乙肝临床意义.ppt

时间分辨临床意义 乙肝“两对半”定量检测及临床应用乙型肝炎的病因HBVHBV颗粒，又称Dane颗粒，直径42nm抵抗力:耐受566小时及一般消毒剂；10010分钟，或6510小时可灭活。37可保存7天，-20可保存15年流行状况在美国在美国100125万慢性患者大部分新感染者为 20-39岁大约 50%有急性症状大约 5,000 由于慢性肝炎死亡 在中国在中国HBsAg携带达10%（高发地区13%）2800万乙肝患者每年新发病人23/10万感染率5080%,南方高于北方全球全球3.53.5亿带菌者亿带菌者,几乎一半几乎一半在中国在中国乙型肝炎的危害性WHO估计2000年全球慢性HBV感染达4000万全球因乙肝死亡数100万/年慢性HBV感染是引起肝硬化和肝细胞癌的最主要原因肝癌(HCC)在HBV感染者的发病率是正常人群的1000倍(江苏启东,广西龙安)3040%肝硬化病人的尸检是HCC,而90%HCC的发生在肝硬化的基础上我国每年有数以万计的人死于肝硬化和HCC传播途径血液传播药癖者感染医院性传播科室分布:消化,肝胆,普外和中医科(收容肝病多),口腔,化验,中心实验室,胃镜室,普外(接触机会多)感染机会高,血液,慢性肾衰病人(常需输血和透析),肿瘤病人,移植病人(免疫低下)针刺感染:受伤者HBsAb6月为慢性感染高浓度表示高复制,100ng/ml常同时伴HBeAg(+)低浓度的HBsAg可能是:在感染的恢复期,病毒低复制或不复制组织病变高度活动时,病毒和抗原已被部分清除可能是病毒变异HBsAg(-)仍有可能HBV感染,排除检测试剂灵敏度问题,可能是血清中含量的差异乙肝表面抗体(HBsAb)当失去 HBsAg后的恢复指标疫苗注射后的免疫性评价指标在HBV感染恢复期时:多克隆抗体做试剂时,出现HBsAg和HBsAb都为阴性的所谓“窗口期”单克隆抗体做试剂时,3%的病人出现HBsAg和HBsAb都为阳性单一低浓度的HBsAb可能是假阳性(用一步反应夹心法的试剂)单一单克隆抗体的使用会漏检(亚型或变异)乙肝核心抗体(HBcAb)表示现在或以前感染与恢复或免疫无必然联系由于HBcAg的高免疫原性,故HBcAb产生比HBsAb早且多,持续时间长(长达数十年)在我国正常人群中有10%的单一HBcAb(+)高浓度的HBcAb表示现行感染,常与HBsAg并存,主要是IgM,伴肝损伤,肝功能指标异常低浓度的HBcAb表示过去感染,常与HBsAb共存,主要是IgG,无肝损伤或已静息HBcAb含IgM,IgA和IgG,在感染中依此出现和消失,IgG长期存在乙肝核心抗体IgM(HBcIgM)表示急性感染发病一周出现占90%,也有1个月持续时间2134周,14%超过1年高滴度是诊断急性乙肝的“标准”(但需特殊标定)IgM(+),即使HBsAg(-),也可诊断急性肝炎IgM(-),即使HBsAg(+),却可能是慢性HBV感染重叠其它病原的急性病变暴发性乙型肝炎:可检出48倍的IgM浓度慢性乙型肝炎:肝细胞破坏,释放HBcAg产生免疫应答,可检出低水平IgM反应肝组织炎症:浓度与炎症程度相关反应病毒复制和干扰素治疗的监控:对-干扰素有效治疗的慢性乙肝病人,在Hbe血清转换前常有IgM滴度升高,后降至治疗前水平乙肝e抗原(HBeAg)病毒复制相关,常与HBV-DNA水平一致于急性慢性感染中存在缺乏的话,不代表病毒复制不存在在中国,30%的HBV感染者HBeAg(+),其中:80%自然阴转10%持续HBeAg(+)10%应病毒变异而阴性药物治疗的一个监测指标多个国际著名药厂肝炎治疗药物的评价,如Glaxo的拉米呋定,施贵宝的恩替卡韦,Roche公司的干扰素等,包括全国唯一一家CAP认证的实验室-美迪生(MDS),使用雅培的肝炎试剂进行药物临床评估乙肝e抗体(HBeAb)当与 HBeAg 消失出现表示病毒复制渐趋静息HBe血清转换似为HBV感染过程的一个转折点但在慢性活动性肝病HBeAb(+)未必表示病毒不复制有些HBeAg消失后不出现HBeAb当与 HBV-DNA 并存时可能表示前C区变异只有一种IgG抗体在HBV感染病人中,HBeAg和HBeAb同时阳性的有34%乙肝血清指标一般简图不一致或不常见的血清指标模式HBsAg 阳性 AntiHBc阴性HBsAg，Anti-HBs 和 