细菌耐药机制huishi.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,细菌耐药机制研究进展,浙江大学医学院附属第一医院,俞云松,1,.,2,.,3,.,一、外膜孔蛋白减少或丢失,细胞内抗生素浓度降低,膜孔蛋白(,OprD):,4,.,细胞外膜上的某些特殊蛋白是一种非特异性的、跨越细胞膜的水溶性物质扩散通道。,膜 孔 蛋 白,5,.,革 兰 阴 性 细 菌 细 胞 膜,6,.,某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为,“内在性耐药”,或“固有性耐药”（,intrinsically resistant），,即这种耐药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所致。,如,铜绿假单胞菌,的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1%。,“先天不足”,7,.,一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的,孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失,，则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。,亚胺培南是一种非典型的,-,内酰胺类抗菌药物，主要是通过一个特殊的孔蛋白通道,OprD2,的扩散进入细菌的，一旦这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。,“后天获得”,8,.,产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株,9,.,亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌,PFGE,图,C1 C2:,亚胺培南敏感,C3 C4:,亚胺培南耐药,10,.,亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌,SDS,图,C1 C2:,亚胺培南敏感,C3 C4:,亚胺培南耐药,11,.,PCR,扩增,Omp36,全长及序列分析,IS903 98%,（约1000,bp),12,.,插入序列引起,OprD2,缺失（铜绿）,ISPa1328,约2000,bp,OprD2,13,.,细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位之前失去活性,细菌产生的灭活酶主要有：,-,内酰胺酶,氨基糖苷类钝化酶,氯霉素乙酰转移酶,MLS,钝化酶,二、产生灭活酶,14,.,超广谱,-内酰胺酶（,ESBLs,）,高产,AmpC,酶,碳青霉烯酶,最主要的耐药因素,对,-内酰胺抗生素造成威胁,-内酰胺酶,临床上最重要的,-内酰胺酶,15,.,是,质粒,介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨基,-,内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被克拉维酸等,-,内酰胺酶抑制剂所抑制的一类,-,内酰胺酶。,ESBLs,在分子生物学分类中属于,A,类酶，在,Bush,分类中属于2,be,类酶。,超广谱,-内酰胺酶,（,extended-spectrum,-lactamases，ESBLs）,16,.,ESBLs,的分类,根据基因同源性不同分为：,TEM,型 80,SHV,型 46,CTX-M,型 37,OXA,型 18,其它型 20,www.lahey.org/studies/webt.htm,.,CTX-M-1,组,CTX-M-2,组,CTX-M-8,组,CTX-M-9,组,17,.,中国400株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型分布,18,.,32家医院 1994-2003年大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产,ESBLs,百分率,19,.,头孢菌素酶,大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导的,AmpC,酶。