细菌形态学检查.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细菌形态学检查及质量保证,两个分隔的世界,微生物人员的无奈,标本采集不合格,有些病原菌难以生长或,生长周期长,不是所有细菌都能做药敏试验,不是所有培养出的细菌都是致病菌,没有培养出细菌不代表没有感染,不是所有细菌或所有药物都有判断标准,临床医生不主动联系试验室人员,临床医生的抱怨,苛养菌检出率低,结果重复性差,报告速度慢,感染菌与污染菌不易区分,药敏结果与治疗反应存在差,关注微生物报告时效性问题,操作最简单,费用最低 标本直接涂片,用时最短 显微镜检测,结果最直观,可在第一时间向临床报告镜下所见，医生根据镜检结果可作初步诊断，并以此进行针对性用药。,主要内容,标本涂片制作方法,常用染色方法及技巧,如何阅片,标本涂片制作方法,痰液：棉签挑取干酪样或脓性痰部分,0.05-0.1ml,，均匀涂抹成卵圆形痰,膜（约,2cm,长），每张玻片只涂一份标本,脓液：同痰涂片,大便：取粘液便或血便少量均匀涂布玻片，不可过厚,无菌体液：标本足量，,1ml,，离心或甩片集菌后涂片,(3000r/min 15min,）,标本量少，直接涂片,病灶组织或干酪块：先用组织研磨器磨碎后再涂片，大小厚度同痰涂片，,注意丝状真菌,质量控制,涂片的厚薄以镜下见到,单层细胞,为宜,染色结果 细胞核、浆清晰，胞内吞噬物清楚可见,革兰染色阴、阳性分明,涂片的制备水平及染色的质量，直接影响到镜检的结果,标本染色方法及技巧,根据检测目标的不同选择最适合的染色方法,病原体,染色方法,细菌、真菌,革兰染色,真菌,10%KOH,、乳酸酚棉蓝,新型隐球菌,墨汁染色,结核分枝杆菌,抗酸染色、荧光染色,奴卡菌,弱抗酸染色,耶氏肺孢子菌,六胺银染色,细胞壁缺陷菌,吖啶橙染色,革兰染色,涂片固定,待涂片干后加热固定，火焰固定时菌膜朝上，以中,等速度通过火焰,3,此即可（温度不宜过高，以防菌体蛋白,变性，影响染色结果），也可用乙醇或甲醇固定。,染色,龙胆紫,10s,水洗 甩干,碘液,10s,水洗 甩干,脱色液,10-20s,水洗 甩干,沙黄,10s,水洗 待干,镜检,油镜下观察，紫色革兰氏阳性,红色革兰氏阴性,革兰染色注意事项,注意取材部位，涂片的厚薄。,染色时间应视标本种类、涂片厚薄调整，妇科白带标本染色时间应烧延长（,10s,）,以获得更好的染色效果。脱色不宜过度。,固定不可用酒精灯直接加热，避免影响染色效果。,染液用完后及时改上盖子，避免挥发。,被检菌的培养条件、培养基条件、菌龄的不同影响染色效果，如培养时间过长，革兰阳性菌可能染成阴性。,18,24,小时为宜。,某些菌存在染色困难，不易脱色的情况，出现染色不均，阴阳不定（某些,G+b,、鲍曼不动杆菌等）。,注意生物安全，自我防护。,抗酸染色,涂片固定,同革兰染色,染色,石碳酸复红 ,10min,水洗 甩干,酸性酒精,1-2min,水洗 甩干（必要时可重复）,亚甲基蓝,30s,水洗 待干,合格的片子肉眼观察痰膜呈亮蓝色，无红色斑块,镜检,抗酸菌呈红色，背景及其他菌呈蓝色,抗酸染色注意事项,染色时避免玻片上的染液干燥,直接涂抹的痰膜厚薄适宜，以透过痰膜看报纸上的,5,号字迹较模糊为适宜的厚度,香柏油能溶解复红染料，使萋,-,尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成伤害，故避免使用香柏油，应使用专用油镜油,酸性酒精用尽，可自制,5%,的盐酸酒精作为脱色液,有时同一个抗酸菌体上，红色的深浅亦有不同，镜检时注意,冬季