[经济学]第二节-其他重要工具酶PPT课件.ppt

第二第二节节其它重要的工具其它重要的工具酶酶1-DNA 聚合聚合酶酶（DNA polymerase）DNA聚合聚合酶酶是催化以是催化以DNA或或RNA为为模板合成模板合成DNA的一的一类类酶酶的的总总称。称。经经常使用的常使用的DNA聚合聚合酶酶有大有大肠肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶酶I(全全酶酶)、Klenow 酶酶、T4DNA聚合聚合酶酶、T7DNA聚合聚合酶酶、耐高温的、耐高温的TaqDNA聚合聚合酶酶以及反以及反转录转录酶酶等。等。这这些些DNA聚合聚合酶酶的共同特点是：它的共同特点是：它们们都能都能够够把脱氧核糖核把脱氧核糖核苷酸苷酸(dNTP，包括，包括dATP、dTTP、dCTP和和dGTP)连续连续的加到双的加到双链链DNA引物引物链链的的3-羟羟基末端上，催化核苷酸的基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的聚合，形成新的DNA链链。2-DNA 聚合聚合酶酶IDNA聚合聚合酶酶I 具有三种活性，即具有三种活性，即5 3 聚合活性、聚合活性、5 3 外切活性和外切活性和35外切活性。外切活性。DNA聚合聚合酶酶 I 要要发挥发挥作用需作用需满满足以下三个条件。足以下三个条件。底物和激活底物和激活剂剂：DNA聚合聚合酶酶 I 催化聚合反催化聚合反应应需要四种需要四种dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)作作为为底物，同底物，同时时Mg2是不可缺少的激活是不可缺少的激活剂剂。带带有有3-端端羟羟基末端的引物：基末端的引物：DNA聚合聚合酶酶 I 所催化的聚所催化的聚合反合反应总应总是在引物的是在引物的3-OH末端基末端基团团和和搀搀入的入的dNTP 之之间间发发生的，且只能沿引物末端由生的，且只能沿引物末端由5 3 方向延伸。方向延伸。DNA模板：可以是模板：可以是ssDNA 或或dsDNA，后者只有在其主，后者只有在其主链链上有一至数个断裂的情况下才能成上有一至数个断裂的情况下才能成为为有效的模板。有效的模板。3-实验实验室中，利用室中，利用 DNA聚合聚合酶酶I，通，通过过DNA缺口平移的方缺口平移的方法制法制备备DNA探探针针，可以用于核酸，可以用于核酸杂杂交分析。交分析。双双链链DNA的的单链单链缺口在缺口在DNA聚合聚合酶酶I 的的5 3 外切作外切作用下，从缺口的用下，从缺口的5端逐步水解核苷酸端逐步水解核苷酸时时，酶酶的聚合活性的聚合活性则则利利用缺口的用缺口的3端游离端游离羟羟基逐个加上相基逐个加上相应应的的单单核苷酸，使得缺核苷酸，使得缺口向下游移口向下游移动动，这这种缺口移种缺口移动动的的现现象就称象就称为为缺口平移缺口平移。如果反如果反应应中使用的是用同位素中使用的是用同位素标记过标记过的的单单核苷酸底物，核苷酸底物，则则合合成成产产生的生的DNA分子即可作分子即可作为带为带放射性放射性标记标记的的DNA分子分子杂杂交探交探针针。DNA聚合聚合酶酶I4-DNA 聚合聚合酶酶I 大片段大片段(Klenow 片段片段)是是E.coli DNA聚合聚合酶酶I的蛋白水解的蛋白水解产产物，特点是：物，特点是：具有具有DNA聚合聚合酶酶活性和活性和3 5 核酸外切核酸外切酶酶活性，但缺活性，但缺失了失了53核酸外切核酸外切酶酶活性。