第二章RNA的种类.doc

第二章 RNA的种类、结构与功能研究进展
一、RNA的研究史
1868年F.Miescher发现了核素(nuclein),到20世纪20～30年代人们确认自然界有DNA和RNA两类核酸,并阐明了核苷酸的组成。人们对核酸的研究，目光首先集中在DNA上,并于1953年提出DNA双螺旋结构模型。随后Crick提出了RNA的功能可能在遗传信息传递到蛋白质过程中起着中介作用的假说。1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分离出tRNA并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出假设。1961年Hall和Spiegelman用RNA－DNA杂交证明了mRNA与DNA序列互补,逐步阐明了RNA转录合成的机理。同年Brenner及Gross等观察到了在蛋白质合成过程中mRNA与核糖体结合的现象。1965年Holley首次测出了酵母丙氨酸tRNA的一级结构。特别是Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几位科学家破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码,之后的研究表明这套遗传密码在生物界具有通用性,从而认识了蛋白质翻译合成的基本过程。到此为止,人们还只是在“中心法则”的框架下认识RNA的功能（蛋白质模板、运转工具、场地）。1970年Temin和Baltimore同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶,使得Crick对中心法则进行了修改。
1977年麻省理工学院的Phillip Sharp和冷泉港实验室的Richard Roberts等人发现了断裂基因,揭开了认识真核基因组结构和调控的序幕。Cech等在1981年发现了四膜虫26S RNA前体的自我剪接反应,同时提出RNA具有酶活性的概念，并称这种具有催化作用的RNA为核酶。核酶的发现可以说是打开了人们认识RNA本来面目的一扇窗子。1983年Altman又发现在较高阳离子浓度下,RNase P中的RNA本身即可催化rRNA前体成熟,而其参与复合体的蛋白组分却不具备此功能。从此有关RNA的结构与功能的研究成了热点,新的发现层出不穷。
近年来，有关RNA干扰和基因沉默机制的研究揭示了基因的一种新的调节模型。随着基因组研究的深入，尤其是“DNA元件百科全书”计划的完成之后，有关人类基因组的传统理论受到了挑战。首先，人类基因组并不是由孤立的基因和大量“垃圾DNA”组成的，所谓的垃圾基因实际上非常少。其次，基因组可以普遍转录非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)，如人类基因组93%的序列都能够转录，其产物就主要为ncRNA。
这些ncRNA与生物的代谢、发育、分化、进化等有密切关系，对它们的深入研究，将有助于我们更好的认识生物的进化的模式、基因表达的调节机制和生物发病机理等诸多现在还没有彻底解决的问题。
考察RNA的研究历史，有过两个研究高潮时期：
第一个高潮在20世纪的50～60年代,1953年,Watson、Crick提出双螺旋结构假说。此后,为了解决遗传信息是如何从DNA传递到蛋白质的问题,形成了RNA研究的热潮。比如，1958年提出“中心法则”，1957年、1959年和1961年分别发现了tRNA、rRNA和mRNA,1966年破译了遗传密码。还有RNA的酶促合成,tRNA一级结构测定等,这些成果分别获得了1959年度、1969年度诺贝尔生理与医学奖。这个时期的局限在于,对RNA生物功能多样性认识不足。因为70年代后,人们对于生物大分子的注意力更多地集中于DNA和蛋白质方面。
第二个研究高潮开始于20世纪的80年代。1981年Cech发现四膜虫大核rRNA前体内的转录内含子是通过自动剪接被除去的。这一反应不需要传统意义上的生物催化剂－酶。催化该反应的是RNA,RNA也可作为生物催化剂,他命名这种RNA酶为Ribozyme(核酶)。核酶的发现首先突破了统治生物学超过半个世纪的一个信条－酶即是蛋白质。其次,核酶的发现解决了生命起源过程中长期争论无休的问题:生命起源中,先有蛋白质还是先有核酸。因为核酸携带遗传信息,没有核酸则没有蛋白质；但是蛋白质是生命的功能分子,没有蛋白质,核酸无法合成。核酶的发现表明,RNA既可携带遗传信息,又可作为功能分子,生命起源过程中,可能最早出现的是RNA。最后,也是最重要的,核酶的发现扩宽了人们视野,认识到RNA的生物功能并不局限于遗传信息的传递，RNA在生命活动中还有许多重要的功能。促使人们重新认识RNA在遗传信息传递过程中的作用,从而开始探索RNA生物功能的多样性和重要性。
