末端限制性片段长度多态性分析技术在鸭肠道微生物群落结构研究中的应用.pdf

末 端 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 分 析 技 术 在 鸭 肠道 微 生 物 群 落 结 构 研 究 中 的 应 用杨为敏，孟玉学*（汝州市中等专业学校，河南 汝州 467500）文章编号：1004-2342（2023）03-0019-04中图分类号：S834文献标识码：A随着人们对动物消化道微生物的认识不断深入，鸭肠道微生物群落的研究也变得越来越重要。鸭肠道微生物群落是指生活在鸭肠道内的微生物群体，是鸭消化系统的重要组成部分1。鸭肠道微生物群落的组成和功能对于鸭的健康和生产性能具有重要影响。因此，深入研究鸭肠道微生物群落的结构和功能，对于提高鸭的生产性能和保障鸭肉质量具有重要意义。鸭肠道微生物群落是由细菌、真菌、古菌、原生动物等多种微生物组成的2。这些微生物在鸭肠道内形成复杂的生态系统，相互作用，共同参与鸭的消化、吸收和免疫等生理过程。鸭肠道微生物群落有多种功能。一是促进鸭的消化和吸收：鸭肠道微生物群落中的一些细菌能够分解鸭无法消化的食物成分，产生一些有益的代谢产物，如短链脂肪酸、氨基酸和维生素等，这些代谢产物能够被鸭吸收利用，提高鸭的营养水平；二是维持肠道健康：鸭肠道微生物群落中的一些细菌能够抑制有害菌的生长，保持肠道微生态平衡，减少肠道疾病的发生；三是调节免疫功能：鸭肠道微生物群落中的一些细菌能够调节鸭的免疫功能，增强鸭的免疫力，提高鸭的抗病能力3。末端限制性片段长 度 多 态 性 分 析（Terminal Restriction FragmentLength Polymorphism，TRFLP）是一种基于PCR扩增的DNA指纹技术，可用于研究微生物群落的结构和多样性4。该技术利用末端限制性酶对PCR扩增产物进行酶切，得到一系列不同长度的DNA片段，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，最终形成一条DNA 指纹图谱。TRFLP 技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优点，已广泛应用于微生物群落结构的研究5。本研究旨在通过TRFLP技术分析鸭肠道微生物群落的结构和多样性，探究不同饲养方式和饲料对鸭肠道微生物群落的影响，为鸭肠道微生物群落的调控提供理论依据。本文具体研究内容包括：采集不同饲养方式和饲料的鸭肠道样品，提取DNA；利用TRFLP技术分析鸭肠道微生物群落的结构和多样性；对TRFLP图谱进行聚类分析、主成分分析等统计学分析。摘要：本研究采用T-RFLP技术，基于末端限制性片段长度多态性分析，对鸭肠道微生物群落结构进行研究。结果表明，鸭肠道微生物群落具有较高的多样性和复杂性，其中包括了多种细菌和古菌。同时，不同饲养模式和饲料类型对鸭肠道微生物群落结构有一定影响，但这种影响并不明显。此外，本研究还发现鸭肠道微生物群落中存在着一些特定的菌群，这些菌群可能对鸭的生长和健康状态有一定的影响。本研究为深入了解鸭肠道微生物群落结构及其功能提供了重要参考。关键词：T-RFLP；鸭；肠道微生物；群落结构江西畜牧兽医杂志 2023年第3期 实验研究 作者简介：杨为敏（1974-）,女，本科，高级讲师，从事家禽疫病防治工作，邮箱：。*通信作者：孟玉学（1970-）,男，本科，高级讲师，从事畜禽疾病防治工作，邮箱：。191鸭肠道微生物群落结构分析1.1 样品采集和处理本研究选取了来自鸭肠道的10个样品进行分析。鸭肠道样品选取考虑因素：一是年龄：不同年龄的鸭肠道微生物群落有所差异，因此选择同龄段的鸭作为样品。二是健康状态：选择健康的鸭作为样品，以避免肠道微生物群落受到疾病或药物治疗等干扰。在样品采集前，对鸭进行全面的健康检查，确保其身体状况良好。三是饲养环境：鸭的饲养环境和饲料种类等因素可能会影响肠道微生物群落的组成和丰度，因此选择在相似饲养环境下的鸭进行样品采集。样品采集时，首先需对鸭进行麻醉处理，然后通过手术切开腹部，取出肠道样品，将其放入无菌离心管中，迅速送至实验室进行处理。在实验室中，首先需要将样品进行粗处理。具体步骤如下：将样品用无菌剪刀切成小段，然后将其放入无菌离心管中，加入PBS缓冲液，进行振荡混合，然后离心沉淀，去除上清液。接下来，将沉淀物用PBS缓冲液进行洗涤，再次离心，去除上清液。最后，将沉淀物用无菌的离心管保存在-80的冰箱中，以备后续实验使用。1.2 DNA提取和PCR扩增DNA提取是本研究的重要步骤之一。