流式细胞仪专题知识讲座.pptx

流式细胞仪专题知识讲座流式细胞仪专题知识讲座流式细胞仪专题知识讲座第1页总览总览l 流式细胞术基础知识l 流式细胞仪组成l 数据采集与分析流式细胞仪专题知识讲座第2页流式细胞技术是什么？流式细胞技术是什么？l流式细胞术流式细胞术在流动状态中检测细胞或颗粒各项特征在流动状态中检测细胞或颗粒各项特征特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析可检测样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，可检测样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞，微生物实体组织，培养细胞，微生物Flow CytometryFlow:Fluid Cyto:Cell Metry:Measurement流式细胞仪专题知识讲座第3页流式细胞术检测样本流式细胞术检测样本0.4um40um流式细胞仪专题知识讲座第4页流式细胞术检测指标流式细胞术检测指标l流式细胞术提供信息：流式细胞术提供信息：-相对细胞大小相对细胞大小 -相对细胞颗粒密度和内部复杂度相对细胞颗粒密度和内部复杂度 -染色过细胞相对荧光强度染色过细胞相对荧光强度流式细胞仪专题知识讲座第5页细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=DNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量=染色体分析染色体分析 细胞功效细胞功效=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核特异核特异性抗原性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体=细胞凋亡细胞凋亡在上述信号基础上细胞分选在上述信号基础上细胞分选流式细胞术应用流式细胞术应用流式细胞术应用流式细胞术应用流式细胞仪专题知识讲座第6页流式细胞仪组成流式细胞仪组成l液流系统：形成层流系统，聚焦细胞l光学系统：产生和搜集光学信号l电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理流式细胞仪专题知识讲座第7页Fluidics DiagramSheath Flowsheath tanksheath tankSample Flowsheathsheathinterior reservoirinterior reservoirwastewasteinterior reservoirinterior reservoirsheath filtersheath filtersample injectionsample injectiontube(SIT)tube(SIT)test tubetest tubeor plateor plateflow cellflow cellinterrogation pointinterrogation pointbubble filterbubble filterwaste tankwaste tank流式细胞仪专题知识讲座第8页液流系统液流系统流式细胞仪专题知识讲座第9页光学系统光学系统l激发光学系统包含:-激光器-透镜和反射镜，将激光引导到检测区域l搜集光学系统包含:-滤光片，将产生光信号引导到对应光学接收器流式细胞仪专题知识讲座第10页流式细胞仪专题知识讲座第11页流式细胞仪专题知识讲座第12页光学系统光学系统流式细胞仪专题知识讲座第13页流式细胞仪专题知识讲座第14页光学系统光学系统-滤光片滤光片460 500 540460 500 540460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50LongpassShortpassBandpass流式细胞仪专题知识讲座第15页流式细胞仪专题知识讲座第16页流式细胞仪专题知识讲座第17页电子系统电子系统LaserLaserLaserLaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage流式细胞仪专题知识讲座第18页电子系统电子系统流式细胞仪专题知识讲座第19页电子系统电子系统流式细胞仪专题知识讲座第20页Reviewl悬浮状态细胞l单个流过流动室l细胞被激发l产生散射光和荧光 信号l信号被采集l转换成数字信号l存放于电脑上液流系统液流系统光学系统光学系统电子系统电子系统流式细胞仪专题知识讲座第21页回顾回顾流式细胞仪三大组成个别？流式细胞仪三大组成个别？滤光片滤光片LP600代表什么意思？代表什么意思？BP400/40呢？呢？流式细胞仪专题知识讲座第22页数据采集数据采集l三种数据：三种数据：-前向散射光FSC -侧向散射光SSC -各种荧光散射光FL1，FL2，FL3，FL4流式细胞仪专题知识讲座第23页l当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进方向相同）上可用前向散射光接收通道前向散射光接收通道接收到一定量散射光l前向散射光强度是和细胞或其它检测颗粒大小、形状亲密相关数据采集数据采集-前向散射光前向散射光流式细胞仪专题知识讲座第24页l当激光光源被使用时，侧向也有一定量散射光产生，能够用9090o o 角侧向散射光检测通道角侧向散射光检测通道来采集l侧向散射光强度和细胞或其它检测颗粒颗粒密度、内部复杂程度亲密相关数据采集数据采集-侧向散射光侧向散射光流式细胞仪专题知识讲座第25页外周全血细胞散射光双参数点外周全血细胞散射光双参数点图图 颗粒杂质、气泡颗粒杂质、气泡对检测影响对检测影响流式细胞仪专题知识讲座第26页l细胞标识上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长激发光来激发，同时发出特定波长光l荧光物质被激发以后产生发射光将由特定荧光通道来接收l特定检测是经过光学滤片和透镜来控制数据采集数据采集-荧光信号荧光信号l荧光强度是和细胞上标识上荧光染料量正相关荧光强度是和细胞上标识上荧光染料量正相关流式细胞仪专题知识讲座第27页数据采集数据采集流式细胞仪专题知识讲座第28页电压电压l信号放大方式：log、linl信号类型：A,W,Hl电压调整:依据阴性对照管来调整流式细胞仪专题知识讲座第29页阈值阈值l能够以任意参数及多个参数组合作为阈值l大多数样本都能够设定FSC/SSCl阈值以下信号不存放l依据阴性对照管来调整l目标是将不需要杂质信号，噪音信号，无用细胞信号等扣除，使搜集到都是有用信号流式细胞仪专题知识讲座第30页流式细胞仪专题知识讲座第31页流式细胞仪专题知识讲座第32页赔偿赔偿l赔偿方式：任意两个通道之间，能够采取手动或自动赔偿。l赔偿调整:依据单染对照管来调整流式细胞仪专题知识讲座第33页流式细胞仪专题知识讲座第34页流式细胞仪专题知识讲座第35页流式细胞仪专题知识讲座第36页流式细胞仪专题知识讲座第37页流式细胞仪专题知识讲座第38页1.)Compensation-Too Little;Too Much流式细胞仪专题知识讲座第39页2.)Basic Principles of Compensation-%Compensation is independent of fluorescence intensity流式细胞仪专题知识讲座第40页3.)Compensation-Too Dim,Too Bright Compensation ControlsSmall errors in compensation of a dim control(A)can result in large compensation errors with bright reagents(B&C).流式细胞仪专题知识讲座第41页数据分析数据分析l 流式数据流式数据直方图直方图散点图散点图等高线图等高线图密度图密度图三维图三维图统计数据统计数据流式细胞仪专题知识讲座第42页直方图直方图l直方图直方图(Distribution Histogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是，单位是对数，能够是线性或对数坐标。对数，能够是线性或对数坐标。纵坐标普通是细胞数。纵坐标普通是细胞数。流式细胞仪专题知识讲座第43页散点图散点图l散点图散点图(Dot Plot)X坐标为该细胞一参数相对含量，坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一坐标为该细胞另一参数含量，能够将细胞亚群分开。参数含量，能够将细胞亚群分开。流式细胞仪专题知识讲座第44页等高线图和密度图等高线图和密度图流式细胞仪专题知识讲座第45页三维图三维图流式细胞仪专题知识讲座第46页统计数据统计数据lEventsl百分比l平均荧光强度l荧光中位值lCVlSDl流式细胞仪专题知识讲座第47页数据获取与分析电压电压阈值阈值赔偿赔偿 取得数据取得数据 画图画图设门设门统计统计流式细胞仪专题知识讲座第48页