梗死）2，可能遗留严重残疾和肢体、语言等功能障碍，给患者和家庭均带来巨大的精神和经济压力，也给整个社会造成负担。血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是维持脑组织代谢稳态的保障。研究3发现脑卒中后 BBB 的破坏对脑损伤起到了关键作用。血管内皮细胞是BBB的核心组成部分，其结构被破坏能引起脑卒中后脑水肿4。因此针对缺血性脑卒中后BBB特别是血管内皮细胞的损伤机制研究有望为治疗干预这一疾病提供可能的突破点。内质网的主要功能是细胞内蛋白的加工、修饰以及合成，并为其他细胞器供给脂质，稳定细胞内Ca2+的浓度5。缺血缺氧等不良刺激可以引起细胞内质网伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白 78（glucose-regulated protein 78，GRP78）的表达增加；GRP78 与蛋白激酶 R 样内质网激酶 protein kinase R（PKR）-like endoplasmic reticulum kinase，PERK、转录激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和真核翻译 起 始 因 子 2（eukaryotic initiation factor 2，eIF2）分离后，PERK激活GRP78和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP），促进非折叠蛋白积聚，内质网应激过度导致细胞损伤6。内质网应激还可以促进细胞氧化应激爆发，诱发过氧化损伤7-8。我们以往的研究9证实，脑卒中能诱导脑血管内皮细胞内质网应激的发生，并加重细胞损伤。因此，脑卒中后内质网应激是血管内皮细胞损伤和BBB破坏的重要环节。Wnt蛋白是一组保守的分泌型蛋白，可以激活下游-连环蛋白（-catenin）；Wnt/-catenin信号通路在细胞生物功能中发挥重要的作用10-11。近来一些研究4，12已证实Wnt/-catenin通路的失活是脑卒中后BBB功能损害的重要因素。其中Wnt7主要存在于血管系统中，特别是脑血管内皮细胞中，是神经系统830董海平，等脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7/-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）调节 BBB 的形成和维持其通透性的关键分子13-14，但Wnt7在脑卒中后脑血管内皮细胞中发挥的作用及机制还有待阐明。研究15发现，抑制人胚肾293细胞中内质网应激相关蛋白eIF2和CHOP的上调可以降低-catenin的表达水平。也有研究16-17证实内质网应激和Wnt通路的抑制密切相关，但脑卒中后内质网应激对Wnt7/-catenin通路的影响还未阐明。因此本研究在小 鼠 大 脑 中 动 脉 栓 塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型和人脑血管内皮细胞糖氧剥夺（oxygen and glucose deprivation，OGD）模型中探讨脑卒中后内质网应激对Wnt7/-catenin通路的调控作用，并阐明脑卒中后内质网应激爆发抑制 Wnt7/-catenin信号通路从而导致脑血管内皮细胞和 BBB损伤的关键机制，以期为临床减轻脑卒中后脑水肿的形成提供参考。1材料与方法1.1实验动物SPF级C57BL/6野生型小鼠，性别不限，68周龄，购于上海南方模式生物科技有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0010。实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2017-0012。小鼠饲养于上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物中心，饲养环境12 h光照与12 h黑暗交替，自由饮食。1.2实验细胞人脑微细血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cell，HBMEC）购自美国ScienCell公司。1.3主要试剂及仪器4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）、戊巴比妥钠、伊文思蓝（Evans blue，EB）、FITC标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）均购自 Sigma（美国）；cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒（Dojindo，日本），紧密连接蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）一抗（Proteintech，美国），CCAAT/CHOP、门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 12（cysteine-containing aspartate-specific proteases 12，Caspase-12）、GPR78、密封蛋白 