在RNA的种类方面，到目前为止,除了rRNA、mRNA和tRNA,人们还发现了cRNA、genome RNA、guide RNA、tmRNA snRNA、snoRNA、端粒酶RNA、SRP-RNA等10多种大类的RNA分子。
二、RNA的种类：
1、rRNA；
2、tRNA；
3、mRNA
除了上面的三种RNA外，现在人们还发现了其他几种RNA分子：
4、 具有催化作用的RNA，即核酶(ribozyme)和其它RNA自我催化分子。功能：可作为RNA拟酶和其他RNA自我催化分子。
5、 基因组RNA（genome RNA），功能：一些病毒以RNA做为遗传物质。
6、 指导RNA（guide RNA），功能：指导RNA编辑。
7、 mRNA样非编码RNA，其转录和加工方式与mRNA相同，但不作为蛋白质翻译的模板。功能：参与基因调节。已知这类RNA有20多种,例如人的xistRNA和X染色体的XIST位点结合,使此X染色体失去转录活性。
8、 tmRNA，功能：既是tRNA，又是mRNA，身兼二职。如大肠杆菌中的10SaRNA。大肠杆菌基因组编码的10S RNA是由两种大小相同而结构功能迥然不同的10Sa和10Sb RNA组成。10Sa RNA共363个核苷酸,其结构很像tRNA,3’端携带有丙氨酸,当大肠杆菌一些缺陷蛋白质的翻译到达C端时,核糖体的P位被10Sa RNA占据,把丙氨酸加在新生肽的生长点上,核糖体转而把10Sa RNA作为mRNA继续翻译,译出一个10肽,到达UAA而终止,成为具有11个氨基酸残基的标签肽。10SaRNA因为兼有tRNA和mRNA的功能,称为tmRNA。另外,紫细菌A亚群等20种亲缘关系较远的真细菌和某些叶绿体都有tmRNA。
9、 端粒酶RNA，功能：为真核细胞染色体端粒复制的模板。
10、 小胞质RNA(small cytoplasmic RNA，scRNA)，存在于细胞质中的小RNA分子。如信号识别颗粒(signal recognition particle, SRP)组分中含有的7SRNA。功能：作为SRP的组分，与细胞内蛋白质的运转有关。
11、 小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)。功能：是RNA剪接体的组分，参与RNA的剪接。
12、 核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)，功能：参与rRNA的加工，并指导rRNA上特异位点的甲基化或假尿嘧啶化。
13、反义RNA(antisense RNA)，可通过与靶位基因编码的RNA结合，或直接阻止靶基因功能，或改变靶部位构象而影响其功能。
三、 RNA的结构：
RNA的一级结构为直线形多聚核苷酸：核苷酸之间也是由3’，5’磷酸二酯键连接。绝大数天然RNA分子为单链分子，二级结构只有一些短的双螺旋区域。双螺旋区每绕轴一周有11个碱基对，与A-DNA的结构相同，而与B-DNA不同。
tRNA的结构特点：由74～93个核苷酸组残基组成，含有较多的稀有碱基，3’-末端均为四碱基的单链区（…NCCA-OH），5’-末端大多数为pG…，也有pC…，而且总是碱基配对的，tRNA的二级结构一般都呈三叶草形，由氨基酸接受臂、二氢尿嘧啶环和反密码环组成。
mRNA的结构特点：真核与原核细胞的mRNA结构有所不同。（1）真核细胞mRNA 5’端有帽子结构，而原核细胞的mRNA没有帽子结构。（2）真核细胞的mRNA还有一个多聚腺苷酸尾巴。
rRNA：原核生物的rRNA有三种：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA，其中5SrRNA 和23SrRNA 组成大亚基，16SrRNA 参与小亚基的形成。真核生物的rRNA有5SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA（组成大亚基）、18SrRNA参与小亚基的形成。植物细胞中没有28SrRNA，而是25SrRNA。