活性。Klenow既保留了全既保留了全酶酶的高保真性，又不会降解的高保真性，又不会降解DNA5 末端。末端。用途：在基因工程中主要用于切口平移法用途：在基因工程中主要用于切口平移法标记标记DNA，同，同时时也可用于也可用于DNA的的缺口缺口补补平平和延伸。和延伸。5-用途：用途：用随机引物制用随机引物制备备探探针针补补平平5 突出端，形成平末端突出端，形成平末端切除切除3 突出端，形成平末端突出端，形成平末端合成合成cDNA第二条第二条链链诱变诱变反反应应中第二条中第二条链链的合成的合成双脱氧法双脱氧法DNA序列序列测测定定(Sanger 法法)DNA聚合聚合酶酶I 大片段大片段(Klenow 片段片段)6-DNA聚合聚合酶酶I 大片段大片段(Klenow 片段片段)7-T4 DNA聚合聚合酶酶在模板及引物存在的条件下，在模板及引物存在的条件下，T4 DNA聚合聚合酶酶催化沿催化沿53方向合成方向合成DNA。此。此酶酶还还具有具有35外切核酸外切核酸酶酶的活性，的活性，该该活性比活性比DNA聚聚合合酶酶I 强强。与。与E.coli DNA聚合聚合酶酶I不同，不同，T4 DNA聚合聚合酶酶不具有不具有53外切核酸外切核酸酶酶活性。活性。8-T4 DNA聚合聚合酶酶缺口填充缺口填充(无无链链置置换换活性活性)产产生平末端的最佳用生平末端的最佳用酶酶补补平平5突出端，形成平末端突出端，形成平末端切除切除3突出末端，形成平末端突出末端，形成平末端通通过过置置换换合成法合成法标记标记探探针针单链删单链删除后除后亚亚克隆克隆基因定点突基因定点突变变中第二条中第二条链链的合成的合成9-DNA片段的末端平滑化示例片段的末端平滑化示例10-T7DNA聚合酶T7DNA聚合聚合酶酶是从受是从受T7噬菌体感染的大噬菌体感染的大肠肠杆菌杆菌寄主寄主细细胞中胞中纯纯化出来的一种复合形式的核酸化出来的一种复合形式的核酸酶酶。它由两种它由两种亚亚基基组组成：一种是成：一种是T7噬菌体基因噬菌体基因5编编码码的蛋白的蛋白质质，其分子量，其分子量为为84kD；另一种是大；另一种是大肠肠杆杆菌菌编码编码的硫氧的硫氧还还蛋白蛋白(thioredoxin)，其分子量，其分子量为为12kD。11-T7DNA聚合聚合酶酶是目前已知的持是目前已知的持续续合成能力最合成能力最强强的的DNA聚合聚合酶酶，能，能连续连续合成数千个核苷酸。合成数千个核苷酸。除聚合活性以外，除聚合活性以外，T7 DNA聚合聚合酶酶还还具有具有单链单链和双和双链链的的35外切外切酶酶活性，它的活性也很活性，它的活性也很强强，约为约为Klenow酶酶的的1000倍。倍。T7DNA聚合聚合酶酶不具有不具有53外切外切酶酶活性。由于活性。由于T7DNA聚聚合合酶酶的高度的高度续进续进性和不受性和不受DNA二二级结级结构的影响，在分子生构的影响，在分子生物学中常被用于物学中常被用于长长模板模板DNA的引物延伸反的引物延伸反应应。同。同时时，经经修修饰饰的的T7DNA聚合聚合酶酶还还是双脱氧是双脱氧终终止法止法对长对长片段片段DNA进进行行测测序的理想工具序的理想工具酶酶。T7 DNA聚合聚合酶酶12-碱性磷酸碱性磷酸酶酶（Alkaline Phosphatase）碱性磷酸碱性磷酸酶酶是一是一类类能特异性地切去能特异性地切去DNA或或RNA的的5-磷酸基磷酸基团团的工具的工具酶酶，它它们们的作用底物可以是的作用底物可以是ssDNA或或dsDNA或或RNA，也可以是，也可以是NTP或或dNTP。