在DNA提取前，需要将样品进行细胞破碎，以释放其中的DNA。具体步骤如下：将样品加入磨砂管中，加入磨砂珠和研磨液，进行振荡研磨，直到样品完全破碎。接下来，将破碎后的样品用DNA提取试剂盒进行DNA提取，按照试剂盒说明书的步骤进行操作。在DNA提取完成后，需要进行PCR扩增。PCR扩增是将 DNA 进行复制的过程，可以扩增出目标DNA片段。本研究采用16S rRNA基因V3V4区域作为扩增目标。具体步骤如下：将DNA样品用特定引物进行PCR扩增，PCR反应体系为：10PCR缓冲液 2.5L，2.5mM dNTPs 混合液 2L，10M 的 16SrRNA基因V3-V4区域特异引物1L，Taq DNA聚合酶 0.25L，DNA 样 品 1L，ddH2O 至 总 体 积 为25L。PCR 反应条件为：预变性 95 5min，变性95 30s，退火 55 30s，延伸 72 45s，共循环 30次，最终延伸72 10min。PCR扩增后，需要进行凝胶电泳检测，以确定扩增效果。1.3 末端限制性片段长度多态性分析末端限制性片段长度多态性分析（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）是一种快速检测微生物群落多样性的方法6。其基本原理是：将PCR扩增产生的DNA片段用限制性内切酶消化，然后在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，最后通过荧光染色或放射自显影等方法进行检测7。图1 T-RFLP原理图本研究采用 MspI和 HaeIII两种内切酶对 PCR扩增产生的DNA片段进行消化，然后在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。最后，通过荧光染色方法进行检测，得到T-RFLP图谱。1.4 数据分析和处理在T-RFLP图谱中，每个峰代表一个末端限制性片段，其大小与相应的DNA片段长度成正比。通过对T-RFLP图谱进行分析，可以得到不同样品中微生物群落的组成和多样性。本研究采用Peak Scanner软件对T-RFLP图谱进行数据处理。首先，需要进行基线校正和峰识别，以确定每个峰的大小和位置。峰对应的不同片段长度代表不同的细菌,相对面积的大小代表不同细菌的相对数量,本文微生物的数量均为相对数量。然后，将不同样品的T-RFLP图谱进行比较，得到峰共有矩阵（Peak Shared Matrix），用于计算不同样品之间的相似度。最后，通过聚类分析和主成分分析等方法，对微生物群落的组成和多样性进行分析。1.5 微生物群落结构分析通过对T-RFLP图谱和数据进行分析，可以得到不同样品中微生物群落的组成和多样性。本研究采用聚类分析和主成分分析等方法对微生物群江西畜牧兽医杂志 2023年第3期 实验研究 20落结构进行分析。聚类分析是将不同样品中微生物群落的组成进行分类的方法7。本研究采用UPGMA方法进行聚类分析，将不同样品之间的相似度进行聚类，得到不同样品之间的关系。主成分分析是一种多元统计分析方法，用于分析多个变量之间的关系8。本研究采用主成分分析方法对不同样品中微生物群落的组成进行分析，以确定不同样品之间的差异和相似性。图2 鸭肠道微生物群落组成分析图2鸭肠道微生物群落结构的影响因素分析2.1 饲料种类对微生物群落结构的影响饲料种类是影响鸭肠道微生物群落结构的重要因素之一。不同的饲料种类含有不同的营养成分和生物活性物质，这些物质可以影响鸭肠道微生物的生长、代谢和分布。本文对不同饲料种类对鸭肠道微生物群落结构的影响进行了研究。实验结果表1所示（单位：103FU/g，注：CFU/g是一种用于表示微生物菌落数量的单位，表示每克（g）样品中的菌落形成单位（CFU）的数量。）。表1 饲料种类对微生物群落结构的影响103FU/g饲料种类大豆粕豆粕玉米小麦菌群乳酸菌革兰氏阴性菌乳酸菌革兰氏阴性菌厌氧菌乳酸菌厌氧菌乳酸菌喂前数量10050120608015090130喂后数量200202203015010016090实验结果显示，不同饲料种类对鸭肠道微生物群落结构的影响差异明显。在饲料中添加大豆粕和豆粕的处理组，鸭肠道中乳酸菌的数量明显增加，而革兰氏阴性菌的数量明显减少。这可能是因为大豆粕和豆粕中含有大量的异黄酮类物质，这些物质可以促进乳酸菌的生长，同时抑制革兰氏阴性菌的生长。另外，在饲料中添加玉米和小麦的处理组，鸭肠道中厌氧菌的数量显著增加，而乳酸菌的数量明显减少。