通过对大肠杆菌5S rRNA的分析发现其上有两个高度保守的区域：CGAAC（图 ）GCGCCGAUGCUAGU。在蛋白质合成过程中CGAAC与tRNA上TψC环上的GTψCG顺序相互识别。第二个保守区与23S rRNA中一段12个核苷酸的顺序互补。真核生物5S rRNA结构与原核的相似，但没有CGAAC这个保守序列。
四、 RNA的功能
迄今为止所发现的RNA的功能可以归纳为以下几个方面：
1.RNA作为病毒基因组
在有些病毒中不含DNA,而是以RNA作为遗传信息的携带者。
RNA病毒的种类很多,单链RNA病毒(含有正链或负链RNA),双链RNA病毒(含有正链和负链RNA),能通过复制合成出与自身相同的分子,并产生子代。不同的RNA病毒复制方式也不相同。例如：逆转录病毒以RNA为模板,按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA,在整合酶帮助下可整合到宿主DNA内,成为前病毒,可随宿主染色体DNA一起复制和转录。这类病毒侵染细胞后并不立即引起细胞死亡,却可以使细胞发生恶性转化,能使鸟类和哺乳类等动物患白血病或产生肉瘤或其它肿瘤。
以RNA为基因组有其固有的弱点，胞嘧啶C经氧化脱氨就成为尿嘧啶U,与原来的U将无法区分,遗传物质的稳定性维持困难（病毒变异快）。
2.RNA在蛋白质生物合成中起重要作用
蛋白质生物合成是生物体最重要也是最复杂的代谢过程,mRNA起信使和模板的作用,tRNA起转运氨基酸和信息转换的作用,rRNA起核糖体装配和催化的作用。现在的研究表明,多肽合成中，催化肽键形成的肽基转移酶活性由大亚基与rRNA共同承担的,打破了以往认为rRNA在核糖体中只起装配支架作用的看法。三类RNA密切配合,在许多蛋白质因子参与下共同完成这一过程。
3.RNA参与转录后加工、编辑和修饰
RNA转录后的加工、编辑和修饰依赖于各类小RNA和其蛋白质复合物。
在mRNA前体的加工过程中,要形成剪接体以除去内含子。需要snRNA（小核RNA）U1、U2、U4、U5、U6五种(U3参与rRNA前体加工),snRNA与59种蛋白质结合成小核糖核蛋白(snRNP)。由snRNP组装成的剪接体可对mRNA前体的内含子进行正确的剪接。
RNA编辑是指RNA转录后通过磷酸键的断裂和再连接反应插入或删除若干核苷酸,或通过酶促脱氨和氨基化反应改变碱基,因而改变模板DNA的编码信息。现在发现有些生物线粒体mRNA的编辑受指导RNA的指导,指导RNA长50～70个核苷酸,5’端有一段长十几个核苷酸的锚定区,和mRNA前体互补配对,3’端是寡聚U尾,可以和mRNA前体编辑位点上游富含嘌呤的区域配对,保持两者相互联系,提高编辑效率。编辑由mRNA前体的3’端向5’端进行,数种指导RNA溯流而上,或各指导RNA各管一段分别编辑。mRNA前体分子上遇到和指导RNA上的A或G不能配对的空缺,则在mRNA前体上添加U,二者互补配对多余的U则删去,以求和指导RNA互补。有人认为RNA编辑与剪接过程类似,可能也需要在被编辑的mRNA分子上由指导RNA和蛋白质装配成编辑体来完成编辑过程。
核仁小RNA(snoRNA)与rRNA前体的加工有关,这些snoRNA不是由其单独的基因所编码,而是由蛋白质基因切除的内含子片断加工而成。有些snoRNA与rRNA有区段性序列互补,可与rRNA前体结合。如果失去或钝化某种snoRNA后,则rRNA前体不能加工为成熟的rRNA。
另外,rRNA中的碱基修饰包括甲基化、假尿嘧啶化都要由snoRNA参加完成,这种修饰可能与rRNA折叠和核蛋白的结合有关。
4.RNA具有重要的催化功能
20世纪80年代初由Cech和Altman首先发现RNA具有催化功能,随后陆续发现一些RNA分子在复制和转录后加工中具有酶活性。第一种催化类型：催化分子内反应,包括自我切割、自我剪接、自我环化等,如I型和II型内含子的去除。第二种催化类型：不能独立完成，催化分子间反应的RNA(核酶)通常都与蛋白质结合,形成核糖核蛋白复合体,如RNase P、1,4-a-葡萄糖分支酶、马铃薯邻苯二酚氧化酶等都是由RNA和蛋白质组成,从这些复合物中分离出的RNA,有些单独即具有催化活性。另外,核糖体、剪接体也可以看成是核糖核蛋白复合体。充分表明生物体存在多种RNA催化方式。
5.RNA对基因表达和细胞功能具有重要调节作用