5（claudin-5）、Wnt7、-catenin、CD31、CD13、actin 一 抗 以 及 血 小 板 衍 生 生 长 因 子（platelet-derived growth factor，PDGF-）ELISA试剂盒（Abcam，英国），二抗和DAPI（北京中杉金桥生物技术有限公司），CM-H2DCFDA 活性氧荧光探针（Invitrogen，美国），Fluo-3 AM 钙离子荧光探针（Thermo Fisher Scientific，美国），小鼠线栓（北京西浓科技有限公司）；BS110S化学天平（Sartourius，德国），细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，美国），Ti2E 荧光显微镜（Nikon，日本），SP8 激光共聚焦显微镜（Leica，德国），Chemidoc XRS+化学发光成像 系 统、多 功 能 酶 标 仪（Bio-Rad Laboratories，美国）。1.4动物实验方法1.4.1动物分组小鼠共45只，分为3组，分别为假手术组（Sham组）、MCAO组、4-PBA+MCAO组，每组15只。Sham组小鼠进行解剖和血管分离，不放置线栓；MCAO 组小鼠放置线栓阻塞大脑中动脉60 min后拔除线栓；4-PBA+MCAO组小鼠放置线栓阻塞大脑中动脉即刻腹腔注射内质网应激抑制剂4-PBA（3 mg/kg），药物的用法用量与课题组前期报道的实验方法一致9。1.4.2小鼠MCAO模型制备腹腔注射0.3%戊巴比妥钠（0.2 mL/10 g）麻醉小鼠。颈部正中切口，分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈内动 脉（internal carotid artery，ICA）和 颈 外 动 脉（external carotid artery，ECA）。将具有圆形尖端的单丝尼龙缝合线通过ECA残端插入ICA，并轻轻插入，以达到Willis环，阻塞大脑中动脉；闭塞60 min后，取出缝合线并开始再灌注。对Sham组小鼠进行手术操作但未阻断血流。在整个手术过程中，使用加热毯保持小鼠直肠温度在36.537.5。1.4.3BBB通透性检测MCAO后24 h，每组小鼠各取 5 只，经尾静脉注射 0.5%EB，剂量为 0.1 mL/10 g。循环1 h后，用0.9%生理盐水经心脏灌注处死小鼠，直到右心房流出的液体清澈为止。取脑组织，加入1 mL PBS，迅速匀浆，1 000g离心15 min。取上清液，使用酶标仪在波长632 nm条件下检测。根据标准曲线，测定EB渗出量。1.4.4水含量测定MCAO后24 h，每组小鼠各取5只，断颈处死后使用生理盐水冲洗采集的大脑，再用中性滤纸吸干表面的水分。取缺血侧脑半球，使用天平测定其湿质量，之后将组织在110 的烘箱中烘烤8312023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)24 h，并测定干质量。根据以下公式计算大脑的增水量：大脑增水量（%）=（湿质量干质量）/湿质量100%。1.4.5免疫荧光检测内皮细胞和周细胞之间的黏附情况MCAO 后 24 h，麻醉小鼠，用生理盐水通过左心室冲洗血液后，用 4%多聚甲醛灌注固定；随后取出全脑，继续用 4%多聚甲醛固定 612 h 并采用高糖溶液脱水；使用组织包埋剂包埋后切片，并用1%山羊血清封闭，CD31、CD13、actin一抗（均为 1 1 000）分别孵育过夜后，二抗（1 5 000）孵育，封片后显微镜下观察。CD31 标记血管内皮细胞，CD13标记周细胞。显微镜下观察CD31和CD13的标记情况以明确血管内皮细胞和周细胞之间的关系。1.5细胞实验方法1.5.1HBMEC 培养HBMEC 接种在 100 mm 培养皿（106个/皿），用含有 10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素溶液的 DMEM 培养基在 37、5%CO2条件下培养。用 1 mL 胰蛋白酶消化细胞 23 min，300g离心5 min，之后传代到新的培养皿中，消化后将细胞以 300g 离心 5 min，去除上清液，冷冻保存。1.5.2OGD模型建立弃去 HBMEC培养皿中的完全培养液，更换平衡盐溶液，置于 37、85%N2+5%CO2+0.02%0.2%O2密闭缺氧的培养箱中培养4 h；改用DMEM培养基，将细胞移入CO2培养箱中复氧（5%CO2+95%空气）24 h。1.5.3细胞实验分组细胞实验分为空白对照组（Blank 组）、OGD 组和 OGD+4-PBA 组。Blank 组正常 培 养 不 做 任 何 干 预；OGD 组 HBMEC 培 养 后OGD 处理 4 h；OGD+4-PBA 组 HBMEC 在 OGD 处理 4 h 后 即 刻 加 入 内 质 网 应 激 抑 制 剂 4-PBA（10 mmol/L）。1.5.4细胞活性和通透性检测使用CCK-8试剂测定细胞增殖。CCK-8溶液孵育细胞2 h后，用多功能酶 标 仪 在 450 nm 波 长 下 测 量 吸 光 度 值。采 用Transwell实验检测细胞通透性。每个迁移小室内加入100 L含1105个细胞的培养基，下室加入600 L培养基；24 h 后按照 Sham 组、OGD 组和 OGD+4-PBA组的要求分别对3组细胞进行处理，之后每个迁移小室加入10 L FITC-BSA（1 mg/mL），继续培养2 h。