重组DNA表达系统课件.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,重组DNA表示系统,天津科技大学生物工程学院罗学刚,重组DNA表达系统课件,第1页,体外表示：无细胞表示系统,原核表示系统：大肠杆菌表示系统等,体内表示：,酵母表示系统,真核表示系统,昆虫细胞表示系统,哺乳动物细胞表示系统,动物,/,植物表示系统（转基因动物,/,植物）,重组DNA表达系统课件,第2页,体系选择,研究基因功效:,大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞,多肽药品生产:,大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织,疫苗:,大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒,单抗生产:,杂交瘤细胞,工业酶生产:,各种微生物,重组DNA表达系统课件,第3页,一、体外表示系统（无细胞表示系统）,重组DNA表达系统课件,第4页,体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一个相对胞内表示系统而言开放型表示系统。,优点：内源型,mRNA,干扰很小，操作程序简单，取得重组蛋白周期很短。主要用于蛋白质快速分析判定；基因转录和翻译调控机理研究；分子间相互作用研究。,缺点：,昂贵；,操作要求高；,表示量不够高。,重组DNA表达系统课件,第5页,主要体外表示系统：,1、兔网织红细胞系统，由新西兰大白兔制备。,2、麦胚提取物系统，可稳定地表示一些在兔网织红细胞中翻译受到抑制DNA。,3、原核体外翻译系统（S30原核体外翻译系统），,E.coli,S30提取物由OmpT内切酶和Lon蛋白酶缺点,E.coli,B菌株制备，所以在S30系统中表示基因能够增加产物稳定性。,重组DNA表达系统课件,第6页,当前多家企业有商业化产品，常见有：,RTS E.Coli 系统;,RTS100 wheat germ CECF系统(Roche),TNT快速偶联转录/翻译系统 (Promega)；,Gold TNT T7 Express 96系统（Promega），该系统有SP6和T7两种类型，适合在96孔板上进行大规模高通量筛选分析；,TNT T7 Quick for PCR DNA (promega)，PCR DNA TNT T7快速系统从PCR反应液中直接取样，无需纯化DNA，直接用于偶联转录/翻译反应；,TNT 偶联小麦胚芽抽提系统(promega)。,重组DNA表达系统课件,第7页,重组DNA表达系统课件,第8页,二、原核表示系统,重组DNA表达系统课件,第9页,特点：,产量高、生长速度快、操作轻易、成本低。,缺点：,翻译后加工修饰体系不完善：无糖基化、酰基化等,普通表示取得蛋白经常以变性状态存在，不含有生物学活性。,（一）大肠杆菌表示系统,重组DNA表达系统课件,第10页,当前较惯用表示载体是含有可诱导,T7,开启子表示载体，大部分蛋白均可取得表示而且表示量较高，表示量可占细菌总蛋白,25,以上。,T7RNA,聚合酶起源于T7噬菌体，期活性高于大肠杆菌,RNA,聚合酶很多倍，而且较少发生转录中止,它只识别自己开启序列，不能开启大肠杆菌,DNA,转录，对抑制大肠杆菌,RNA,聚合酶抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在条件下，使目标基因得到大量扩增,正常大肠杆菌并不表示T7RNA聚合酶，为了能利用T7开启子表示外源基因，将T7RNA聚合酶基因置于lacUV5开启子控制下，整合到大肠杆菌染色体，构建了能被IPTG诱导表示T7RNA聚合酶大肠杆菌菌株,惯用宿主细胞有BL21（DE3）、JM109（DE3）等,还有受温度改变诱导含有,噬菌体,PL,开启子调控,载体等。,重组DNA表达系统课件,第11页,按蛋白质类型分,单纯表示:pJLA系列,用NcoI/NdeI导入AUG载体,融合表示:融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc,分泌表示:pel/ompT分泌肽,按开启子分,lac及衍生tac,trc,pac,rac等开启子 IPTG诱导,lamda phage P,L,和P,R,开启子 热诱导,T7 开启子 IPTG诱导,T5 开启子 IPTG诱导,ara开启子 阿拉伯糖诱导,大肠杆菌表示载体分类,重组DNA表达系统课件,第12页,常见大肠杆菌商业化表示系统有：,1、,pET system and pETBlue system（Novagen,企业），是原核蛋白表示中应用最多系统。