用途用途1）去除）去除DNA片段的片段的5-末端的磷酸基。防止末端的磷酸基。防止线线状状DNA的自身的自身环环化化（Self-Ligation）。）。2）除去）除去PCR反反应应后残存的后残存的dNTP。PCR产产物物进进行行测测序序时时，在反，在反应应体体系中如果有多余的系中如果有多余的Primer和和dNTP，将影响，将影响测测序反序反应应的正常的正常进进行。使行。使用用Exonuclease I分解残存的分解残存的Primer；用；用SAP处处理可降解多余的理可降解多余的dNTP，之后不需要，之后不需要对对PCR产产物物进进行精制，立即可以行精制，立即可以进进行行测测序反序反应应。13-从从细细菌中分离的碱性磷酸菌中分离的碱性磷酸酶酶(Alkaline Phosphatase,E.coliC75;BAP)从小牛从小牛肠肠中分离的碱性磷酸中分离的碱性磷酸酶酶(Alkaline phosphase,calf intestinal,CAP)。从从虾虾提取的提取的虾虾碱性磷酸碱性磷酸酶酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP）碱性磷酸碱性磷酸酶酶14-碱性磷酸碱性磷酸酶酶15-T4多聚核苷酸激多聚核苷酸激酶酶（T4 polynucleotidekinase，PNK）DNA或或RNA5末端的磷酸化，以便末端的磷酸化，以便进进行行连连接反接反应应。DNA或或RNA的末端的末端标记标记，用作探，用作探针针和和进进行行DNA测测序。序。16-双双链链DNA片段的磷酸化片段的磷酸化在微量离心管中配置溶液如下：在微量离心管中配置溶液如下：3737反反应应3min,703min,70反反应应5 51010分分钟钟使使酶酶失活。失活。进进一步用酒精沉淀的方法精制一步用酒精沉淀的方法精制DNADNA。T4polynucleotidekinase2lATP(10mM)5l10reactionbuffer5l双双链链DNA片段片段10 pmol 超超纯纯水水补补足足50l17-18-DNA酶酶I（DNase）DNA酶酶I（DNaseI）是随机水解双）是随机水解双链链或或单链单链DNA的一种内切的一种内切酶酶，使，使DNA分子降解成分子降解成带带有有5磷酸末磷酸末端的端的单单核苷酸和寡核苷酸的混合物。核苷酸和寡核苷酸的混合物。进进行重行重组组DNA研究研究时时，必，必须须注意防止注意防止DNA酶酶的的污污染，否染，否则则制制备备的的DNA样样品将会降解。品将会降解。因此使用的器皿或因此使用的器皿或试剂试剂要高温要高温处处理，理，样样品中需加品中需加EDTA，或放置冰上以破坏或抑制，或放置冰上以破坏或抑制酶酶活性。活性。19-用用途途1）与）与DNA Polymerase I一起用于切口平移一起用于切口平移（Nick translation）。）。2）在）在Mn2+存在的条件下，存在的条件下，为鸟枪为鸟枪法法测测序（序（Shot gun sequencing）制作）制作DNA文文库库。3）用于足迹法（）用于足迹法（Foot printing）分析）分析DNA-蛋白蛋白质质相互作用。相互作用。4)DNase I可以作用于可以作用于单链单链 DNA、双、双链链DNA、染色染色质质和和RNA:DNA杂杂交交链链。