（1）反义RNA可以通过互补作用与特定的靶序列（RNA）结合,结合位置包括mRNA结合核糖体的SD序列和起始密码子AUG,从而抑制mRNA的翻译。（2）RNA干扰是由双链RNA介导的、引起特异mRNA的降解,抑制有关基因的表达的现象。这两种基因表达的调节方式不仅有重大的理论意义,而且有广阔的应用前景。有的科学家试图将反义RNA的基因引入家畜和农作物以获得抗病毒的新品种,或利用反义RNA抑制有害基因(如癌基因)的表达。
6.RNA在生物进化中起重要作用
生物进化的流行观点：RNA既是信息分子又是功能分子,表明最初的生化系统可能是以RNA为核心的。但是在后来的进化过程中，折叠多肽的天然柔韧性与RNA碱基配对的较大的刚性相比较,显然蛋白质的催化更有效。因此细胞内的催化功能由RNA催化转向主要由蛋白质负责,原RNA基因组不再直接负责生化反应,而成为编码分子。但RNA作为编码分子也不占优势，因为其2-OH基团间接作用引起的RNA磷酸二酯键的相对不稳定性。因此,编码功能向更稳定的DNA分子转移。DNA双链作为编码分子使DNA分子进一步稳定,因为一些损伤可以通过互补链进行修补。
至于这个过程，有人推测,最初的DNA基因组由许多分散的分子组成,每一分子确定一种蛋白,每个DNA相当于一个单独的基因。这些基因连接到一起形成最初的染色体(可能发生在原基因组向DNA转变之前或之后),保证了细胞分裂时基因分配的效率,因为大的染色体平均分配要比平均分配许多分散的基因容易得多。由于DNA分子的这些优越性，RNA又把编码遗传信息的功能交给了DNA。但在生物的进化过程中，RNA应该是最早出现的，然后由RNA世界到RNA-蛋白质世界,由RNA-蛋白质世界到DNA世界的进化路线,已经被广泛接受。
五、 RNA干扰的作用机制及应用前景
RNA干扰(RNA interference, RNAi) 是近十几年发展起来的一项基因表达新技术,被《Science》杂志评为2001年十大科技突破之一,2002年，《Nature》也将其评为年度十大科技之首。理由：RNA干扰可以阻断特定基因表达,因此在阐述基因功能以及蛋白质相互作用等方面,展示了广阔的前景。同时RNA干扰在基因治疗中也有巨大潜力。由于对RNAi的突出贡献, Andy Fire获得了2006年的诺贝尔医学/生理学奖。
RNA干扰的发现源于1995年康奈尔大学Guo和Kemphues博士试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中par-1基因表达研究时意外发现的。
他们利用反义RNA技术试图阻断秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，同时在对照组实验中给线虫注射正义RNA，以期观察到基因表达增强的结果，但他们却发现两者均抑制了par-1基因的表达。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。当时，该研究小组一直未能对这个意外的结果给予合理的解释-体外注射正义RNA不但不增加该基因的表达,反而使该基因表达受到阻断。
随后1998年华盛顿卡耐基研究院的Fire A等解释了此现象,认为这种特定基因表达受抑制的现象是由于污染了微量dsRNA所引起的,他们将正义链和反义链的混合物(含有双链RNA,即dsRNA)注入线虫,结果表明,基因表达受抑制的程度比单独注入正义链或反义链要强的多。他们将这种由dsRNA所引起的基因表达受抑制的现象称为RNA干扰或RNA干涉,由于基因的功能无法表达而不能显现,故又将此现象称基因沉默(gene silencing)。正是这项dsRNA引起了基因沉默（RNA干扰）实验,由此揭开了RNAi的研究序幕。随着研究的不断深入,人们断定RNAi现象广泛存在于各种生物体,并且是参与细胞防御与分化调控的机制之一。现在研究证明,RNAi现象存在于各种无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物中,例如果蝇、锥虫、涡虫、水螅、线虫、斑马鱼以及小鼠,甚至在原核生物如大肠埃希菌中都广泛存在。RNAi是转录后调控的一种重要机制，此过程所涉及的酶在不同物种间具有高度同源性，与通常所说的基因敲除相比,RNAi所导致的基因沉寂速度快,更有效,并且更适于用来研究同源基因的功能。
（一）RNA干扰：RNAi(RNA interference),或RNA干涉,是指由外源或内源性的双链RNA (double-starand RNA,dsRNA)导入细胞而引起的与dsRNA同源的mRNA降解,进而抑制其相应基因表达的现象。
（二）RNAi的作用机制