,20,.,阴沟肠杆菌,21,.,ACT-1,DHA-1,CMY,(Peking),DHA-1,CIT,ACT-1,(Shanghai),DHA-1,(Zhejiang),DHA-1,ACT-1(GuangZhou),DHA-1 is The Predominant Type in China,Map of China,22,.,克隆片段,PCR,产物1100,bp,共6432,bp,ORF1,ORF2,ORF3,ORF4,ORF5,ORF6,IS26,orf-1,DHA-1 ampR qacE1 sul1,5232,bp,23,.,指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类,内酰胺酶,分别属于,Ambler,分子分类中的,A,类、,B,类、,D,类酶。,碳青霉烯酶,24,.,天然来源碳青霉烯酶,嗜麦芽寡养单胞菌的,L1,酶,获得性碳青霉烯酶（,Ambler,分子分类）,B,类酶（金属酶）：,IMP、VIM,类及,SPM-1,A,类酶：,NMC-A,、KPC-1、GES-2,等,D,类酶：,OXA-23,至,OXA-27、40、48、54,碳青霉烯酶按其来源可分为,25,.,金属酶,染色体编码的金属酶：,BC，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，,大多来源于环境寄生菌。,获得性金属酶：,IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，,位于,可转移的基因元件,上，造成区域性传播。,26,.,IMP,型金属酶,IMP,型金属酶,GenBank,上已公布21种，比较它们相互之间的序列表明：,IMP,型金属酶大致可以分为两组：,1）,IMP-1、IMP3-7、IMP911、IMP-16,2）IMP-2,和,IMP-8、12、13、19、20,27,.,中国,IMP-4 2001,年香港 鲍曼,2001年广州 杨格枸橼酸杆菌、铜绿,IMP-1 2004,年12月 江苏无锡 铜绿,IMP-8 2001,台湾 铜绿,28,.,VIM,型金属酶,VIM,型金属酶 与,IMP,类金属酶同源性,40，但两类金属酶的动力学性质相似，编码基因都位于整合子上。,目前,VIM,型金属酶,GenBank,上已公布12种，比较它们相互之间的序列可将,VIM,金属酶大致分为三组：,1）,VIM-1、4、5、11a,2）VIM-2、3、6、8、9、10、11b,3）VIM-7,29,.,VIM,型金属酶分布,VIM-1 1999,年 意大利,铜绿 氧化木糖产碱杆菌 恶臭假单胞,20032004希腊,大肠 肺克,法国,肺克,VIM-2 2000,法国,铜绿,意大利 希腊 日本 韩国 葡萄牙 西班牙 波兰 克罗地亚 智利 阿根廷 美国,中国,VIM-3 2001,年 台湾地区,铜绿,VIM-4 2002,年 希腊,铜绿,2003 瑞典,铜绿,2004 意大利,肺克 阴沟,2004 波兰,铜绿,30,.,VIM-5 2004,土耳其,肺克 铜绿,VIM-6 2004,新加坡,恶臭假单胞,VIM-7 2004,美国,铜绿,VIM-8,哥伦比亚,铜绿,VIM-9，10,英国,VIM-11,阿根廷 意大利,VIM,型金属酶分布,31,.,亚胺培南耐药铜绿,假单胞菌,金属酶检测结果,北京,（27）,上海,（32）,杭州,（27）,广州,（32）,成都,（22）,金属酶表型阳性菌株数,3,5,3,1,0,百分率,11.1,15.6,11.1,3.1,0.0,金属酶基因型阳性菌株数,3,6,4,1,0,百分率,11.1,18.8,14.8,3.1,0.0,32,.,VIM-2,基因整合子结构图,A：B2，B3，B28，H19，H26，H54，G4,结构同,In72,B：S5，S9，S10，S11，S12,（S15、H22,除外）,intI1 attI1 aacA4 59-b VIM-2 59-be aadB 59-be 3-CS,intI1 attI1 aacA4 59-be VIM-2 59-be 3-CS,A,B,33,.,H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker,50,kb,A,B,H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker,PFGE,谱分析结果：共有七种类型，来自上海的六株为同一类型，来自北京的三株分两个类型，来自杭州的四株同样也分两个类型。各地区之间的类型各不相同。,反复尝试通过接合试验及质粒抽提物电转化传递金属酶基因均未获成功。经,XbaI,内切酶消化的染色体,PFGE,与,VIM-2,探针杂交显示其中,10,株铜绿假单胞菌,50-kb,大小的酶切片段杂交阳性，而其余,3,株（,H22,、,H26,、,B2,）没有阳性片段。