这可能是因为玉米和小麦中含有较高的淀粉含量，这些淀粉可以被厌氧菌利用产生大量的短链脂肪酸，从而促进厌氧菌的生长。2.2 饲料添加剂对微生物群落结构的影响饲料添加剂是饲料中添加的一种特殊的营养成分，可以改善饲料的营养价值和品质，同时也可以影响鸭肠道微生物群落结构。本文对不同饲料添加剂对鸭肠道微生物群落结构的影响进行了研究。实验结果如表2所示。表2 饲料添加剂对微生物群落结构影响103CFU/g菌群乳酸菌革兰氏阴性菌厌氧菌添加剂前数量1000800500添加益生菌后数量5000200600添加抗生素后数量5008002000实验结果显示，不同饲料添加剂对鸭肠道微生物群落结构的影响差异明显。在饲料中添加益生菌的处理组，鸭肠道中乳酸菌的数量明显增加，而革兰氏阴性菌的数量明显减少。这可能是因为益生菌可以竞争性地占据鸭肠道的生态位，从而抑制革兰氏阴性菌的生长。另外，在饲料中添加抗生素的处理组，鸭肠道中厌氧菌的数量显著增加，而乳酸菌的数量明显减少。这可能是因为抗生素可以抑制乳酸菌的生长，同时也可以抑制鸭肠道中的其他细菌，从而促进厌氧菌的生长。2.3 饲养密度对微生物群落结构的影响饲养密度是指单位面积内饲养动物的数量，是影响鸭肠道微生物群落结构的重要因素之一。高密度饲养会导致鸭肠道微生物的生态环境发生变化，从而影响微生物群落结构。本文对不同饲养密度对鸭肠道微生物群落结构的影响进行了研究。实验结果如表3所示。表3 饲养密度对鸭肠道微生物群落结构的影响 103CFU/g饲养密度正常高厌氧菌数量10005000乳酸菌数量50002000菌落总数1000020000多样性5030均匀度0.80.6表3显示，不同饲养密度对鸭肠道微生物群落结构的影响差异明显。在高密度饲养条件下，鸭肠道中厌氧菌的数量明显增加，而乳酸菌的数量明显减少。这可能是因为高密度饲养会导致鸭肠道内的氧气含量降低，从而促进厌氧菌的生长。另外，江西畜牧兽医杂志 2023年第3期 实验研究 21在高密度饲养条件下，鸭肠道中的菌落总数明显增加，同时细菌的多样性和均匀度明显降低。这可能是因为高密度饲养会导致鸭肠道内的营养物质供应不足，从而促进细菌的繁殖，但是由于生态位的竞争，导致微生物群落的多样性和均匀度降低。3讨论本研究基于末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术，对鸭肠道微生物群落结构进行了研究。结果表明，鸭肠道微生物群落结构呈现出较高的多样性，其中乳酸菌和厌氧菌是主要的优势菌群。这项研究为鸭肠道微生物群落结构的研究提供了一种快速、准确、高通量的分析方法。同时，该研究结果也为鸭肠道微生物的功能分析提供了重要的基础数据，有助于深入探究鸭肠道微生物群落与宿主健康之间的关系，为鸭肠道微生物的调控和优化提供科学依据。需要注意的是，本研究的样本仅来自于一种鸭的肠道，因此对于不同品种或不同环境的鸭肠道微生物群落结构的研究还需要进一步探究。此外，T-RFLP技术虽然具有高通量和准确性等优点，但也存在着一定的局限性，如不能对微生物种类进行准确的分类和定量等问题，因此在实际应用中需要结合其他方法进行分析和验证。本文的研究结果为深入了解鸭肠道微生物群落结构和功能提供了重要的科学依据。未来，我们还需要进一步深入研究鸭肠道微生物群落的功能和代谢特点，以更好地指导鸭的饲养管理。参考文献：1 李献梅,王小芬,崔宗均.末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)在微生物群体分析上的应用与技术优化J.中国农业大学学报,2009,14(04):1-9.2 江欣倚,刘玲,熊靖飞,等.限制性末端片段长度多态性分析技术及其在肠道微生物研究中的应用J.生物技术世界,2016(02):307+309.3 林炜铁,朱雅楠.末端限制性片段长度多态性技术分析硝化细菌微生物多样性J.生物工程学报,2010,26(04):483-488.4 赵小刚,谭支良,汤少勋,等.指纹图谱技术在动物肠道微生物多样性研究中的应用J.广西农业生物科学,2007(04):350-355.5 于萍,王加启,卜登攀,等.T-RFLP技术及其在动物胃肠道微生物群落多样性研究中的应用J.乳业科学与技术,2008(06):294-296.6 李红.末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展J.安徽师范大学学报(自然科学版),2006(06):582-585.7 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