RNAi的作用机制尚未完全清楚,据目前的研究成果来看主要有3种形式,即转录水平、翻译水平和转录后水平。其中转录后水平是RNAi在各种生物中实现的主要方式,其机制研究也较深入。
1、 转录水平上的干扰机制
转录水平上的干扰机制是通过对靶基因染色质结构的改变,使其基因转录受限,导致表达系统的关闭。首先是dsRNA被降解成21个～23个核苷酸长的小片段RNA,这些小的RNA分子在细胞核中可以诱导组蛋白H3的基因及相应DNA的甲基化。这种序列特异性甲基化的信号与RNA和DNA结合有关。当dsRNA含有与启动子同源的序列,可使同源靶启动子序列甲基化,从而使靶启动子失去功能,导致下游基因沉默,则转录不能进行。
2 翻译水平上的干扰机制
是通过抑制相应mRNA的翻译,使相应的蛋白质表达受阻。在细胞内RNAi可以与相关蛋白结合成RISC复合体（RNA诱导沉默复合物，RNA induced silencing complex, RISC)，然后RISC复合体识别并结合在mRNA的3’末端非翻译区上,阻止核糖体与mRNA的结合及核糖体的移动,从而抑制翻译的进行。
3 转录后水平
目前,在有关RNAi发生机制的研究中,转录后水平上的干扰是研究的最多、最清楚的一种机制。其作用大致可分为以下两个阶段：
（1)siRNA（小干扰RNA）形成阶段：
外源性(如病毒RNA复制的中间体或人工导入的dsRNA)或内源性(如细胞中单链RNA在RdRP（RNA-引导的RNA聚合酶）的作用下形成的dsRNA)dsRNA通过一类特异蛋白质（Argonaute家族基因编码）的识别,诱导dsRNA与Dicer(RNase)结合。[目前已经分离出多个Argonaute家族蛋白,包括线虫中的RDE21,果蝇中的AGO21、AGO22、Aubergine,锥虫中的TbAGO1和TbPWI1,人类细胞中的PI2WI亚族(4个)和eIF2C/AGO亚族(4个)]。dsRNA和Dicer结合后,在ATP的参与下被Dicer酶(RNase)切成21nt～23nt长度的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)。
Dicer（核酸内切酶）：是BernsteinE等（2001）从果蝇中分离出一种能特异性降解dsRNA的核酸酶,属于RNase核酸酶家族成员。Dicer具有以下结构域,即与Argonaute家族蛋白同源的PAZ区域、III型RNA酶活性区域、dsRNA结合区域以及DEAH/DExHRNA解旋酶活性区,在其进化中高度保守。试验发现, Dicer在对dsRNA分子降解时,2个Dicer能够形成二聚体。每个二聚体包括4个活性中心,在降解RNA时其中的2个要失活,从而使降解过程间隔进行。这个间隔正好为22个核苷酸,即每隔22个核苷酸Dicer将dsRNA降解一次。然而,Dicer结构上的微小改变将会引起间隔的改变,所以不同的物种产生的siRNA长度也略有不同（21－23nt）。

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Fig. 2.
Crystal structure of Giardia Dicer. (A) Front and side view ribbon representations of Dicer showing the N-terminal platform domain (blue), the PAZ domain (orange), the connector helix (red), the RNase IIIa domain (yellow), the RNase IIIb domain (green) and the RNase-bridging domain (gray). Disordered loops are drawn as dotted lines. (B) Close-up view of the Dicer catalytic sites; conserved acidic residues (sticks); erbium metal ions (purple); and erbium anomalous difference electron density map, contoured at 20σ (blue wire mesh). Dashed lines indicate distances described in the text.