含有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌。当前共有包含40各种载体、15种不一样宿主菌和配套齐全用于有效检测和纯化目标蛋白相关产品。,基本结构由T7开启子、核糖体结合位点、信号肽序列、多克隆位点、T7转录终止信号、氨苄青霉素抗性基因核质粒复制位点等,有能够表示N端融合、C端融合和非融合蛋白不一样质粒。也能够表示非分泌性蛋白,2、,pBAD,表示系统（,Invitrogen,企业），可控制蛋白质生产水平低于其成为不溶性蛋白域值。经过与硫氧还蛋白融合来增加溶解度,3,、,QIA,express,Expression System,（,Qiagen,企业,）,。,重组DNA表达系统课件,第13页,pJLA50X系列;pcDNAII;etc,pET系列,(T7 promoter,Novagen企业),pQE系列,(T5 promoter,Qiagen企业),pMAL系列,(周质表示,BioLabs企业),pGEX系列,(GST融合表示,Pharmacia企业),pBAD系列,(Arabinose诱导型),惯用表示载体,pTYB系列,(CBD融合,能够自我切割,BioLabs),重组DNA表达系统课件,第14页,BL21(DE3)/pLysS:,本身表示T7 RNA polymerase,适用pET系列等带T7开启子载体,M15/SG13009:,本身表示T5 RNA polymerase,适用pQE系列等带T5开启子载体,BL21TrxB(DE3):,thioredoxin reductase 突变,Origami:,thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变,适合带thioredoxin reductase融合表示载体,帮助形成更多二硫键,BR21CodonPlusRIL:,富含AT真核生物基因表示,BR21CodonPlusRP:,富含GC真核生物基因表示,特殊表示用菌株,重组DNA表达系统课件,第15页,外源基因在原核细胞中表示形式,按表示蛋白部位分：,分泌表示；,外周质及膜上表示；,胞内表示。,重组DNA表达系统课件,第16页,外源基因在原核细胞中表示形式,在原核细胞中表示外源基因时，可产生融合型、非融合型。,标准上应能够使外源基因表示效率高，蛋白质产量高，不易被细菌分解，而且产物易被提取、纯化。,重组DNA表达系统课件,第17页,融合基因表示,外源基因在大肠杆菌中表示一个简便方法是使其表示为融合蛋白，也就是说要表示外源基因连接在一段原核基因下游，蛋白质N末端由原核DNA序列或其它DNA序列编码，C端由外源DNA完整序列编码，这么蛋白质由1条短原核多肽或含有其它功效多肽和外源蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。,重组DNA表达系统课件,第18页,融合蛋白特点,转录和翻译起始从正常大肠杆菌序列开始，故通常能够产生高水平融合蛋白；,融合蛋白往往比天然外源蛋白愈加稳定；,产生融合蛋白较大，轻易从蛋白质凝胶电泳中区分出夹，而且融合蛋白带能够从凝胶上切下，经冷冻于燥，磨成粉末后即可作为抗原；,有些融合蛋白带有信号肽，能够分泌到细胞外。这有利于蛋白质分离和纯化。,重组DNA表达系统课件,第19页,融合方式,6,His Tag,融合,半乳糖苷酶融合,trpE,融合蛋白,谷胱甘肽,S,转移酶（,GST）,融合,硫氧还蛋白（,Trx）,融合,麦芽糖结合蛋白（,MBP）,融合,碱性磷酸酶（,phoA,）,开启子和信号序列,重组DNA表达系统课件,第20页,Protein A,GST（glutathione S-transferase）,CBD(chitin-binding domain,BioLabs;,cellulose-binding domain,Novagen,),calmodulin-binding domain,Stratagene,),MBP(maltose-binding protein),GFP (green fluorescence protein),Thioredoxin *帮助二硫键形成,Dsb(periplasma enzyme DsbA,DsbC),*二硫键形成与,SUMO(small ubiquitin-related modifier),KSI(ketosteroid