取100 L下室中的培养基，使用多功能酶标仪在495 nm的激发波长和525 nm的发射波长下测量荧光发射光谱。1.5.5 细 胞 内 ROS 水 平 测 定 活 性 氧（reactive oxygen species，ROS）水平通过CM-H2DCFDA荧光探针测定。细胞以 1104个/孔的密度接种在 96 孔板 中。PBS 洗 涤 后 在 37 下 用 20 mol/L CM-H2DCFDA孵育30 min，使用多功能酶标仪在495 nm的激发波长和 525 nm 的发射波长下测量荧光发射光谱。1.5.6细胞内钙离子水平测定按5105个/孔将细胞接种到6孔板。培养2436 h，OGD处理4 h后再培养24 h，PBS 洗 涤 2 次，加 入 Hank s 平 衡 盐 溶 液（Hank s balanced salt solution，HBSS）稀释的Fluo-3 AM工作液（1 200），30 孵育20 min；弃工作液，HBSS洗涤 2次充分去除残留的工作液，加入 HBSS在培养箱内继续孵育20 min，激光共聚焦显微镜拍照并使用Image J软件分析荧光强度。1.5.7蛋白质印迹法检测连接蛋白和内质网应激蛋白的表达水平收集细胞样本，裂解后使用BCA测定样本中蛋白的浓度。根据目标蛋白分子量大小选择浓度合适的蛋白电泳凝胶，进行蛋白电泳、转膜，然后封闭 1 h。分别使用 CHOP（1 200）、Caspase-12（1 2 000）、GPR78（1 500）、ZO-1（1 1 000）、claudin-5（1 5 000）、Wnt7（1 1 000）、-catenin（1 1 000）、actin（1 1 000）一抗孵育，放入4 摇床过夜；二抗（1 5 000）孵育后显影，用 Bio-Rad Chemidoc XRS+成像系统记录，使用 Image J软件进行灰度分析计算蛋白的表达水平。1.5.8ELISA检测HBMEC分泌PDGF-的情况收集细胞后用冷 PBS 洗涤 3 次，通过反复冻融裂解细胞标本后 1 500g 离心 10 min，收集上清液。在空白对照孔、待测样品孔及标准品孔中均加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的 PDGF-抗体和底物液，37 避光放置 35 min；每孔加入 50 L 终止液终止反应，加终止液后20 min内使用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度值，计算样品中 PDGF-含量。1.6统计学分析用 GraphPad Prism 8.3软件进行统计分析。定量资料采用xs表示。2组数据之间比较采用Tukey多重832董海平，等脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7/-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）比较检验，3组数据之间比较采用单因素方差分析。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1小鼠脑卒中后阻断内质网应激可减轻BBB的损伤与 Sham 组比较，小鼠 MCAO 24 h 后，脑缺血区 EB 渗出量明显增加（P=0.000），表明 BBB 通透性显著增加，BBB 功能被破坏（图 1A）。同时发现，与 Sham 组比较，脑缺血后脑水含量明显增加（P=0.000，图 1B）。我们还关注了 BBB 关键结构脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附状态。免疫荧光检测结果（图 1C）显示，MCAO 发生后脑血管内皮细胞和周细胞的标记蛋白CD31和CD13的重叠显著减少，表明周细胞从脑血管内皮细胞上脱离下来，BBB的完整性被破坏。为了探讨内质网应激在MCAO破坏BBB功能中的作用，我们在脑缺血即刻向小鼠腹腔注射内质网应激抑制剂 4-PBA，发现 4-PBA+MCAO组脑缺血区EB渗出量较MCAO组明显减少（P=0.011，图 1A），脑水肿程度也减轻（P=0.000，图 1B）；并且 CD31 和 CD13 的重叠明显增加，提示脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附性提高（图1C）。以上结果证实了MCAO导致BBB功能1 0008006004002000100806040200ShamMCAO4-PBA+MCAOShamMCAO4-PBA+MCAOEB/(ng.g-1)Brain water gain/%ShamMCAO4-PBA+MCAOABCDAPICD31CD13Merge10 m10 m10 mNote：A.EB exudation in the brain of mice.B.Water content of mice brain.C.Adhesion of cerebrovascular endothelial cells and pericytes in mice.Red arrows indicate overlap of CD31 and CD13.P=0.000,compared with the Sham group;P=0.011,P=0.000,compared with the MCAO group.