20-21-RNA酶A（Ribonuclease A）RibonucleaseA是一种内切核糖核酸是一种内切核糖核酸酶酶，可在可在C和和U残基位置特异性降解残基位置特异性降解单链单链RNA。该该酶酶可以切割核苷上可以切割核苷上5-核糖与核糖与邻邻近近嘧啶嘧啶核核苷苷3-核糖上磷酸基核糖上磷酸基团团之之间间的磷酸二脂的磷酸二脂键键。产产生的生的2，3-环环磷酸可以水解成相磷酸可以水解成相应应的的3-核苷磷酸核苷磷酸盐盐。22-产产品用途：品用途：质质粒和基因粒和基因组组DNA制制备时备时用于去除用于去除RNA；重重组组蛋白蛋白质质制制备过备过程中，除去溶液中的程中，除去溶液中的RNA。23-质粒提取后用RNA酶处理24-其它的其它的RNA酶酶RNA 酶酶T1只作用于只作用于鸟鸟嘌嘌呤核苷酸的呤核苷酸的3磷酸根，磷酸根，切开与其相切开与其相邻邻核苷酸核苷酸连连接的接的5磷酸磷酸键键；RNase H可以降解可以降解DNA-RNA杂杂交交链链中的中的RNA分子。分子。25-防防护护RNA酶酶的的污污染染人体的分泌物如唾液、汗液中都含有人体的分泌物如唾液、汗液中都含有RNA酶酶。因此在操作因此在操作RNA样样品品时时，必，必须须戴手套，戴手套，实实验验用的玻璃器皿都要用的玻璃器皿都要经经250烘烤烘烤4h(RNA酶酶耐耐热热)，或用，或用RNA酶酶的抑制的抑制剂剂处处理。理。26-末端末端转转移移酶酶的主要用途的主要用途末端脱氧核苷酸末端脱氧核苷酸转转移移酶酶简简称末端称末端转转移移酶酶，分子量，分子量为为60kD，来源于前淋巴来源于前淋巴细细胞和分化早期的胞和分化早期的类类淋巴淋巴样细样细胞。在二价阳离胞。在二价阳离子的存在下，子的存在下，该该酶酶能能够够逐个地将脱氧核苷酸分子加到逐个地将脱氧核苷酸分子加到线线性性DNA 分子的分子的3-OH末端。末端末端。末端转转移移酶酶在反在反应过应过程中不需要模程中不需要模板的存在。板的存在。对对不同的不同的dNTP所需要的二价阳离子不同，若加入的核苷酸所需要的二价阳离子不同，若加入的核苷酸是是嘧啶嘧啶核苷酸，核苷酸，则则Co2+为为首首选选阳离子；如果加入的核苷酸是阳离子；如果加入的核苷酸是嘌嘌呤核苷酸，呤核苷酸，则则Mg2+为为首首选选阳离子。阳离子。当反当反应应体系中只有一种体系中只有一种dNTP时时，就可以在，就可以在DNA分子的分子的3末末端加上同聚物尾巴端加上同聚物尾巴(homopolymeric tail)。27-末端末端转转移移酶酶的主要用途的主要用途分分别给别给外源外源DNA片段和片段和载载体分子加上互体分子加上互补补的同聚的同聚物尾巴，以使它物尾巴，以使它们们可以可以连连接起来。接起来。例如：可以例如：可以给给用做克隆用做克隆载载体的体的线线性性DNA分子的分子的3-OH末端加上末端加上poly(dT)尾巴，尾巴，给给待克隆的外源待克隆的外源DNA片段的片段的3-OH末端加上末端加上poly(dA)尾巴。然后将外源尾巴。然后将外源DNA连连接于接于载载体中，形成重体中，形成重组组DNA 分子。分子。28-末端末端转转移移酶酶的主要用途的主要用途29-DNA连接酶作用机制及特点DNA连接酶(DNAligase)能利用NAD+或ATP中的能量，催化多段DNA的3羟基和5磷酸末端之间形成3，5-磷酸二酯键，把两个DNA片段连接在一起，封闭DNA双链上形成的切口(见图3-3)。连接酶和限制酶一样是基因工程中不可缺少的重要工具。