isomerase)基本上全部沉淀,各种融合蛋白表示载体,帮助可溶化,帮助分泌到周质,可用亲和层析纯化,重组DNA表达系统课件,第21页,His-tag(6-8 Histidine),T7-tag (MASMTGGQQMG),HSV-tag(QPELAPEDPED),S-tag(KETAAKFERQHMDS),VSV-G-tag(TTDIEMNRLGK),HA-tag(YPYDVPDYA),Flag-tag(DYKDDDDK),Myc-tag(EQKLISEEDL),各种用于抗体识别标识,重组DNA表达系统课件,第22页,假如所表示蛋白质有二硫键并需要正确立体结构,尽可能进行可溶性表示;,假如所表示蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清,采取包含体表示比很好;,假如希望表示多肽分子量小于10 kDa,一定要进行融合表示,重组DNA表达系统课件,第23页,采取MBD融合,采取GST融合,采取CBD融合,采取thioredoxin融合,采取Origami等宿主菌,降低菌体培养速度,温度(15-30),降低转速,让表示产物可溶化,重组DNA表达系统课件,第24页,采取CBD融合,(pET36/37),采取Dsb融合,(pET39/40),采取带pelB/ompT引导肽载体,(pET12/20/22),采取带MBD融合,(pMAL载体,Biolabs),采取带SUMO融合,(pET SUMO,Invitrogen),让蛋白质分泌到间质去,重组DNA表达系统课件,第25页,融合表示蛋白，在分离纯化过程中往往需要去除表示时额外引入融合片段。所以需要用不一样方法将其裂解，通常有：,1、化学裂解法：特异识别特定氨基酸残基或一组氨基酸残基。但化学裂解法裂解位点特异性低，有时可能对目标蛋白产生无须要修饰,如：甲酸、溴化氰等,2,、,酶解法：反应条件温和，含有高度特异性。惯用酶有,Xa,因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等。但酶解法成本高,，反应时间长，更主要是蛋白酶本身不可防止地混入目标蛋白中，造成新污染，提升纯化复杂性。,重组DNA表达系统课件,第26页,DTT:,intein,Cys,溴化氰:,Met,Thrombin:,LVPR,GS,Factor Xa:,IEGR,Enterokinase:,DDDDK,PreScissionTM protease:,LEVLFQ,GP,Genenase I TM,PGAAHY,TEV protease:,ENLYFQ,G,融合蛋白专一性切割,重组DNA表达系统课件,第27页,3,、,IMPACT,系统,(,intein mediated purification with an affinity chitin-binding Tag),该系统是由枯草杆菌起源几丁质结合域（,5,kD,，,chitin binding domain,，,用于亲和纯化）和酵母蛋白质剪接元件,intein,组成一个双效融合标签。,intein,在较低温度和还原条件下发生本身介导,N,端裂解，释放出与之相连目标蛋白。所以融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目标蛋白与,fusion tag,准确切割。但含有较多二硫键蛋白不适合这一系统。,重组DNA表达系统课件,第28页,重组DNA表达系统课件,第29页,重组DNA表达系统课件,第30页,重组DNA表达系统课件,第31页,分泌型表示,为降低所需蛋白质在宿主体内被蛋白酶降解。或者使蛋白质能够在体外正确折叠和便于,提纯，经常需要将被表示蛋白质分泌到细胞外，所以要用分泌型载体。,重组DNA表达系统课件,第32页,分泌型载体优点,一些在胞内被蛋白酶降解蛋白质在细胞周质中很稳定；,一些在胞内无活性蛋白质在分泌后便含有活性，分泌可能使蛋白质能够正确折叠；,产生蛋白质没有氨基末端甲硫氨酸，因为切割位点在信号肽与编码序列之间，甲硫氨酸会影响许多蛋白质活性。,重组DNA表达系统课件,第33页,蛋白质能够在大肠杆菌中进行分泌，最少要具备3个要素：,有一段信号肽；,在成熟蛋白质内有适当与分泌相关氨基酸序列；,细胞内有对应转运机制。,重组DNA表达系统课件,第34页,信号肽长度普通为1530个氨基酸残基,真核生物和原核生物信号肽在结构上都有以下特征：,信号肽普通都不长，在氨基末端有一段带正电荷氨基酸序列，往往是精氨酸或赖氨酸残基，其数目为13个；,有一个高度疏水关键区，含亮氨酸或异亮氨酸残基，位置能够从带正电荷氨基酸延伸到含切割位点区域；,含有能被信号肽酶水解切割位点，这个位点经常在丙氨酸之后，有是在甘氨酸或丝氨酸之后,重组DNA表达系统课件,第35页,分泌型载体也有缺点，比如目标蛋白质产量往往很低，以及信号肽不能被切除或切在错误位置上等。