,34,.,类酶,包括阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌中由染色体介导的,NMC-A、,Sme,-1,Sme,-3、IMI-1,酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的,KPC-1-4,酶、铜绿假单胞菌中质粒介导的,GES-2,酶。,碳青霉烯类抗生素水解酶,35,.,二株产,IMI-1,阴沟肠杆菌,PFGE,结果,36,.,Antibiotics,MIC(mg/l),E cloacae,E C600,E.coli,C600E8,E.coli,DH5,E.coli,pT103,Imipenem,32,0.38,32,0.25,32,Ciprofloxacin,0.064,0.25,0.25,0.006,008,Amikacin,4,2,2,0.25,0.38,Cefepime,2,0.064,0.064,0.125,0.047,Ceftazidime,16,0.5,0.38,0.5,0.25,Cefotaxime,12,0.05,0.125,0.094,0.047,Cefoperazone,256,0.5,1.5,0.047,4,Cefoperazone/,Sulbactam,128,0.25,2,6,2,Piperacillin/,Tazobactam,256,2,4,2,4,Ticarcilliin/,ClavulanicAcid,256,12,32,4,32,Ampicillin/,Sulbactam,256,8,64,1.5,ND,E cloacae 8,E C600,E.coli C600E8,，,E.coli pT103,和,E.coli DH5,对抗菌药物的体外抗菌活性,37,.,阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图谱,M,1,A B M,2,54,kb,15,kb,38,.,Schematic representation of the cloned E.coRfragment,IS903,IMI-2,Imi-2R,IS903,IS2,903bp 921bp 882bp 876bp 921bp,10629bp,(GenBank accession number:AY780889),Imi-R,与,ImiR,同源性为,97%,。,IMI-2,与,IMI-1,同源性,99%,，,仅在,37,位由天冬氨酸天冬酰胺，,106,位由组氨酸酪氨酸,39,.,抗菌药物,肺炎克雷伯菌,亚胺培南,32,亚胺培南,/,克拉维酸,16,美罗培南,32,美罗培南,/,克拉维酸,16,厄他培南,256,头孢他啶,256,头孢他啶,/,克拉维酸,256,头孢噻肟,256,头孢噻肟,/,克拉维酸,256,头孢吡肟,256,头孢曲松,256,头孢西丁,256,氨曲南,256,头孢哌酮,/,舒巴坦,256,哌拉西林,/,三唑巴坦,256,环丙沙星,32,阿米卡星,256,多重耐药肺炎克雷伯菌,40,.,转化试验,抽提亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌质粒,转化,DH5,，在含,1,g/ml,的亚胺培南的,MH,平板上筛选,成功筛选到,亚胺培南耐药的转化菌（转化质粒约60,kb）,染色体带,61kb,41,.,PCR,PCR,筛选,内酰胺酶耐药基因包括,TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM、OXA-10,和,KPC-1,以肺炎克雷伯菌质粒,DNA,为模板,PCR,阳性为,TEM、SHV,和,KPC,转化菌和克隆菌只有,KPC,阳性,PCR,产物测序分别为,TEM-1、SHV-12,和,KPC-2,42,.,转化菌质粒（亚胺培南耐药基因克隆）,EcoR,Hind,，,Nhe,等,酶切,Nhe,pTeasy Vector,pTeasy Vector,1.5kb,在含亚胺培南,1,g/ml,MH,平板筛选,43,.,克隆片段测序,对重组质粒的插入片段进行步移测序，获得,1554bp,核苷酸,DNAssist,软件分析，,1,个开放读码框,(ORF),经,GenBank Blast,程序分析，该,ORF,与,KPC-2(GenBank,注册号,:AY210886),的核苷酸序列同源性为,100%,44,.,D,类酶（,OXA,酶）,在,Bush,分群中属于2,d,类，对苯唑西林的水解活性很强。