应当注意，DNA连接酶只能连接双链DNA分子的单链切口(nick)，既不能催化两条单链DNA分子的连接(T4DNA连接酶例外)，也不能催化双链中一个或多个核苷酸缺失所造成的缺口(gap)。30-DNA连接酶的分类常用的DNA连接酶有T4DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶两种。在这两种连接酶中，最常使用的是T4DNA连接酶，它的连接效率高，既可用于黏性末端的连接，也可用于平齐末端的连接。一般来说，片段越小，末端黏性越强，连接反应则可使用较高的温度。DNA平齐末端的连接比黏性末端连接效率低得多。平齐末端的连接一般需要在1020进行，且需要较高的DNA浓度和T4DNA连接酶的浓度。而黏性末端的连接一般在1626进行。31-大大肠肠杆菌杆菌 DNA连连接接酶酶催化的催化的连连接反接反应应中所需要的能量由中所需要的能量由NAD+提供，提供，T4 DNA连连接接酶酶催化的反催化的反应应中所需要的能量由中所需要的能量由ATP提供。提供。其他方面大其他方面大肠肠杆菌杆菌DNA 连连接接酶酶和和T4 DNA连连接接酶酶的作用的作用机制相同。机制相同。32-各种各种连连接接酶酶特性的比特性的比较较33-34-反反转录转录酶酶商品化的反商品化的反转录转录酶酶有两种，一种来自禽成髓有两种，一种来自禽成髓细细胞胞瘤病毒瘤病毒(AMV)，另一种来自大，另一种来自大肠肠杆菌中表达的杆菌中表达的Moloney鼠白血病病毒鼠白血病病毒(Mo-MLV)。它它们们均具有：均具有：依依赖赖于于RNA的的DNA聚合聚合酶酶活活性；性；RNase H活性活性(即持即持续续地、特异地降解地、特异地降解DNA-RNA杂杂交交链链中的中的RNA链链的活性的活性)；依依赖赖于于DNA的的DNA聚合聚合酶酶活性。活性。AMV及及Mo-MLV反反转录转录酶酶在在许许多方面有差多方面有差别别，如如RNase H活性活性强强弱，最适反弱，最适反应应温度及温度及pH等。等。35-反反转录转录酶酶的主要作用是将的主要作用是将mRNA转录转录成双成双链链 cDNA，并可用反，并可用反转录转录的的cDNA进进行序行序列分析，再推列分析，再推导导出出RNA序列。序列。反反转录转录酶酶36-Taq DNA聚合聚合酶酶Taq DNA聚合聚合酶酶是一种是一种热稳热稳定定DNA聚合聚合酶酶，因从，因从生存在生存在热热泉水中的耐泉水中的耐热热的水生嗜的水生嗜热热菌菌(Thermus aquaticus)体内分离得到而命名。体内分离得到而命名。Taq DNA聚合聚合酶酶最适反最适反应应温度是温度是72，但能，但能够够耐耐受受96，即使在，即使在100处处理理5min 也能具有一半也能具有一半活性。活性。这这种种热稳热稳定定DNA聚合聚合酶酶的的发现发现解决了早期解决了早期PCR反反应应中所存在的中所存在的DNA聚合聚合酶酶在在DNA变变性温性温度下也会度下也会变变性的性的问题问题，使，使PCR反反应实现应实现了自了自动动化化循循环环反反应应。这这也是也是PCR技技术术能被广泛能被广泛应应用的重要用的重要原因。原因。37-现现在市在市场销场销售的售的TaqDNA聚合聚合酶酶是将是将这这种种酶酶的基因的基因转转入入E.coli细细胞中表达的胞中表达的产产物。物。TaqDNA聚合聚合酶酶的分子的分子质质量量为为95kD，有，有强强的的53DNA聚合聚合酶酶活性，但缺乏活性，但缺乏35外切外切酶酶活性，能活性，能扩扩增增长长达几千个碱基达几千个碱基对对的的DNA片段。片段。38-39-40-