,重组DNA表达系统课件,第36页,非融合蛋白表示,指在细菌内表示蛋白质以真核蛋白质mRNAAUG为起始，在其氨基端不含任何细菌多肽序列。,优点：表示产物生物学功效靠近于生物体内天然蛋白质。,缺点：轻易被细菌蛋白酶破坏。,重组DNA表达系统课件,第37页,包含体（包涵体）,表示蛋白质经常是不溶，会在细菌内与细菌杂蛋白、核酸等成份形成不溶性聚合体即包含体（inclusion body），尤其当表示目标蛋白量超出细菌体总蛋白量10%时，就很轻易形成包涵体,生成包涵体原因可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，影响了多肽链正确折叠，造成疏水基团外露等。,重组DNA表达系统课件,第38页,包含体形成有利于预防蛋白酶对表示蛋白降解，而且非常有利于分离表示产物。但包含体形成后，表示蛋白不含有生物活性，所以必须溶解包含体并对表示蛋白进行复性。,重组DNA表达系统课件,第39页,包含体制备可经过常规方法如超声波、匀浆等使菌体破碎后，离心就可得到。密度梯度离心后则可得到高纯度包含体,包含体通常不溶于水，加入强蛋白质变性剂后方可溶解,依据包含体中蛋白质种类不一样，通惯用68molL盐酸胍或910molL尿素溶解包含体。采取pH 2045酸性溶液也可使包含体溶解。,重组DNA表达系统课件,第40页,形成包含体表示蛋白恢复其活性过程称为包含体蛋白质复性,其基本原理是伴随变性剂浓度降低，表示蛋白恢复其天然构型,惯用复性方法有逐步稀释法或透析法等。,重组DNA表达系统课件,第41页,透析法:,简单;,但费时,费缓冲液,蛋白质浓度不能过高(轻易产生沉淀),快速稀释法:,最惯用小规模复性方法;,但比较费时,费缓冲液,蛋白质浓度不能高(轻易产生沉淀),超滤透析法:,比较省缓冲液,处理量大;,但费时,要控制好蛋白质浓度,凝胶过滤法:,快速,可重复性高,不会产生沉淀,操作复杂一点,亲和层析复性法,水相二相法,etc,包含体起源蛋白质复性,重组DNA表达系统课件,第42页,（二）枯草芽孢杆菌表示系统,Spizizen于1958年发觉枯草杆菌168菌株为可转化菌株以来，枯草杆菌遗传学工作不停深入和发展,枯草杆菌研究之所以领先于其它芽孢杆菌种，主要是因为他转化、转导方法较完善，以及大量衍生菌株,A.芽孢杆菌分类除枯草杆菌外，已报导用作宿主表示克隆基因有：嗜碱芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种,B.枯草芽孢杆菌168基因组序列测定已完成,重组DNA表达系统课件,第43页,芽孢杆菌表示系统优点-相对于大肠杆菌,1、非致病性：除个别种（炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌）外对人畜无害,2、转化外源DNA感受态系统也一样适合用于转化重组DNA,3、质粒和噬菌体都能够作为克隆载体,4、细胞壁组成简单，只含有肽聚糖和磷璧质，所以在分泌蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟,5、能够大量分泌一些胞外蛋白，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单。比如：淀粉酶、蛋白酶及杀虫晶体蛋白等,与革兰氏阴性（大肠杆菌）相比，阳性菌（芽孢杆菌）简单细胞壁结构赋予了它高效地向胞外分泌目标蛋白能力,这么从而使得目标蛋白纯化相对比较简单,芽孢杆菌拥有一套高效分泌信号肽及分子伴侣系统。可完成目标蛋白高效分泌表示，从而防止包涵体形成,6、良好发酵基础和生产技术，在相对简单培养基中能生长到很高密度,重组DNA表达系统课件,第44页,重组DNA表达系统课件,第45页,芽孢杆菌缺点以下：,1、,能够产生大量胞外蛋白酶，往往造成表示产物大量降解。,2、能自发形成感受菌株极少，感受态连续时间短暂，分子克隆效率低,3、存在限制和修饰系统，重组质粒不稳定。,重组DNA表达系统课件,第46页,芽孢杆菌惯用宿主,已报导用作宿主表示克隆基因有Brevibacillus brevis（短短芽孢杆菌）、嗜碱芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等,短短芽孢杆菌作为表示菌株几个优点：,1、几乎不向胞外分泌蛋白酶（枯草芽孢杆菌最少分泌8种不一样蛋白酶），利于目标蛋白稳定性,2、细胞壁相对于枯草杆菌来讲更薄，有利于外源蛋白分泌,3、据研究其发酵液中存在着能够促进蛋白中二硫键形成因子，能够促进外源蛋白折叠,重组DNA表达系统课件,第47页,载体：,当前，芽孢杆菌中惯用载体主要有自主复制质粒、整合质粒和噬菌体三种,从芽孢杆菌中分离自主复制质粒，除极少数以外（比如pBC16），均为无抗性标志隐秘质粒,带有抗性标志自主复制质粒主要来自其它G+细菌，尤其是来自金黄色葡萄球菌质粒。