农业大学病毒学实验技术之病毒纯化.pptx

第六章第六章 病毒纯化病毒纯化 利用各种物理、化学方法，以利用各种物理、化学方法，以不使不使病毒受损伤和失活为前提病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩病毒样品。缩病毒样品。病毒微细结构研究病毒微细结构研究病毒抗原蛋白分离纯化病毒抗原蛋白分离纯化病毒化学成份及其遗传物质研究病毒化学成份及其遗传物质研究病毒感染分子细节研究病毒感染分子细节研究农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第1页一、病毒纯化标准一、病毒纯化标准保持感染性保持感染性含有均一性：含有均一性：结晶形成结晶形成检测病毒制备物均一性方法：检测病毒制备物均一性方法：电镜观察：电镜观察：大小、形态均一大小、形态均一超速离心：超速离心：沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带电泳：电泳：颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带免疫学方法：免疫学方法：只与特异性抗体发生反应只与特异性抗体发生反应大小、形态、密度、化学组成、大小、形态、密度、化学组成、分子量、抗原性分子量、抗原性农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第2页二、病毒纯化理论依据二、病毒纯化理论依据病病毒毒体体外外表表面面主主要要化化学学组组成成是是蛋蛋白白质质，可可利利用蛋白质提纯方法纯化病毒用蛋白质提纯方法纯化病毒病病毒毒体体含含有有一一定定大大小小、形形状状和和密密度度，可可利利用用超速离心技术提纯病毒超速离心技术提纯病毒农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第3页三、病毒纯化前预处理三、病毒纯化前预处理1 1、病毒感染组织、脏器或细胞、病毒感染组织、脏器或细胞 研磨匀浆研磨匀浆超声波处理超声波处理重复冻融重复冻融低速离心去掉细胞碎片低速离心去掉细胞碎片2 2、细胞培养液、鸡胚尿囊液、细胞培养液、鸡胚尿囊液 低速离心去掉可能含有杂质或直接用于低速离心去掉可能含有杂质或直接用于病毒分离纯化病毒分离纯化农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第4页沉淀法沉淀法超速离心法超速离心法超滤法超滤法层析法层析法两相溶剂间分配系数法两相溶剂间分配系数法吸附法吸附法电泳法电泳法四、病毒纯化方法四、病毒纯化方法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第5页（一）沉淀法（一）沉淀法 主要从稀病毒悬浮液中浓缩病毒。主要从稀病毒悬浮液中浓缩病毒。中性盐沉淀法（盐析）中性盐沉淀法（盐析）聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法皂土法皂土法鱼精蛋白沉淀法鱼精蛋白沉淀法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第6页1 1、中性盐沉淀法（盐析）、中性盐沉淀法（盐析）先用其它方法去除材料中大量杂质，再以先用其它方法去除材料中大量杂质，再以高浓度中性盐溶液盐析，析出沉淀用缓冲液悬高浓度中性盐溶液盐析，析出沉淀用缓冲液悬浮后再进行盐析，重复几次后，悬浮沉淀，用浮后再进行盐析，重复几次后，悬浮沉淀，用透析法或其它方法脱盐。透析法或其它方法脱盐。病毒普通在病毒普通在45%45%以上饱和度硫酸铵溶液中沉以上饱和度硫酸铵溶液中沉淀，且保持感染性。淀，且保持感染性。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第7页2 2、聚乙二醇（、聚乙二醇（PEGPEG）沉淀法）沉淀法 用于病毒沉淀分子量：用于病毒沉淀分子量：-6000 -6000 将将PEGPEG配配成成50%50%左左右右溶溶液液，或或直直接接将将固固体体PEGPEG加加于于病病毒毒悬悬液液中中，使使其其到到达达所所需需浓浓度度，在在44搅搅拌拌过过夜，然后离心使病毒沉淀。夜，然后离心使病毒沉淀。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第8页3 3、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物原理：原理：A A、降低溶液介电常数，从而增加病毒颗粒、降低溶液介电常数，从而增加病毒颗粒表面不一样电荷之间引力，造成其溶解度降表面不一样电荷之间引力，造成其溶解度降低。低。B B、与水作用，破坏蛋白质分子水化膜。、与水作用，破坏蛋白质分子水化膜。优点：优点：分辨力高，易除去分辨力高，易除去缺点：缺点：易使表面蛋白质变性，溶解脂质易使表面蛋白质变性，溶解脂质农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第9页4 4、等电点沉淀法（分辨力不高）、等电点沉淀法（分辨力不高）原理：原理：病毒粒子在等电点时，所携带正电荷与负病毒粒子在等电点时，所携带正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥作用而发生沉电荷相互中和，因而失去相互排斥作用而发生沉淀（分辨力不高）。淀（分辨力不高）。多数病毒等电点在多数病毒等电点在pH4.pH4.5.55.5之间。之间。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第10页5 5、皂土法、皂土法 轮状病毒轮状病毒 皂土在酸性条件下（皂土在酸性条件下（pH4pH44.5)4.5)可吸附轮状病可吸附轮状病毒，在碱性条件下毒，在碱性条件下(pH8.5)(pH8.5)，又使其洗脱下来。，又使其洗脱下来。