,OXA,型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低，对头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。,除,OXA-23,外，其它酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。,OXA,型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，或定位在,I,型整合子基因盒中，具备向其他菌种转移的能力,碳青霉烯类抗生素水解酶,45,.,bla,OXA-23-like,bla,OXA-51-like,是我国鲍曼不动杆菌最主要的碳青霉烯酶，,IS,Aba1,与,OXA,基因的表达和转移密切相关,342,株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌中,339,株检测到至少一种,OXA,基因，,303,株检测到,OXA-23-like,和,OXA-51-like,基因，,22,株只检测到,OXA-23-like,基因，,17,株只检测到,OXA-51-like,基因；其中在,313,株菌株的,OXA-23-like,基因上游,34,bp,处检测到,IS,Aba1,，,在,13,株菌株的,OXA-51-like,基因上游,7,bp,处检测到,IS,Aba1,。,46,.,氨基糖苷类钝化酶分为：,磷酸转移酶（,APH）,乙酰转移酶（,AAC）,核苷转移酶（,ANT）,氨基糖苷类钝化酶作用机制：,三者分别使抗生素的羟基磷酸化、氨基乙酰化和羟基核苷化，使之不能再与细菌核糖体结合。,氨基糖苷类耐药,47,.,庆大霉素高水平耐药（,HLGR,）,主要的耐药机制,氨基糖苷类修饰酶 耐药基因 百分率,AAC(6)-,Ie,-APH(2)-,Ia,aac,(6)-,Ie,-,aph,(2)-,Ia,90%,APH(2)-,Ic aph,(2)-,Ic,APH(2)-Id,aph,(2)-Id,APH(2)-,Ib aph,(2)-,Ib,10%,氨基糖苷类耐药,48,.,8,724,bp,ORF1,ORF2,ORF4,ORF3,5,3,ISEcp1(tnpA),aph-Ie,repD,str,部分序列,一种新的质粒介导的肠球菌氨基糖苷类耐药基因,aph(2”)-Ie,49,.,三、靶位改变,50,.,主要抗菌药物作用靶位,-内酰胺类 青霉素结合蛋白（,PBP）,氨基糖苷类 核糖体30,S,亚基,大环内酯类 核糖体50,S,亚基,氟喹诺酮类,DNA,旋转酶（拓扑异构酶,）、拓扑异构酶,糖肽类,D-,丙氨酰,D-,丙氨酸,四环素类 核糖体50,S,亚基,51,.,PBP2a,的作用,PBP,2a,与,-,内酰胺抗生素亲和力低，替代正常,PBP,功能,87,KdaPBP,1,80 PBP,2,78 PBP,2a,75 PBP,3,70 PBP,3,41 PBP,4,52,.,53,.,54,.,DR,IR,IR,DR,SCC,mec,ccrA,ccrB,mecI,mecR1,mecA,orfX,J1,J3,J2,SCC,mec,55,.,56,.,IV,型,57,.,VS,HA-MRSA,CA-MRSA,高 耐药性 较低,阴性,PVL,阳性,I、II、III SCC,mec,IV、V,58,.,金葡菌耐药性的发展历程,S.aureus,Penicillin-resistant,S.aureus,Methicillin-resistant,S.aureus(,MRSA,),Penicillin,Methicillin,Vancomycin-resistant,enterococcus(,VRE,),Vancomycin(glycopeptide)-,Intermediate-Resistant,S.Aureus,（,VISA、GISA,）,Vancomycin-,Resistant,S.Aureus,（,VRSA,）,Vancomycin,1940,1960,s,1990,s,1996,Superbugs,2002,59,.,氟喹喏酮的耐药机理,拓扑异构酶,IV,(parC,parE),拓扑异构酶,II,(,gyrA,gyrB,),左氧氟沙星,氟喹喏酮,60,.,糖肽类抗生素包括万古霉素、替考拉宁等，是高分子量的疏水性化合物。,主要耐药机制：,VRE,的细胞壁肽糖前体末端的,D-,丙氨酰-,D-,丙氨酸,发生了改变，万古霉素不能与之相结合，因此不能抑制,VRE,的细胞壁合成。