转基因基本步骤.doc

转基因基本步骤
第一步：目的基因的获取
1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。
2。原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
3.PCR技术扩增目的基因
（1）原理:DNA双链复制
（2）过程:
第一步：加热至90～95℃DNA解链;
第二步：冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

第二步：基因表达载体的构建
1。目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用.
2。组成:目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质.
（2）终止子:也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端。
(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来.常用的标记基因是抗生素基因。

第三步：将目的基因导入受体细胞_
1。 转化的概念:
是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2。常用的转化方法:
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等.
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是:先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步:目的基因的检测和表达
1。首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术.
2。其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。
3。最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。
4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。