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第11页6 6、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于50nm50nm病毒）病毒）鱼精蛋白为碱性蛋白，含有携带其它蛋白质（直鱼精蛋白为碱性蛋白，含有携带其它蛋白质（直径大于径大于50nm 50nm）共沉淀作用，当向这种沉淀物加入）共沉淀作用，当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl1mol/L NaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中，时，其它蛋白质又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白依然沉淀。而鱼精蛋白依然沉淀。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第12页（二）层析法（二）层析法葡聚糖柱层析法葡聚糖柱层析法凝胶层析法凝胶层析法离子交换柱层析法离子交换柱层析法亲和层析法亲和层析法 农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第13页（三）两相溶剂间分配系数法（三）两相溶剂间分配系数法原理：原理：溶质在两个互不相溶溶剂中分配系数不一样而溶质在两个互不相溶溶剂中分配系数不一样而选择性地分配于其中一方。选择性地分配于其中一方。惯用溶剂：惯用溶剂：葡聚糖硫酸盐（葡聚糖硫酸盐（dextran sulphate,Ds)dextran sulphate,Ds)聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）甲基纤维素（甲基纤维素（MCMC）聚乙烯醇（聚乙烯醇（PVAPVA）分配体系：分配体系：Ds-PEGDs-PEG系、系、Ds-PVADs-PVA系、系、Ds-MCDs-MC系系农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第14页（四）吸附法（四）吸附法原理：原理：利用对病毒或对杂质有选择吸附能力固体利用对病毒或对杂质有选择吸附能力固体吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定盐溶液把吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定盐溶液把它们洗脱下来。它们洗脱下来。作为吸附剂必须具备特点：作为吸附剂必须具备特点：有较大表面积和吸附能力有较大表面积和吸附能力较高吸附选择性较高吸附选择性便于洗脱便于洗脱性质稳定性质稳定农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第15页惯用吸附剂：惯用吸附剂：白土白土磷酸钙磷酸钙硅藻土硅藻土红细胞红细胞离子交换树脂离子交换树脂羧甲基纤维素羧甲基纤维素农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第16页（六）超滤法（六）超滤法 利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。优点：优点：可用于大容量样品浓缩可用于大容量样品浓缩能够在室温或低温下操作能够在室温或低温下操作对被浓缩产物损害小对被浓缩产物损害小浓缩同时可到达部分纯化浓缩同时可到达部分纯化回收率高回收率高可预防外来污染可预防外来污染（五）电泳法（五）电泳法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第17页（七）离心法（七）离心法差速离心差速离心速度区带离心法速度区带离心法密度梯度离心密度梯度离心 农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第18页1.1.差速离心法差速离心法原理：原理：不一样大小和比重粒子沉降速度不一样。不一样大小和比重粒子沉降速度不一样。用用途途：从从组组织织培培养养液液、鸡鸡胚胚尿尿囊囊液液或或经经过过红红细细胞胞吸附释放病毒悬液中提纯病毒。吸附释放病毒悬液中提纯病毒。优点：优点：可快速处理大量样品可快速处理大量样品步步 骤骤：低低 速速（-3000r/min,-3000r/min,20-30min)20-30min)、中中 速速（10000min,10000min,20-30min)20-30min)去去除除较较大大宿宿主主细细胞胞碎碎片片、污污染染细细菌菌及及其其它它较较大大杂杂质质。再再选选择择较较高高速速度度离离心心1-2h1-2h使病毒沉淀。使病毒沉淀。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第19页速度梯度离心法速度梯度离心法密度梯度离心法密度梯度离心法原理原理沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度不一样进行分离沉降与颗粒密度成正比，以物质浮密度不一样进行分离介质介质密密度度小小，1-1.3286，预预制制梯度，不连续梯度，不连续密密度度大大，1-1.9025，连连续续梯度梯度离心力场离心力场强强，离离心心速速度度高高，使使被被分分离物质易沉降离物质易沉降稍稍强强，速速度度相相对对低低，使使CsCl形形成成梯梯度度，建建立立沉沉降降扩散平衡扩散平衡离心过程离心过程 样品向离心管底沉降样品向离心管底沉降样品停留于介质等密度部位离心时间离心时间 较短，几小时到几十小时较短，几小时到几十小时较长，十几小时到数天较长，十几小时到数天2.速度梯度离心法与密度梯度离心法速度梯度离心法与密度梯度离心法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第20页A.速度梯度离心速度梯度离心B.密度梯度离心密度梯度离心AB农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第21页五、病毒纯化应注意问题五、病毒纯化应注意问题1 1、保持病毒感染性、保持病毒感染性 严格控制温度、严格控制温度、pHpH及试剂选择。