AntiHBc阳性单一AntiHBc阳性HBsAg阴性，HBeAg阳性HBeAg和Anti-Hbe同时阳性单一HBsAg急性HBV感染的早期,应随之出现HBeAg,HBc-IgM,如仍单独出现,需做确认在慢行HBV感染中,HBsAg和HBcAb共存占95%,并常伴HBeAg或HBeAb,无HBe可出现在转换“窗期”,或感染恢复期HBeAb已消失,HBsAg不伴HBcAb很少见,一旦出现为HBcAb缺失单一HBsAb注射HB疫苗或高价乙肝免疫球蛋白(HBIG)正常人群(非人工免疫)有510%的阳性率如浓度较低,注意非特异性反应一般为IgM抗体,无保护性,仍可再感染HBVHBsAg和HBsAb并存少数感染恢复期可出现,常规试剂可能是非特异性反应在慢性HBV感染者中有35%二者共存,但并不表明HBsAg的清除或感染的恢复,可能是:前后感染二种HBV亚型,或HBsAg与抗体间低亲和反应S基因变异,HBsAg抗原性改变,原型HBsAb不能清除IFN治疗出现HBsAb血清转换,因S基因变异,而未能清除HBsAgHB疫苗接种,有正常的HBsAb应答HBsAg(-)而HBeAg(+)编码HBeAg的基因片段的短暂整合Source:Lau JNY,et al.J Hepatol,1993;17:258HBV感染,但HBcAb(-)抗原复合:高HBV复制,HBcAb被过量的HBcAg所掩蔽种族差异:我国7个民族的HBV感染,HBcAb缺失3.440%免疫缺陷:缺乏HBcAg特异的T细胞,体外无淋巴细胞增殖反应,单核细胞不能吞噬HBcAg颗粒,可能是抗原提呈细胞的缺陷HBsAg携带母亲出生的婴儿,由于母体的HBcAb的阻断,可无HBcAb的应答在免疫缺陷病人中出现肿瘤病人化疗所引起的免疫耐受病毒变异:前C区缺失和其它变异单一的HBcAb(+)小孩:HBsAg(+)的母亲由于胎盘的屏障不能传递HBsAg给胎儿,但HBcAb可通过,出生后将逐渐消失成人:感染后恢复感染后恢复:急性感染后“窗期”,主要是IgM抗体,随后出现HBsAb,但也可由于免疫应答较低未产生HBsAb,也可出现HBsAb后再消失低水平感染状态低水平感染状态:单一HBcAb(+)活动性慢性肝炎病人,60%可检出HBV-DNA(+),单一HBcAb(+)的“健康”人中,30%可检出病毒.这种无症状携带状态,可较长时间存在(注意数学后感染).相对浓度越高,HBV-DNA的检出率越高,低相对浓度常预示过去感染不常见模式的问题解释用新波试剂有部分病例不符常见模式原因:试剂灵敏度提高病毒变异,亚型抗原复合物的形成主动或被动免疫的表现药物治疗的表现种族差异免疫缺陷或耐受对于这些情况,建议继续跟踪75-85%急性发病血清转换图慢性乙肝携带者后期(小三阳)慢性乙肝携带者无血清学转变(大三阳)乙肝表面抗原“消失”变异什么是 HBsAg 消失变异?当感染乙肝病毒后，病毒在人体内复制当病毒复制时，变异会自然发生。在某些条件下，会加速其发生变异是改变了核酸序列，从而导致氨基酸序列的改变对于选择性压力下，乙肝 HBsAg 变异可能会出现在疫苗和治疗中如:HBIG 治疗。野生型的HBV可能被中和，而变异株仍然存在，并具有活性References:Oon,C.J.et al.1995.Molecular epidemiology of Hepatitis B virus vaccine variants in Singapore.Vaccine 13:699-702.Coleman,P.F.et al.1999.Immunoassay Detection of Hepatitis B Surface Antigen Mutants.Journal of Medical Virology 59:19-24.Hunt,C.M.et al.2000.Clinical Relevance of Hepatitis B Viral Mutations.Hepatology 31:1037-1044.HBsAg消失变异在哪些情况下经常发生至少有以下三种情况:1)在HBsAg阴性个体中仍有HBV存在 2)对于母亲HBsAg阳性，新生儿疫苗接种失败 3)对于正位肝移植，免疫预防剂失败(OLT)Reference:Locarnini,S.A.1998.Hepatitis B Virus Surface Antigen and Polymerase Gene Variants:PotentialVirological and Clinical Significance.Hepatology 27:294-297.orthotopic哪些是最常发生的HBsAg 变异通常于免疫区段称“a”决定簇,aa124-147其中更容易变异的为接近于aa141145(此部位是抗体必需结合的部位)。最多的据报道是Gly-145-Arg抗原,抗体是免疫反应的核心!References:Coleman,P.F.et al.1999.Immunoassay Detection of Hepatitis B Surface Antigen Mutants.J.Med.Virol.59:19-24.Ijaz,S.et al.Novel Immunoassay for the Detection of Hepatitis B Surface Escape Mutants and Its Application in Liver Transplant Recipients.J.Med.Virol.63:210-216.