其中广泛使用有pUB110、pC194和pE194等。迄今,已在上述质粒基础上构建了双标识质粒、芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭质粒、表示质粒、整合质粒和探针质粒等,重组DNA表达系统课件,第48页,绝大多数载体在阳性菌中拷贝数都非常低。采取整合质粒将克隆基因整合到宿主染色体，是克服芽孢杆菌质粒不稳定性一个有效路径,整合目标普通经过同源重组或者转座子插入来实现。这种质粒基本结构是在大肠杆菌质粒基础上增加一个芽孢杆菌抗性标志，以及待整合目标基因。,它在大肠杆菌中进行基因克隆或亚克隆操作。整合质粒导入芽孢杆菌后，因为它没有芽孢杆菌质粒复制起点而不能自主复制，只有插入到宿主体后，伴随细胞复制而复制。在含有整合质粒中芽孢杆菌抗性标志抗生素培养基上，就能够很轻易挑出这种整合体,整合质粒另一个主要用途是用于目标基因敲除。不少噬菌体都可用作载体，如105噬菌体，SP噬菌体及其它噬菌体。其中 105噬菌体应用较多，它是一个温和噬菌体，基因组约为39.2Kb，从中发展了不少载体。目标基因普通在体外“包装”之后，经噬菌体介导（转导）而进入宿主菌进行表示,重组DNA表达系统课件,第49页,其 他,乳酸菌,(Lactic acid bacteria),沙门氏菌,(,Salmonella typhimurium,),苏云金杆菌,(,Bacillus thuringiensis,),重组DNA表达系统课件,第50页,重组DNA表达系统课件,第51页,三、真核表示系统,重组DNA表达系统课件,第52页,（一）酵母表示系统,优点：,1、基因背景了解清楚，上游操作简单，生长快速，非常适于大规模发酵。,2、含有一定加工及修饰能力：如二硫键正确形成，前体蛋白水解加工。表示产物与天然蛋白相同或类似。,3、可将异源蛋白基因与N-末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽分泌，在分泌中可对表示蛋白进行糖基化修饰，但其修饰糖链与高等真核细胞并不相同。,4,、可移去起始甲硫氨酸，防止了作为药品使用可能引发免疫反应问题。,重组DNA表达系统课件,第53页,缺点：,产糖量过多因而损坏蛋白质生物活性、安全性等；,糖基化修饰与高等真核细胞并不相同。,重组DNA表达系统课件,第54页,载体：,均为大肠杆菌和酵母菌“穿梭”质粒。有附加体型载体和整合体型载体两种。惯用开启子：GAL1、AOX1、AUG1、TEF1 等。,酵母表示系统载体有：,1、整合型载体:导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染色体基因组,DNA,整合，稳定性高，但基因拷贝数低。,2,、,附加体型载体：在酵母宿主中拷贝数量大，但在传代过程中易丢失，影响重组菌稳定性和表示量。,重组DNA表达系统课件,第55页,常见宿主有：,酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、巴氏毕赤酵母等,。,酿酒酵母表示系统多为附加型载体，巴氏毕赤酵母，多形汉逊酵母表示系统为整合型载体。克鲁维酵母表示系统则兼而有之,酿酒酵母表示系统,缺乏强有力开启子，分泌效率差，表示质粒易于丢失,当前，毕赤酵母表示系统是应用最广泛酵母表示系统,它以甲醇作为唯一碳源。产量较高。翻译后加工更靠近哺乳动物。如日本绿十字企业利用该系统能够到达千克级水平人血清白蛋白生产。,重组DNA表达系统课件,第56页,商品化酵母表示系统有毕赤酵母（,Pichia,）系统（invitrogen）和Saccharomyces酿酒酵母表示系统（invitrogen）,毕赤酵母系统重组蛋白表示量可高达12 g/L，表示量最高。,重组DNA表达系统课件,第57页,（二）,昆虫细胞表示系统,昆虫细胞表示系统是以杆状病毒为载体，昆虫细胞为宿主表示系统。,1、表示效率高。重组蛋白表示水平最高可到达细胞总蛋白50。,2、属于真核表示系统。有糖基化作用、脂肪酸酰基化作用、氨基末端乙酰化作用以及磷酸化，有利于表示产物形整天然高级结构，保持原有生物活性与功效。,3、杆状病毒能容纳较大外源基因而不影响其本身增殖。