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· MacRae等2006年完成了Dicer酶的分子结构图，这是第一张清晰的分子结构图。 文章发表在2006年1月13日出版的Science杂志上。
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o ② 机理：由Dicer切割后的双链siRNA由解旋酶打开，一条链与蛋白复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)。RISC结构复杂，它由多种蛋白质成分组成,包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性酶等。当RISC与细胞中互补的靶mRNA结合,在酶的催化下切割、降解mRNA,从而达到干扰基因表达的作用。Zamore 等（2000）报道,无活性RISC存在于胚胎细胞中,并以250ku分子质量的前体形式存在,在ATP激活下加工成100ku的RISC,切割底物mRNA。
Billy E等（2001）在小鼠畸胎瘤细胞F19和P19的细胞质提取物中发现长727bp的dsRNA被剪切为约21nt～23nt片段,即siRNA,其强烈抑制了同源基因的表达。Elbashir SM等（2001）从发生沉默的果蝇细胞中分离出siRNA,可在果蝇胚胎裂解液和果蝇S2细胞中(标准果蝇细胞系)诱发特异性的基因抑制。
Dicer切出的siRNA两条链末端均为5’-P和3’-OH,3’末端各有两个突出的核苷酸（UU）。

(三)RNAi作用特点：
1、高序列特异性
RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，19 nt的dsRNA几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的1 nt突变后，它对基因的抑制作用就消失了，这种高度的序列特异性能够使dsRNA非常特异地诱导与之序列同源的mRNA降解，避免降解与目的mRNA同家族的其他mRNA，从而实现对目的基因的精确沉默。因此，RNAi具有重大的医学价值。
2、高效性
RNAi存在级联放大效应，由于Dicer酶切产生的siRNA与同源mRNA的结合并降解后者，产生新的siRNA；新产生的siRNA可再次与Dicer酶形成RISC复合体，介导新一轮的同mRNA降解的多次利用，如此循环，使得相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能产生强烈的RNAi效应，并可达到缺失突变体表型的程度。
3 、RNAi抑制作用迅速
RNAi发生在转录后，通过细胞质中同源mRNA的快速降解，最终使该基因缺少mRNA而无法产生蛋白质产物。
4、 RNAi作用的靶基因位点有选择性
外源性dsRNA的转入只对成熟mRNA产生作用，对mRNA前体没有或很少有影响，以内含子或启动子序列构成的外源dsRNA无法引起RNAi效应。
5、具有高稳定性
与反义RNA不同，siRNA是3＇端悬挂TT碱基的双链RNA，所以化学性质很稳定，无须像反义RNA那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期。
（四）RNA干扰的应用前景
1、抗病毒感染方面：
dsRNA出现在许多病毒(包括单链RNA病毒) 感染的细胞内,诱发RNAi,封闭病毒生存和繁殖所必需的基因,产生抗病毒效应。Gitlin等证实他们将人与小鼠的细胞事先用siRNA加以处理,发现这些细胞能显著抑制脊髓灰质炎病毒的增殖,对病毒的清除能力也大大提高。Bitko等利用RNAi技术对呼吸道合胞病毒(RSV)基因成功地进行了抑制,达到了抑制病毒感染的目的。
口蹄疫病毒(FMDV)的抑制：Kahana R等分析了所有已发表的口蹄疫病毒(FMDV)序列,设计出3个siRNA片段,进行处理。然后应用实时定量PCR方法检测感染细胞中病毒RNA的总量,结果表明,利用siRNA处理的细胞病毒增殖被抑制,检测发现,3个siRNAs混合转染的抑制效率达100%。Liu 等根据FMDV基因组的保守区设计siRNA序列,结果转染siRNA后48 h内可以使BHK-21细胞系FMDV血清型O型的效价下降10倍～1 000倍,而且这种抑制作用可以持续到转染后第6天。Chen 等根据FMDV的VP1基因设计siRNAs序列,转染BHK-21细胞及颈部注射小鼠模型,结果对细胞中病毒VP1表达的抑制效率达80%～90%,BHK-21细胞在转染了siRNA质粒后48 h内具有抵抗FMDV感染的能力,且处理组小鼠对该病毒的敏感性比对照组降低。
2、基因治疗和抗肿瘤方面：