,耐万古霉素的肠球菌（,VRE）,61,.,transposase,resolvase,vanR,vanS,vanH,vanA,vanX,6590,bp(ZY02,HS3),表示,PCR,扩增,vanY,vanZ,10,Kb（ZY01）,转座功能（转座酶,transposase,基因和解离酶,revolsase,基因，分别编码产生转座酶和解离酶在转座过程中发挥作用）,调控耐药基因（,VanR,和,VanS）,产生耐糖肽类的缩肽（,VanH,脱氢酶、,VanA,连接酶和,VanX,二肽酶）,辅助蛋白（,VanY,和,VanZ）,含,VanA,基因簇的转座子转座入各种质粒，或通过接合转座导致,VRE,耐药性的传播,62,.,大环内酯类的耐药机制,核糖体靶位点的改变:,erm,编码，高耐;法国、西班牙、中国,主动外排泵:,mef,编码，低耐,，加拿大、美国、,修饰酶,63,.,16S rRNA,甲基化酶,氨基糖苷类抗生素作用位点：细菌,16S rRNA,以往认为最重要的氨基糖苷类抗生素耐药机制：修饰酶，作用位点在药物，引起一种或几种药物耐药,2002,最新发现一类新的氨基糖苷类抗生素耐药机制：,16S rRNA,甲基化酶，引起药物作用位点的甲基化，导致细菌对所有氨基糖苷类抗生素高水平耐药，目前发现,4,种：,armA,、,rmtA,、,rmtB,、,rmtC,多重耐药鲍曼不动杆菌在我国各省市广泛流行，该菌对氨基糖苷类抗生素耐药率和耐药水平高,16,S rRNA,甲基化酶是否在介导该菌对氨基糖苷类抗生素耐药中发挥作用需要系统研究,64,.,700,株鲍曼不动杆菌对,5,种氨基糖苷类抗生素体外抗菌活性,5,种氨基糖苷类抗生素耐药率均大于,60,；,377,株（,53.9,）菌株对,5,种氨基糖苷类抗生素均耐药；,334,株,（,47.7,）菌株,armA,阳性；,armA,阳性菌株对上述所有氨基糖苷类抗生素均高水平耐药,MIC,256mg/L,反复进行接合实验、质粒抽提、电转化均未成功,Southern-blot,杂交证实,armA,基因位于克隆,A,、,B,、,C,约,220kb,、,300kb,、,220kb,大小的染色体,ApaI,酶切条带上,armA,基因定位于鲍曼不动杆菌染色体,65,.,四、主动外运,有些抗菌药物（常见的如四环素类及喹诺酮类）能诱导细菌的主动外运，抗菌药物难以在细菌内积累到有效浓度，造成对抗菌药物耐药程度的普遍提高。,66,.,外排泵的结构,外排系统由3个部分组成：,位于内膜的肿瘤耐药分化家族(,resistantnodulationdivision family，RND),的,质膜转运体,内外膜之间的,膜周连接蛋白或膜融合蛋白,(,MFP),位于外膜的,孔道形成蛋白,(0,EP),67,.,组间外排泵表达量均值比较,68,.,是指细菌粘附于固体或有机腔道表面，形成微菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物。其生化组成为,藻酸盐多糖和蛋白复合物,。菌膜可阻止巨噬细胞、抗体、药物作用于菌体,五、细菌生物被膜（,Biofilm）,69,.,生 物 被 膜,70,.,细菌形成生物被膜后，往往对抗菌药物产生高度耐药性，原因有,细菌生物被膜可减少抗菌药物渗透,吸附抗菌药物钝化酶，促进抗菌药物水解,细菌生物被膜下细菌代谢低下，对抗菌药物不敏感,生物被膜的存在阻止了机体对细菌的免疫力，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗菌药物的协同杀菌作用,71,.,其他耐药机制,缺乏自溶酶,替代途径,酶的过量产生等,靶位保护机制,72,.,质粒介导的喹喏酮耐药,1998年,George.A.Jacoby,等,从一株,肺炎克雷伯菌,（,UAB1,）,中,发现能介导多种抗生素耐药的质粒,pMG252,，,经接合传递后其接合子对环丙沙星的耐药性增加近30倍(,MIC 0.0080.25g/mL)。,在该质粒内发现了喹诺酮耐药（,q,ui,n,olone,r,esistance）,基因，命名为,qnr,(Lancet1998;351:79799),73,.,作用机制,保护,DNA,旋转酶,Qnr,通过与,旋转酶,特异地结合从而影响酶的内在活性,降低了酶与,DNA,的结合,导致喹诺酮类药物的作用靶位数量减少,Qnr,与,旋转酶,的结合,改变了药物结合区域的构象,从而降低了药物识别靶位的效率,保护拓扑异构酶,细菌对拓扑异构酶的保护作用与,DNA,旋转,酶类似,Hegde,S.S.et al.Science 308:1480,2005,Qnr,DNA,旋转酶,74,.,表 