为什么HBsAg变异重要Kalinina et al.第一个报道，HBV S 于暴肝中分离的变异导致严重的病毒分泌缺陷，此现象造成细胞迅速死亡，而肝衰竭。Gly 145 Arg 为其中的一个变异造成暴肝。Kalinina,et al.2001.A Dominant Hepatitis B Virus Population Defective in Virus Secretion Because of Several S-Gene Mutations from a Patient With Fulminant Hepatitis.Hepatology 34:385-394.为什么HBsAg变异重要影响乙肝防疫(疫苗),流行(血站,医院筛查)和诊断假阴性结果将会产生不必要的复杂性或延误诊断.漏检HBsAg部分后果q90%感染HBV 的新生儿将成为慢性携带者。根据美国CDC的统计此人群中的死亡率为 15-25%(见CDC website http:/www.cdc.gov)q美国 CDC 估计美国 22,000 HBV阳性的母亲将产子。有变异情况的约 1.0-4.6%。所以在美国此人群中,每年有220-1012 人发生变异未经统计的其他人群的漏检q长期慢性乙肝病人的病毒突变q经历多种治疗方案的乙肝病人-治疗压力q病毒复杂共感染人群q免疫系统疾病的乙肝人群q其他(移植等)低水平HBsAg测定的重要性国内低水平HBsAg病人的分布情况正常人群中低水平的HBsAg(5ng/ml)为23%在HBsAg(+)人群中占2324%其中1ng/ml占45%左右(在低水平HBsAg样品中)提高检测灵敏度的重要性中国肝炎人口多,基数大造成确诊的困难医院内的感染输血传播母婴传播的阻断HBsAb定量在疫苗评估中的推荐German Permanent Vaccination Commission(STIKO)国内疫苗评价标准无应答者:无抗体产生(5%人群百分比)-加强计量复种低应答者:100mIU/ml(20%人群百分比)无须复种德国STIKO疫苗评价推荐无应答者:无抗体产生-复种并随访Anti-HBs低应答者:100mIU/ml 10年后复种 血清乙肝标志物（两对半）定性测定始于80年代中期，对乙肝的疾病诊断、病程监测、疗效观察起到了一定的作用。肝炎的恢复是一个动态过程，用阳性或阴性来判定结果会给临床带来许多困惑。随着临床医学的迅速发展，定性检测已远远不能满足临床及患者的要求。由于受检测抗原抗体“定性”结果不是“阴性”就是“阳性”，只能作程序式的、机械的判断，对某些结果不能作出合理解释，存在较大的缺陷，无法动态观察病情和疗效变化，为临床所能提供的信息有限。随着医学检验中新型标记方法的建立（时间分辨荧光免疫分析技术），使得“两对半”定量测定成为可行，大大弥补了酶标（ELISA）定性检测的不足之处。乙肝“两对半”检测历史提高了检测的灵敏度 时间分辨荧光免疫技术（TRF）检测HbsAg灵敏 度 可 达 0.2ng/ml，而 酶 标（ELISA）检 测HbsAg灵敏度是1ng/ml，也就是说只有血清中的HbsAg达到1ng/ml酶标才会呈阳性。急性乙肝早期诊断 急性乙肝早期：TRF定量能及早检出HbsAg，确证HBV感染，几乎能与preS1同时检测，在病程观察中大大缩短“窗口期”时间，而酶标在乙肝早期检测往往HbsAg呈阴性。慢性乙肝：一些患者由于机体对HBV包膜蛋白(HbsAg)表达较低，酶标检测可出现HbsAg和抗-Hbs均阴性的情况，而TRF技术则可避免这些情况的出现，为正确判断病情提供依据 变异病毒的检测病毒发生变异后，表达量较低，常规ELISA测不出抗原，而TRF定量具有极高的灵敏度，可发现并极有可能同时检测出HbsAg和抗-Hbs。血清中HbsAg含量和病人对HbsAg细胞免疫成反比关系，而肝功能改变则与此种细胞免疫成正比。定量HbsAg是反映这一关系的唯一手段。一些群体如医护工作者、病人家属等，由于长期密切接触，但又非直接经血传播感染成急性乙肝，而是长期少量感染，并刺激机体产生一定的免疫力，可能呈低浓度感染，特别应当引起人们的足够重视，密切关注并采取措施防止发展成乙肝或慢性携带者。发现低浓度HbsAg携带者 以动态观察疗效和病情监测疾病的发生、发展、疗效、预后是一个动态的变化的过程，TRF定量检测乙肝“两对半”各项标志物的浓度变化可对乙肝的病程、治疗、预后起一个全程动态检测的作用，能够为医生对病情疗效作出合理的解释提供依据，指导治疗。