及试剂选择。2 2、选取适宜纯化试验起始材料、选取适宜纯化试验起始材料无其它病毒或毒株污染无其它病毒或毒株污染病毒体含量高病毒体含量高杂质含量少并易于处理杂质含量少并易于处理农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第22页3 3、依据详细情况选择提纯方法、依据详细情况选择提纯方法 依据需要纯化病毒性质、起始材料特点、依据需要纯化病毒性质、起始材料特点、研究目标以及试验室条件等，选择适宜纯化方研究目标以及试验室条件等，选择适宜纯化方法。法。4 4、建立灵敏病毒判定和测定方法、建立灵敏病毒判定和测定方法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第23页六、伪狂犬病毒浓缩提纯六、伪狂犬病毒浓缩提纯1 1、病毒材料、病毒材料 将伪狂犬病病毒接种于将伪狂犬病病毒接种于PK-15PK-15细胞，病变细胞，病变后搜集细胞培养物，重复冻融后搜集细胞培养物，重复冻融3 3次，即为样品次，即为样品材料。材料。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第24页2 2病毒提纯浓缩病毒提纯浓缩去去细细胞胞碎碎片片及及杂杂质质：将将细细胞胞培培养养物物4 4 3000r/min3000r/min离离心心30min30min，搜集上清液。，搜集上清液。硫硫酸酸铵铵沉沉淀淀：按按100ml100ml病病毒毒液液42.5g42.5g硫硫酸酸铵铵量量加加入入硫硫酸酸铵铵，搅搅匀匀后后置置44冰冰箱箱搅搅拌拌沉沉淀淀过过夜夜，4 4 5000r/min5000r/min离心离心40min40min，去上清，沉淀用适量灭菌，去上清，沉淀用适量灭菌ddHddH2 2O O悬浮。悬浮。透透析析：将将悬悬浮浮病病毒毒液液装装于于透透析析袋袋中中，于于ddHddH2 2O O或或PBSPBS中中搅搅拌拌透透析析，每每半半个个小小时时换换一一次次液液，共共换换5 5次次，第第5 5次次透透析过夜。析过夜。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第25页浓缩：浓缩：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病毒浓缩至适当体积。毒浓缩至适当体积。超离纯化：超离纯化：l在在离离心心管管中中加加入入不不一一样样浓浓度度甘甘油油垫垫层层，即即先先加加入入45%45%甘油，再加入甘油，再加入5%5%甘油。甘油。l加入病毒悬液（应不超出离心管总容积加入病毒悬液（应不超出离心管总容积10%10%）。）。l0-25000r/min0-25000r/min离心离心2h2h。l弃弃上上层层液液体体，沉沉淀淀用用适适量量TENTEN重重悬悬（涡涡旋旋或或超超声声波波处理，使沉淀分散）。处理，使沉淀分散）。l速度区带离心速度区带离心农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第26页l密度梯度离心密度梯度离心l在在离离心心管管中中加加入入不不一一样样浓浓度度CsClCsCl或或蔗蔗糖糖垫垫层层，再再加入病毒悬液，超高速离心。加入病毒悬液，超高速离心。l蔗蔗糖糖密密度度梯梯度度离离心心：在在离离心心管管中中加加入入20%20%60%60%不不连连续续蔗蔗糖糖密密度度梯梯度度,0-25000r/min0-25000r/min离离心心2h2h3h 3h，搜搜集集蔗蔗糖糖浓浓度度为为35%35%处处病病毒毒带带，加加入入适适量量缓缓冲冲液液稀稀释释后后，再再次次0-0-25000r/min25000r/min离心离心2h2h，沉淀用适量，沉淀用适量TENTEN重悬。重悬。P PrVrV鄂鄂A A株电镜观察株电镜观察l左图：上带中左图：上带中P PrVrV粒子粒子l右图：下带中右图：下带中P PrVrV粒子粒子农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第27页浓缩（方法二）浓缩（方法二）l将将经经低低速速离离心心去去掉掉细细胞胞碎碎片片及及杂杂质质病病毒毒悬悬液液直直接接0-25000r/min0-25000r/min离心离心2h2h。l弃上层液体，沉淀用适量弃上层液体，沉淀用适量TENTEN重悬。重悬。l将重悬病毒液再经梯度离心纯化。将重悬病毒液再经梯度离心纯化。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第28页怎样利用纯化病毒进行下一步研究怎样利用纯化病毒进行下一步研究l研究病毒结构研究病毒结构l研究病毒感染分子细节研究病毒感染分子细节病毒粒子标识病毒粒子标识研究与受体结合研究与受体结合研究病毒侵入研究病毒侵入研究病毒在体内移行研究病毒在体内移行农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第29页病毒纯化病毒纯化质谱分析质谱分析靶蛋白验证靶蛋白验证纯化病毒是不是只含有病毒蛋白？纯化病毒是不是只含有病毒蛋白？农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第30页PRV怎样侵入细胞免疫金标识确定病毒细胞受确定病毒细胞受体体解析病毒侵入细解析病毒侵入细胞分子细节胞分子细节 是当前病毒感染是当前病毒感染研究重点研究重点农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第31页Internalization of IHNV particles through clathrin-mediated endocytosis利用量子点利用量子点(quantum dots)(quantum dots)标识研究病毒侵入标识研究病毒侵入农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第32页