,重组DNA表达系统课件,第58页,4、杆状病毒属于昆虫病毒。含有高度特异宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性。病毒重组因失去多角体保护，在自然界生存能力很弱，所以比较安全。,5、应用晚期多角体蛋白基因开启子表示外源基因可表示毒性蛋白。,6、杆状病毒表示载体通用性广。可表示来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎全部蛋白，而且能表示带有内含子外源基因。,7、重组杆状病毒除在体外昆虫培养细胞表示外源基因外，还能感染昆虫活体，在体内高效表示外源蛋白。,重组DNA表达系统课件,第59页,缺点：,宿主细胞生长慢,培养基昂贵,含有免疫宿主蛋白、,杆状病毒感染会造成宿主死亡、所以每一轮蛋白合成均需重新感染,昆虫细胞内糖基化方式与脊椎动物细胞内糖基化方式有一定差异，其糖蛋白糖链结构多为简单不分支结构。,重组DNA表达系统课件,第60页,开启子采取多角体蛋白开启子。宿主细胞通常起源于双翅目昆虫，包含果蝇、蚊子。起源于草地夜蛾,（,Spodoptera frugiperda）,Sf9,细胞系是最惯用宿主细胞。,商品化系统：,BaculoDirect 杆状病毒表示系统,（invitrogen,），经典杆状病毒表示系统是利用大肠杆菌中位点特异转座或昆虫细胞中同源重组来产生重组杆状病毒。,DES-,Drosophila,expression system 结合了昆虫细胞高表示水平和哺乳动物细胞稳定表示优点。,重组DNA表达系统课件,第61页,（三）,哺乳动物细胞表示系统,哺乳动物细胞表示系统是生产天然蛋白理想表示系统，是当前应用最广泛动物细胞表示系统。其优点和缺点都极其显著。产物抗原性、免疫原性和功效与天然蛋白质最靠近，糖基化等后加工最准确。普通会产生正确加工、有活性蛋白。,重组DNA表达系统课件,第62页,但该表示系统表示水平较低、培养基昂贵、生长迟缓、含有过敏物质等缺点在实际应用过程中较难防止。,哺乳动物细胞表示系统通惯用来生产用常规方法无法取得真核细胞蛋白。如EPO，TNF受体，基因工程单抗等。,CHO,（中国仓鼠卵巢）是当前重组糖蛋白生产首选体系。,重组DNA表达系统课件,第63页,载体：,1、病毒性载体系统，包含逆转录病毒载体及其它,DNA,病毒载体。,优点：能够高效导入外源基因。,缺点：包装时对其基因组长度有严格限制，插入外源基因普通较短。,2、质粒性载体系统。,优点：适合用于各种细胞；安全。,缺点：导入外源基因效率不如逆转录病毒。,重组DNA表达系统课件,第64页,商品化系统：,ViraPower,慢病毒表示系统，是第一次实现在不分裂哺乳动物细胞中进行稳定高水平基因表示。,Adeno-X,表示系统最有效腺病毒系统之一。,BD Adeno-X,Expression System(Clontech),能够在,2,周内取得高效价腺病毒，其效率远高于其它腺病毒系统。,BD Adeno-X,Tet-On,&Adeno-X,Tet-Off,Expression Systems(Clontech),可表示毒性蛋白质。,BD RevTet-On,&RevTet-Off,Gene Expression Systems(Clontech),表示效率高。,重组DNA表达系统课件,第65页,新霉素抗性选择系统,新霉素是细菌抗生素，它能够干扰原核生物核糖体，使其蛋白质合成不能正常进行，而真核细胞核糖体则不受新霉索影响。新霉素一个类似物G418(geneticin)对真核细胞和原核细胞都有毒性。,重组DNA表达系统课件,第66页,细菌新霉素抗性基因(neo,r,)能在真核细胞表示。neo,r,基因编码一个磷酸转移酶，这种酶能使G418失活。所以，当细胞表示了这种neo抗性基因后就会在含有G418选择培养基中存活，这种选择系统适合用于全部细胞类型。,重组DNA表达系统课件,第67页,外源基因导入哺乳动物细胞,目标基因序列与载体连接后，要导入细胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能取得重组DNA分子克隆，不一样载体在不一样宿主细胞中繁殖，导入细胞方法也不相同。,重组DNA表达系统课件,第68页,转染方法,（一）质粒为载体物理化学转染法,（二）以病毒为载体生物学转染法,重组DNA表达系统课件,第69页,磷酸钙法,其利用基本现象是：DNA如以磷酸钙-DNA共沉淀物形式出现时，培养细胞摄取DNA效率会显著提升。用电穿孔法处理培养哺乳类细胞也能提升细胞摄取DNA能力，但所用外加电场强度、电脉冲长度等条件与处理细菌者都很不相同。