图1小鼠脑卒中对BBB的损伤以及抑制内质网应激对该损伤的缓解Fig 1Injury of BBB after stroke in mice and the alleviating effect of endoplasmic reticulum stress inhibition on the injury8332023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)和结构明显受损，而阻断内质网应激可能可以有效减轻BBB的破坏程度。2.2抑制内质网应激可减轻 OGD 对 HBMEC 的损伤为探讨缺血缺氧对脑血管内皮细胞的作用，我们构建HBMEC的OGD模型进行进一步研究。如图2A和2B所示，与Blank组比较，经过4 h的OGD处理并24 h的复氧后，CCK-8实验测定的细胞活力明显下降（P=0.000），并且HBMEC对FITC-BSA的透过率显著增加（P=0.002）。内皮细胞分泌的PDGF-是对周细胞产生黏附的主要因子。因此我们观察了HBMEC分泌的PDGF-水平。ELISA结果（图2C）显示，OGD后 HBMEC分泌 PDGF-的水平下降（P=0.001），提示血管内皮细胞的分泌功能也受损，对周细胞的黏附功能削弱。蛋白质印迹法（Western blotting）检测结果（图 2D）显示，OGD 后 HBMEC 中的 ZO-1 和claudin-5的表达受到明显抑制（P=0.000），提示血管内皮细胞之间的紧密连接性降低。HBMEC复氧即刻使用抑制剂4-PBA阻断内质网应 激 后，发 现 与 OGD 组 比 较，OGD+4-PBA 组HBMEC的细胞活力明显提高，HBMEC对FITC-BSA的透过率得到改善（图2A、B）。4-PBA同样可以明显提高HBMEC分泌PDGF-的水平（图2C），提示血管内皮细胞的PDGF-分泌功能也得到改善，增强了对周细胞的黏附。4-PBA作用后 ZO-1和 claudin-5的表达水平明显增加（均P0.05，图2D），表明缓解内质网应激可以有效减轻OGD对脑血管内皮细胞的损伤，改善通透性，加强血管内皮细胞间的紧密度（图2）。2.34-PBA可缓解OGD引起的HBMEC内质网应激爆发为了探讨缺血缺氧对脑血管内皮细胞中内质网应激的影响，我们进一步检测 OGD 后的 HBMEC内质网应激情况。如图 3A 和 3B 所示，与 Blank 组比较，OGD 组细胞内 Ca2+水平明显增加，出现了钙超载，并且细胞的 ROS 水平也显著增加（均 P0.05）；使用了 4-PBA 后细胞内 Ca2+及 ROS 水平较1006040200BlankOGDOGD+4-PBABlankOGDOGD+4-PBABlankOGDOGD+4-PBABlankOGDOGD+4-PBABlankOGDOGD+4-PBABlankOGDOGD+4-PBA1.51.00.501501005001.20.90.60.301.20.90.60.30187 00018 00044 000ZO-1Claudin-5ActinCell activity/%FITC-BSA flux(fold of blank)PDGF-/(ng.mL-1)ZO-1/actinClaudin-5/actinABCDNote：A.Determination of activity of HBMECs by CCK-8 assay.B.The cell permeability of HBMECs analyzed with FITC-BSA leakage.C.Determination of the PDGF-secretion of HBMECs by ELISA.D.Determination of the expression of ZO-1 and claudin-5 in HBMECs by Western blotting.P=0.000,P=0.002,P=0.001,compared with the Blank group;P=0.026,P=0.005,P=0.042,P=0.000,P=0.001,compared with the OGD group.图2OGD引起的HBMEC损伤以及抑制内质网应激对该损伤的缓解作用Fig 2OGD-induced HBMEC damage and the alleviating effect of inhibiting endoplasmic reticulum stress on this injury834董海平，等脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7/-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）OGD 组明显下降（均 P0.05）。Western blotting 测定 OGD 后 HBMEC 内 质 网 应 激 相 关 蛋 白 的 表 达（图 3C），结果显示：与 Blank 组比较，OGD 组内质网应激相关蛋白 CHOP、Caspase-12 和 GPR78 的表达水平显著增加（均 P0.05）；加入了 4-PBA 之后各蛋白的表达水平均较 OG