HbsAg和抗-Hbs的动态变化定量分析HbsAg和抗-Hbs的浓度变化，可以预见急性乙肝是否处于恢复期。如HbsAg浓度降低，抗-Hbs的浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展。反之，HbsAg浓度处于较高水平或上升趋势，而抗-Hbs一直处于较底水平，则容易发展为慢性乙肝或携带者。HbeAg和抗-Hbe的动态变化定量分析HbeAg和抗-Hbe的浓度变化，可以反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测HbeAg向抗-Hbe转换的时期，即表现为HbeAg浓度（NCU）下降和抗-Hbe浓度（NCU）升高的过程。高浓度的HbeAg还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。高浓度的抗-Hbe一方面提示病情的好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。抗-Hbc指标的变化抗-Hbc浓度的高低可以反映病毒感染的状态。高浓度的抗-Hbc提示乙肝急性感染，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持续高浓度。而低浓度的抗-Hbc一般为恢复期或既往感染。有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈进行性变化。一步法(固相载体,样品和标记物同时一起孵育,并在最后检测前只有一步冲洗)，这对较多干扰物质的疾病，如:肝炎，甲状腺激素和肿瘤标志物，容易产生干扰而使分析的灵敏度和特异性都受到影响二步法(二个冲洗步骤，一次在固相载体和样品孵育之后，第二次在加入标记物孵育之后)可以确保好的结果。如：消除非特异性蛋白结合，内源性的干扰物质和HOOK效应关于一步法和二步法关于一步法和二步法两步冲洗法-可避免此效应高浓度样品高浓度的结合物前带/后带效应的机制固相载体一步法 和 两步法 比较一步法一步法优点：相同的其他因素时，一步法可增加灵敏度可降低成本，包括：劳动力和时间，自动化仪器缺点：夹心法有HOOK效应(10000ng/ml)非特异性反应其他样本质素的干扰两步法两步法优点：特异性较好 无HOOK效应 结果稳定，精密度较好 仍具有相当的灵敏度（其 它因素有提高空间）缺点：成本相对略高 一般操作时间延长 HbeAg阳性慢性肝炎，由于HBV野生型感染引起，其自然史分HbeAg阳性期和抗-Hbe阳性期。定量测定能明确检测HbeAg向抗-Hbe转化的时期，即表现为HbeAg浓度（NCU）的下降和抗-Hbe（NCU）浓度（NCU）升高的过程。抗-Hbe阳性慢性肝炎，主要由前C基因突变株HBV感染所致，也称异型慢性肝炎。始终不出现HbeAg，但HBV-DNA进行复制。HbsAg亦在高浓度处变动。与前者HbeAg阳性慢性肝炎中的转化期比较，“两对半”定性均表现为小三阳，但后者主要表现在高HbsAg浓度，忽高忽低的ALT值和HBV-DNA始终阳性。这类病人往往对干扰素、拉米呋啶治疗效果不佳。慢性乙肝的分类 结合PCR诊断病情血清HBV-DNA荧光定量PCR测定可以直接反映病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态。HBV-DNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态，正确判断预后和治疗。如果HBV-DNA阴性而HbsAg、HbeAg或抗-Hbe及抗-Hbc浓度均还较高，提示并未完全痊愈，有可能病毒再次出现复制状况，尚须密切关注。如果HBV-DNA阴性而HbsAg、HbeAg或抗-Hbe及抗-Hbc浓度均很低或阴性并持续一段时间，提示可能完全痊愈，预后疗效良好。抗-Hbs的含量在10mIU/mI以上病人在用ELISA检测就可呈抗-Hbs“阳性”结果，但并不提示机体都一定具有免疫力，而抗-Hbs的含量在10-100mIU/mI之间的样本，定性虽为“阳性”，但此时机体对HBV的免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染，仍有感染HBV的危险。只有抗-Hbs的含量达到100mIU/mI以上时才可确定具有抵抗HBV入侵的作用。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。对乙肝的预防起到监督作用结束语在慢性肝病的治疗过程中，病人对了解自己病情的变化最为关切。定量测定乙肝血清标志物的浓度使病人能够对自己的病情有更清楚的了解，提高治疗信心，同时也加强对医生的信任度，有助于改善医患关系，利于疾病治疗。