RNAi作用的高度特异性,有可能特异地抑制致病的突变等位基因,但又不影响正常等位基因功能,所以RNAi在基因治疗上有广阔的应用前景。2006年Zimmermann等通过RNA干扰技术,首次在灵长类动物猴活体中沉默了一个与猴致病相关的基因,从而开创了RNAi活体全身用药(systemic administration)研究。他们将载脂蛋白(apolipoprotein B, ApoB)基因的siRNAs包裹在微脂胶囊中,通过单注射(single injection)入猕猴中,微脂胶囊外壳可有效防止siRNA被降解。猕猴在注射24 h后作出反应,这种情况能够持续了11 d。RNA干扰可以降低动物总有害胆固醇30%～40%。该试验首次证明了通过RNA干扰的可注射药物来降低灵长类动物胆固醇含量是可能的。此项研究对于冠心病等高胆固醇相关疾病的治疗具有重要意义。
在临床试验方便也取得了重大突破。2006年美国费城Acuity制药公司首次在RNAi临床试验方面初获成功。Acuity制药公司于2006年6月1日美国基因治疗学会上首次公布了评估RNA干扰疗法对人类患者效果的临床II期试验的初步结果,并且向FDA提交了第一个利用RNA干扰技术研制而成的药物Bevasiranib的新药申请。药物成分为一小分子干扰RNA,通过RNA干扰作用可关闭促进血管过度生长的基因的表达,从而阻断血管内皮生长因子(VEGF)的生成。VEGF是新生血管性黄斑部病变(wetAMD)和糖尿病患者视网膜病变发生时的一个主要刺激物。通过对129名患者的试验,发现Bevasiranib能够减缓患者眼睛中血管的生长并改善视力,在最低剂量时药效也能持续数月,没有观察到其他任何明显不良反应。虽然试验数据有待进一步验证,但这项试验的成果仍是利用RNA治疗的一个里程碑,为深入进行各种疾病的基因治疗研究提供了重要的参考。

3、在寄生虫基因功能研究和抗寄生虫药：
研究表明,多种寄生虫内均存在RNAi的现象，RNAi技术已成功地应用于多种寄生虫和媒介昆虫。迄今,运用RNAi技术已鉴定了多种布氏锥虫基因的功能, Marcelo等用RNAi研究布氏锥虫的Trys基因,发现Trys被抑制后,T(SH2)和GSP被消耗,GSH积聚,细胞H2O2明显增加,同时伴随着发育和繁殖受损。因此,他们认为Trys可成为抗锥虫药物作用的一个靶点。W illiam等对伊氏锥虫的AT1进行研究时,发现AT1能控制腺苷的运输,对AT1进行RNAi可致杀灭锥虫的效应。
4、在免疫性疾病方面： 类风湿性关节炎是一种和自身免疫相关的慢性疾病。用电穿孔的方法将α-肿瘤坏死因子(TNF-α)的干扰载体转入胶原诱发性关节炎 小鼠关节内，能抑制TNF-α的表达，减轻关节内的炎症。这表明RNAi技术可以成为治疗类风湿关节炎的新方法。
5、基因功能研究：RNAi可以高度专一性的抑制生物体内基因的表达，因此可以作为一种十分有效的手段，帮助我们进行基因功能的研究。
目前利用RNAi技术进行大规模的基因功能分析已经在线虫和果蝇中取得成功。针对于哺乳动物细胞某些已知基因RNAi序列的文库已经可以商业化获得,因而也促进了这一技术在哺乳动物细胞上的应用,例如AzaBlanc等利用Pharmacon公司生产的针对510个基因的siRNA的文库,通过转染HeLa细胞,发现了一些新的能对细胞凋亡有调控作用的基因;Berns等构建了针对7914个基因的人RNAi文库,应用该文库进行基因功能研究,发现了5个未知的在p53依赖的增殖抑制中起调控作用的基因;Zheng等则构建了针对8 000个基因的siRNA文库。
6、其他应用：
RNAi还可用于细胞周期调控、代谢、膜转运以及DNA损伤反应、转录或甲基化等多种方面的基因功能研究。
RNAi在作物品质改良中的应用：
随着人们对植物物质代谢途径的认识,使得在分子水平改良作物品质已成为可能。随着RNAi机理的不断阐明及将dsRNA引入植物细胞的方法取得成功,采用RNAi技术进行作物品质改良已显现出巨大的潜力,目前,利用RNA沉默技术已经成功地进行了多种作物不同方面的品质改良,主要表现在以下几个方面。
利用RNAi调控某一物质含量以提升作物品质：
① 改善油脂的品质：　Stoutjesdijk等在拟南芥Fad2基因的hpRNA介导的基因沉默研究中证明,抑制效果可在子代稳定传递,在此基础上,用RNAi技术将△12脂肪酸脱氢酶基因沉默,使甘蓝型油菜和芥菜型油菜中的油酸含量分别升高到89%和75%。Liu等利用RNAi技术对拟南芥及棉花Fad2基因的表达调节研究表明,再生的转化植株中Fad2基因表达的抑制率可达100%,并利用该技术分别将棉花籽油中硬脂酸含量从非转基因的2%～3%提高到40%,油酸含量从15%提高到77%。