室温过低，染色时间适当延长,试剂用完后及时盖好，避免挥发,注意生物安全，自我防护,墨汁染色,标本（脑脊液）离心取沉淀涂片,在标本涂片处滴加,1,滴墨汁，加盖玻片,在低倍镜下找有荚膜的菌细胞，转高倍或油镜确认,结果：新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，细胞壁明显，有时有出芽现象，背景黑色,注意事项,脑脊液与墨汁的最适比例，墨汁太多影响观察,脑脊液离心后涂片，离心,10-30min,痰液、支气管灌洗液均可作为隐球菌的检测标本，防止漏检,乳酸酚棉蓝染色,在玻片上滴加,1,滴乳酸酚棉蓝染液,剪一段约,1cm,长的透明胶带，将一端贴在棉拭子木棒的一端，形成旗帜样,将胶带粘性一面按在菌落表面，将菌丝粘在胶带上并平放进入染液，取下木棒，再胶带表面再滴加一滴染液，盖上盖玻片,使用显微镜在低倍镜、高倍镜或油镜下观察真菌形态,科兹洛夫斯基染色,涂片，可混合大肠杆菌做对比，干燥、固定,滴加,2%,沙黄水溶液，略加热，使之冒蒸汽，约,30s,1min,后水洗,1%,孔雀绿染液复染,2,3min,，也可用碱性美蓝染色,1,2min,吸水纸吸干后镜检,结果,布氏杆菌呈淡红色球杆菌，其它菌或细胞呈绿色或蓝色,六胺银染色,涂片固定,染色,1%,高碘酸，氧化,10min,，流水冲洗,2%,铁明矾,10min,流水冲洗,玻片放入,60,预热,20min,的工作液中,40min,左右，每,5min,观察,一次，至涂片呈淡褐色，流水冲洗,0.2%,氯化金调色,3,5min,，流水冲洗,2%,硫代硫酸钠固定,3min,，流水冲洗,置,60,烤箱内烤干，封片,结果 油镜下肺囊虫包囊呈圆形、卵圆形或不规则形，包囊呈黑色,质量控制,每天质控与标本同步进行,一年一次人员比对，以当次比对职称最高人员结果为参考标准,染色方法,质控菌株,结果,革兰染色,ATCC25923,（金黄色葡萄球菌）,ATCC25922,（大肠埃希菌）,紫色,红色,抗酸染色,ATCC14468,（耻垢分枝杆菌）,ATCC25922,（大肠埃希菌）,红色,蓝色,阅片,如何阅片,标本合格与否的判定,感染的确认（炎症细胞）,炎症性质的鉴别（单个核、分叶核或嗜酸细胞）,感染性质鉴别（细菌、真菌、螺旋体、寄生虫等）,微生态失衡与否及程度（菌群失调）,可疑致病菌的确认（根据微生物与炎性细胞的关系）,首先判断标本合格与否,开放性标本（痰液、尿液、伤口标本等）,肉眼观察（痰液粘稠、脓性、血性）,根据镜下细胞种类，数量及细菌种类判断,上皮细胞多，炎症细胞少，多不合格,强烈提示感染的镜下现象,吞噬现象,包括中性粒细胞的非特异性吞噬和巨噬细胞的特异性吞噬，与粘附区别,包裹现象,有些病原微生物自身具有抗吞噬能力（荚膜），炎性细胞不能将,其吞噬，而是包裹起来，形成脓球,伴行现象,未被炎性细胞包裹的病原菌分布在炎性细胞周围，需与污染菌鉴别,建议,对大家公认有临床致病意义的细菌：,结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、奴卡菌、白喉棒状杆菌、隐球菌,等一经检出应立刻报临床。,对来自,无菌部位,的标本并排除污染的镜下,细菌,一经检出立刻报临床。,呼吸道及其他污染部位的条件致病菌（肺炎链球菌、嗜血杆菌、卡他莫拉菌铜绿假单胞菌、不动杆菌等）需结合镜下涂片及病人临床信息判断是否为致病菌。,直接涂片镜下观察,白细胞内,吞噬,细菌与感染相关度高,粘液丝缠绕或包裹的细菌可能为目的菌,未发现吞噬现象可结合标本类型、质量，细菌是否有荚膜，菌群改变或异位大量定植等分析,谢谢,