,重组DNA表达系统课件,第70页,脂质体,近年来用人工脂质膜包裹DNA，形成脂质体（Liposome）能够经过与细胞膜融合而将DNA导入细胞，方法简单而有效，现有商售脂质体试剂，使用日益广泛。,重组DNA表达系统课件,第71页,显微注射法,是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。,重组DNA表达系统课件,第72页,电穿孔转染法（electroporation）,用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提升转化效率。,重组DNA表达系统课件,第73页,以病毒为载体生物学转染法,将目标基因插入病毒载体，在病毒调控元件作用下进行表示。作为运载工具病毒有SV40，人腺病毒，牛乳头瘤病毒，逆转录病毒等。,重组DNA表达系统课件,第74页,外源基因在真核细胞中表示方式,惯用表示方式有两大类：,1、瞬时表示,2、稳定表示系统,重组DNA表达系统课件,第75页,瞬时表示系统,瞬时表示效率取决于吸收DNA细胞数、基因拷贝数和基因表示水平，在瞬时表示系统中，吸收DNA细胞数约为5%,50%。因为没有整合，伴随细胞生长，细胞群体中外源基因含量逐步降低，最终消失。所以瞬时表示系统只能使用数天。,重组DNA表达系统课件,第76页,瞬时表示惯用于以下方面：依据表示活性确证分离到基因；研究诱变对蛋白质活性和功效影响；分离cDNA文库中基因。这种系统缺点是不能大量繁殖能产生特异蛋白质细胞，故不能取得大量蛋白质(1mg)，也不能用于研究在特定条件下才能表示基因。,重组DNA表达系统课件,第77页,稳定表示系统,假如在转染DNA后进行筛选。则可能得到外源基因整合到染色体中稳定表示细胞。不一样品系细胞转染和整合DNA能力不一样，而在筛选取得稳定表示细胞过程中，整合能力比转染能力更主要。,重组DNA表达系统课件,第78页,重组DNA表达系统课件,第79页,（四）转基因植物,重组DNA表达系统课件,第80页,与微生物和动物生物生物反应器相比,植物生物反应器有不可替换优越性,1.生产成本较低,易于大规模工业生产。植物能进行光合作用,仅需要来自土壤矿物质和水分便可在适宜条件下取得大量人们所需转基因产物,2.植物细胞含有全能性,易于取得再生植株,遗传操作相对简单,培养周期较短,3.转基因植物经过自交得到后代遗传性状稳定,从而能够在植物体内积累多基因,4.产物贮藏在种子、果实和块茎中便于贮运,其中那些能直接食用植物疫苗不需特殊贮存条件,重组DNA表达系统课件,第81页,5.无毒副作用,安全性好,细菌作为生物反应器时,不能对真核生物蛋白进行有效翻译后加工,而且本身可能是人类病原物,动物作为生物反应器时,在细胞培养过程中可能感染上动物病毒而对人类健康造成潜在危害,植物作为生物反应器被认为是相对安全,因为植物体只表示病原菌部分免疫蛋白,不含致病微生物或潜在致病微生物,对人蓄安全,大大提升了表示产物生物安全性,6.植物中蛋白加工路径相对保守,表示产物能进行正确糖基化、磷酸化、酰胺化及翻译后加工过程,所以表示产物含有与高等动物细胞一样免疫原性和生物活性,重组DNA表达系统课件,第82页,植物转基因主要方法,农杆菌导入法这种方法是将农杆菌与植物细胞共同培养,用农杆菌整合目标基因质粒去转化植物细胞,然后经过组织培养,取得转基因植株,基因枪法这种方法用表面附着DNA分子(含目标基因)金属微粒,经过加速装置,轰击植物细胞,将DNA直接射入植物带壁细胞,转化率可达 8%10%。这种方法不受受体种类限制,快速简单,但设备昂贵,花粉管通道法将目标基因整合后,在植株开化时利用花粉管通道直接导入受体植株。这是我国科学工作者创造方法,主要用于棉花转基因研究。,重组DNA表达系统课件,第83页,重组DNA表达系统课件,第84页,转基因植物在医药中应用,疫苗,药用蛋白,重组DNA表达系统课件,第85页,重组DNA表达系统课件,第86页,重组DNA表达系统课件,第87页,转基因植物表示体系问题及处理方案,1、外源蛋白表示量低,蛋白质靶向定位,定位到适当亚细胞部位，如细胞质、内质网腔、叶绿体、液泡等。外源基因整合到叶绿体基因组后表示量最大可到达叶片可溶性蛋白46.1%,对外源基因进行优化,使用植物偏好密码子,优化前导肽序列，取出mRNA中不稳定序列和无效抑制序列，并同时表示有利于正确折叠酶或蛋白质，如分子伴侣等,合理选择开启子并加以改造,使用增强子序列，利用组织特异性开启子，或者人工构建复合式开启子,如与花椰菜花叶病毒35S开启子相比，增强型双35S开启子能够使外源基因转录效率高出10倍,重组DNA表达系统课件,第88页,使用核基质附着区MAR序列,利用染色质高级结构特点，将MAR连接于外源基因两侧，可使外源基因称为一独立转录单元，降低周围序列影响。