② 改良淀粉品质：　淀粉是重要的工业原料,但是生产不同产品所需淀粉种类有所差别,如何针对工业生产所需来提高作物某一类淀粉的含量以降低原料纯化的成本,是作物遗传育种要解决的一个重要问题。利用RNAi技术改变代谢的物质流方向,来提高工业加工原料在作物中的含量,无疑是一种十分有效的方法。柴晓杰等率先克隆了玉米淀粉分支酶(SBE)基因,并通过RNAi调控该基因,得到总淀粉含量与对照之间基本没有差异,但直链淀粉的含量提高了约50%的转基因玉米植株。Regina等利用RNAi技术抑制了小麦SBEIIa和SBEIIb基因表达,使籽粒直链淀粉含量提高到70%以上,并用其进行小鼠饲喂实验,结果表明与普通标准淀粉相比该淀粉有利于人类健康。
陈忠正通过RNAi转基因技术,沉默水稻sbe3基因,导致胚乳中sbe3基因的表达水平明显受到抑制,可望培育出高直链淀粉含量的水稻。
③ 利用RNAi提高果实耐贮性
采用基因工程技术提高果实耐贮性,主要是以SAM水解酶、ACC合成酶、ACC氧化酶、ACC脱氨酶等酶的基因为靶基因使其沉默,从而达到果实耐贮的目的,其中以ACC合成酶和ACC氧化酶基因研究较多,Xiong等构建了含有ACC氧化酶基因的序列的RNA干扰载体用于转化番茄,结果有69%的转化植株表现出100%的干扰效果,18%的植株表现出50%的干扰效果,果实从破色期到成熟期依次需要120d, 30d,而对照只有5d。
陈银华构建了番茄ACO的RNA干涉载体,对获得的转基因植株中乙烯生成量测定结果表明,RNAi结构的导入大大抑制了内源ACO基因的表达,从而导致乙烯的生成大大降低,可见,RNAi技术能非常有效地抑制靶基因的表达,是改良番茄耐贮性的有效手段。此外,人们利用RNAi技术对柿果、砂梨、百合、花椰菜等的ACC氧化酶基因进行抑制研究,以延长果品的贮藏期或延缓果品衰老,并取得了一定的进展。利用RNAi技术调控果实成熟,不仅具有重要的理论意义,而且具有巨大的经济效益和应用前景。
六、miRNA（micro RNA）的研究进展
miRNA（micro RNA）是新近发现的一类小RNA分子,它们是一类具有时空特异性表达模式的非编码小分子RNA，命名为micro-RNA(miRNA)。它与小干扰RNA(small interference RNA)同属于非编码RNA(non-coding RNA)。由于miRNA对生命活动有重要调控作用,所以成为siRNA之后新的研究热点之一。迄今为止,在植物、线虫、果蝇和哺乳动物中已发现了一千多个miRNA基因。

1、 miRNA的形成和结构
miRNA广泛地存在于多种真核生物中,从低等生物到人类都有其存在的痕迹。它是一类长度为21～25nt的单链RNA分子片段,属于非蛋白编码RNA。
① 形成: 关于miRNA的形成现在了解还不多,其形成与siRNA相似,同样也需核糖核酸酶(Dicer)和Argonaute(PIZ/PIWI)家族蛋白质的存在。根据一些miRNA间的联系密切,因此推测这些RNA可能是作为一个转录单位而被转录的。据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤:
第一、由长的内源性转录本生成70nt的miRNA前体(pre-miRNA)；
第二、将pre-miRNA加工为成熟的miRNA。此外,亚细胞定位研究证明这两个生物过程分别局限于细胞核和细胞质内,因此,细胞中一定还存在一转运体系,将pre-miRNA从细胞核运送至细胞质。
miRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性。在不同组织中有不同类型的miRNA表达,另外在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达。例:mir-1专一地表达于人类的心肌组织,在其他组织中检测不到；mir-1的表达还具有阶段性,只在胚胎形成阶段可以探测到其存在。
② 结构：Pre-miRNA是由内源性基因间区的DNA反向重复序列转录而来,它是一种长约70nt的非编码RNA,据推测Pre-miRNA结构可能为茎-环结构即发夹状结构。Pre-miRNA在Dicer的作用下可被剪切成miRNA。实际上miRNA只是pre-miRNA茎中的一个臂。Dicer可以剪切pre-miRNA 5’端的一个臂,也可以剪切3’端的一个臂或者是同时剪切两个臂。

例如lin4、let7及miR84是定位于pre-miRNA 5‘端的序列；miR1是定位于前体3’端的序列；miR56和miR56*是同一折叠结构的产物,分别从这一结构的两个臂剪切而来。miRNA和siRNA都是经Dicer作用而形成的产物,也称为Dicer产物。miRNA/siRNA与其他的寡核苷酸相比,主要有三点不同:a：产物长度约为22nt;b：5’端是磷酸基；c：3’端是羟基。通过对比从E.coli中克隆的RNA片段发现,miRNA有独特的长度和序列特征,这在其他小RNA中是尚未发现的。通常miRNA的长度与Dic