5株,qnrA,阳性大肠埃希菌及其接合菌的,MIC,值,菌株,CIP,NOR,OFX,MOX,CTX,CAZ,S,GEN,AK,AMP,63,128,256,64,32,256,16,2,1,2,256,Tc63,1,4,1,0.5,256,4,4,1,4,256,140,64,256,64,32,32,2,8,8,8,256,Tc140,1,4,2,1,16,2,8,8,4,256,142,4,8,4,16,256,4,4,2,4,256,Tc142,0.5,0.5,1,1,32,2,8,8,2,256,Z8,16,16,16,32,128,4,256,256,256,256,TcZ8,0.06,0.06,0.125,0.06,128,4,64,256,256,256,Z11,32,64,16,32,128,4,256,256,256,256,TcZ11,0.06,0.06,0.125,0.06,64,4,64,256,256,256,J53,0.015,0.125,0.125,0.03,0.06,0.125,4,1,1,2,J53,为受体菌,75,.,表3 8株,qnrA,阳性肺炎克雷伯菌及其接合菌的,MIC,值,菌株,CIP,NOR,OFX,MOX,CTX,CAZ,S,GEN,AK,AMP,14-2,64,128,64,128,32,2,1,1,1,256,Tc14-2,0.25,0.5,1,0.25,16,2,2,2,1,256,25,64,256,64,32,256,16,4,2,2,256,Tc25,1,8,1,2,128,4,4,1,4,256,31,64,256,128,128,256,16,2,1,2,256,Tc31,1,8,1,2,256,8,4,1,2,256,96,2,8,2,2,128,2,4,2,8,256,Tc96,1,8,1,2,256,8,4,1,4,256,151,8,16,8,4,64,4,4,2,8,256,Tc151,1,1,1,0.25,32,1,2,1,2,256,152,8,64,4,4,128,2,4,2,8,256,Tc152,0.5,2,0.5,0.5,64,1,4,1,4,256,153,32,128,16,16,32,64,256,256,256,256,Tc153,0.5,1,1,2,16,1,2,1,2,256,156,4,8,2,1,64,4,4,2,8,256,Tc156,2,8,2,0.25,64,4,4,1,4,256,J53,0.015,0.125,0.125,0.03,0.06,0.125,4,1,1,2,76,.,质粒,DNA,与,PCR,产物探针的,Southern,杂交,A:,肺炎克雷伯菌96号原始菌,C:,肺炎克雷伯菌25号原始菌,B:,肺炎克雷伯菌96号接合菌,D:,肺炎克雷伯菌25号接合菌,50,kb,图7：部分菌株质粒电泳图,图8：质粒,DNA,与,qnrA,探,针的,Southern,杂交图,图9：质粒,DNA,与,CTX-M-24,探针的,Southern,杂交图,V,517,D C B A,A B C D,V,517,V,517,D C B A,50,kb,53.7,kb,7.2,kb,5.6,kb,3.9,kb,3.0,kb,2.7,kb,5.1,kb,2.1,kb,50,kb,77,.,质粒全序列测定,用鸟枪法对同时含有,qnrA,和,CTX-M,两个基因的接合菌质粒进行全序列测序,构建文库：超声打碎接合菌质粒全长,DNA，,参数200,w，8s，,回收1.5,kbp,3.0kbp,片段片段，连接入载体,PUC18,测序采用,Sanger,双脱氧末端终止法，用,ABI3730,型自动测序仪进行双向测序,用,Phred,软件读取测序数据，去除低质量碱基，用,Cross-match,软件去除载体序列，,Phrap,软件进行序列拼接，,Consed,软件观察和修正拼接结果,78,.,int1,bla,OXA-30,catB3 aar3,sull,orf513,qnrA,ampR sull orf5 orf6,IS,6100 EcoRII,图10：96号菌株（上图）与,In37（,下图）中,qnrA,的周围基因环境比较,int1 sull,orf513,qnrA,ampR sull,orf5 orf6,IS,6100,EcoRII,96号菌株接合菌质粒部分测序结果1,aac(6)Ib,qacE,1,aac(6)Ib,qacE,1,qacE,1,5-,CS,Gene cassettes,3-,CS,Common region,Unique,region,3-,CS,qacE,1,96号菌株,In37,79,.,图11：96号菌株,CTX-M-24,的周围基因环境,1242,bp 1656bp 876bp 1057bp 1118bp,Tn1721 ISEcp1B CTX-M-24 IS903D iron,96号菌株接合菌质粒部分测序结果2,80,.,菌株,ZJ96,的质粒图谱,81,.,谢谢！,82,.,