即可防止外源基因表示位置效应，又可提升外源基因在转化细胞中稳定性和表示水平,使用植物病毒表示载体,病毒载体在宿主细胞中能够重复复制且繁殖速度快，可使外源基因在短时间内大量积累并高效表示,重组DNA表达系统课件,第89页,2、下游加工成本高,对基因表示产物进行提纯费用较高,合理选择受体系统，如将外源基因整合到直接是用植物中或植物可食器官即可防止或部分防止表示产物加工,如香蕉：易消化、口感好，且在热带和亚热带常年生长，是食用疫苗理想宿主,3、安全性问题,植物种类安全性，如烟草烟碱污染,外源基因对生态环境影响,重组DNA表达系统课件,第90页,（五）转基因动物技术及其新药研发中应用,重组DNA表达系统课件,第91页,转基因动物技术始于80年代初，所谓转基因动物就是指以试验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代一类动物。近十年来，转基因动物研究发展十分快速，已先后建立了许多整合有外源基因转基因小鼠和大鼠，转基因鱼、兔、猪、羊、牛等也已诞生。,因为转基因动物体系打破了自然繁殖中种间隔离，使基因能在种系关系很远机体间流动，它将对整个生命科学产生全局性影响，所以转基因动物技术在1991年第一次国际基因定位会议上被公认为遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后第四代技术，被列为生物学发展史上126年中第14个转折点。,重组DNA表达系统课件,第92页,重组DNA表达系统课件,第93页,一、转基因动物技术研究,步骤：,构建功效基因,转移,生殖细胞 假孕母体发育,表型分析,转基因动物,重组DNA表达系统课件,第94页,方法：,原核DNA显微注射法(Pronuclear DNA microinjection),多能性干细胞法（Pluripotent stem cells）,病毒载体法（viral vectors）,精子介导基因转移法（Sperm-mediated gene transfer）,核转移法（nuclear transfer）,重组DNA表达系统课件,第95页,1.原核显微注射法,重组DNA表达系统课件,第96页,原核显微注射法优缺点：,优点：,1.整合效率高；,2.外源基因长度可达数百Kb；,3.直接取得纯系动物，试验周期相对较短。,缺点：,1.设备昂贵、操作复杂；,2.随机整合、拷贝数无法控制；,3.常造成插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺点。,重组DNA表达系统课件,第97页,2多能性干细胞法,主要是胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ESC），是从早期胚胎内细胞团经体外培养建立起来多潜能细胞系，含有胚胎细胞相同形态特征和分化特征。在适当条件下可参加胚胎组成，从而产生嵌合体动物。,ESC法是在基因组对应位点进行同源重组或置换，而将外源DNA定向整合到内源基因组中表示。,重组DNA表达系统课件,第98页,重组DNA表达系统课件,第99页,胚胎干细胞法优缺点：,优点：,在将胚胎干细胞植入胚胎前，能够在体外选择一个特殊基因型；,用外源DNA转染以后，胚胎干细胞能够被克隆，继而能够筛选,含有整合外源DNA细胞用于细胞融合，由此能够得到很多遗传上相同转基因动物。,重组DNA表达系统课件,第100页,缺点：许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因，须深入杂交才能取得转基因动物。,重组DNA表达系统课件,第101页,3病毒载体法,将目标基因以RNA分子形式重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后胚胎，也能够直接将胚胎与能释放逆转录病毒单层培养细胞共孵育以到达感染目标。然后在逆转录整合酶和逆转录病毒基因组末端特异性核酸序列作用下，目标基因将被反转录并整合到宿主基因组中去。,重组DNA表达系统课件,第102页,病毒载体法优缺点：,优点：,1.目标基因呈单一位点单拷贝整合、整合率高；,2.插入位点克隆分析较轻易；,缺点：,1.不安全；,2.转入基因承载能力有限，普通小于10Kb；,3.所得转基因动物嵌合性很高，建立转基因系需要广泛杂交；,4.逆转录病毒基因组两侧长末端重复序列（longterminal repeats,LTR