高效液相色谱-HPLC讲课教案.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,（一）高效液相基础知识,高志国,（,2017.03.29,）,2017,年样品检测组操作技能培训,色谱法原理与分类,HPLC,的组成,HPLC,的应用,HPLC,色谱图名词术语,HPLC,定量分析原理,高效液相色谱基础知识,什么是色谱法,色谱法溯源,Tswett,（,茨维特,),的实验,色谱法原理,色谱法的分类,色谱法原理及分类,色谱法是一种现代的分离分析方法,1906,年正式命名,(,见诸文献,),20,世纪,30,年代开始广泛研究和应用,高效液相色谱法的广泛应用始于,20,世纪,70,年代,什么是色谱法,100,多年前俄国植物学家,Tswett(,茨维特,),分离植物色素时采用的实验方法,他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带,Tswett,用希腊语,chroma(,色,),和,graphos(,谱,),描述他的实验方法，即现在的,Chromatography(,色谱法,),色谱法,(Chromatography),溯源,一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒,将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中,随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带,分离出不同的化合物,C,h,r,o,m,a,t,o,-,颜色,Graphy,-,图象,Tswett,（,茨维特,),的实验,是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离,两相中有一相是固定的,叫作固定相,(Stationary Phase),有一相是流动的,称为流动相,(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂,色谱法原理,相,(Phase):,物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成,分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相,之间有明显可分的界面,色谱分离原理,按流动相的物态分,:,气相色谱,(Gas Chromatography,GC),用气体作为流动相,(,又叫载气,),液相色谱,(Liquid Chromatography,LC),用液体作为流动相,(,又叫洗脱剂,),色谱法的分类,按固定相的形态分,:,平面色谱,o,纸色谱,o,薄层色谱,柱色谱,色谱法的分类,色谱法的分类示意图,高效液相色谱法,HPLC(High Performance Liquid Chromatography),是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段,:,o High,高,o Performance,性能,o Liquid,液体的,o Performance,色谱,什么是,HPLC,？,特点：,高压、高效、高速、高灵敏度,1.,高效分离：,n=10,5,/,米,2.,高速 ：使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟,3.,高灵敏度：检测下限：,10,-9,-10,-13,g,（最小检测量）,4.,自动化程度高：仪器分析、电脑控制、色谱工作站,5.,应用范围广 ：可测有机物,75%-80%,适用：,高沸点、热不稳定有机及生化,试样的高效分离,HPLC,特点,按流动相和固定相的相对极性分,:,正相色谱,(Normal Phase Chromatography),o,固定相的极性大于流动相,反相色谱,(Reversed Phase Chromatography),o,固定相的极性小于流动相,有机化合物的极性,分子间作用力,(,静电引力,偶分子间作用力,(,静电引力,偶极力,色散力,氢键力,),综合表现的一种表述,液相色谱法的分类,有机化合物极性示例,按分离过程的机理分,:,1,吸附色谱,(Absorption Chromatography),根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离,2,分配色谱,(Partition Chromatography),分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度,(,分配系数,),不同,3,离子交换色谱,(Ion Exchange Chromatography),根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱,(IC),4,体积排除色谱,(Size Exclusion Chromatography),GPC(Gel Permeation Chromatography),固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂,GFC(Gel Filtration Chromatography),固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液,液相色谱法的分类,由五大部分组成：,：,溶剂输送系统（贮液器，高压泵）,进样系统（进样阀等）,分离系统（色谱柱等）,检测系统（检测器等）,记录及数据处理系统,HPLC,的组成,1.,高压输液泵,为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（,10m,），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一,应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,高压输液泵：,恒压泵（流量随阻力变化重现性差）,恒流泵（多用）：往复式 注射式,作用：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统。,性能：有足够的压力,输出流量恒定，可调,输出压力平稳,泵室体积小,泵体抗腐蚀、耐酸,梯度洗脱装置,作用：将两种或两种以上溶剂按一定程序连续改变配比，以改变流动相极性、离子强度、,PH,值、提高分离效率。,低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱，,1,个泵。）,高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，,2,个泵。）,安捷伦泵：,小视频,色谱学堂：泵,高效液相色谱仪流动相脱气的目的,1,、使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。,2,、提高保留时间和色谱峰面积的重现性。,3,、防止气泡引起尖峰。,4,、使基线稳定，提高信噪比。,5,、降低溶剂的紫外吸收本底。,6,、减少死体积。,7,、防止填料氧化。,视频：,脱气目的,在线脱气机,在线脱气机,2.,进样装置,进样视频：,安捷伦,进样视频：,岛津,3.,分离系统,包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。,色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为,2 6mm,，柱长为,10 50cm,，柱形多为直形，内部充满,3,10,m,m,高效微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温,匀浆法填充柱：,将填料制成悬浮液，在高压泵的作用下压入装有洗脱,液的色谱柱。理论塔板数可达,8,万,/,米,4.,检测器,要求,:,灵敏度高，噪音低，线形范围宽，响应快,对温度和流速的变化不敏感,检测器类型,1.,紫外可见吸收检测器,(UVD),2.,荧光检测器,(FD),3.,蒸发光检测器（,ELSD,）,3.,示差折光检测器,(RID),4.,电化学检测器,(ED),5.,化学发光检测器,(CD),1.,紫外,可见光度检测器：,固定波长：,254nm,，低压汞灯。,可调波长：,190,800mm,，钨灯，氘灯。,光电二极管矩阵检测器：,190,700nm,。,石英窗,接色谱柱,UV,光电倍增管,废液,光电二极管矩阵检测器特点：,灵敏度高、分辨率好、方便、快速、准确，可扫描得三维流出曲线,紫外检测器的应用：,对紫外有吸收的组分，且吸光度与浓度成正比。,紫外检测器的特点：,灵敏度高 最小检测浓度,10,-9,g/ml,线性范围宽,对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱,应用范围广,折光计由测量池和参比池组成（示差折光计）,因,n,f,（,T,）,，故需精密恒温,（,0.001,）,灵敏度低于,UV,检测器，且不适合于梯度洗脱,用于无紫外吸收的化合物，如糖类,2.,荧光检测器：多波长荧光检测器（滤光片）,荧光分光检测器（光栅分光）,氘灯作激发光源，波长范围,250,600nm,应用：组分吸收一定波长紫外光后发射荧光的物质，且荧光强度与浓度成正比。,特点：灵敏度更高 检测限,10,-12,10,-13,g/ml,（,灵敏度比,UV,检测器高,23,个数量级）,选择性好,对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱,所需试样量少，适于痕量分析,应用范围广,3,、电化学检测器,电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。,伏安计、安培计、库仑计和电导计等,首选安培计,可用于在工作电极的工作电压范围能还原或氧化的物质,电极表面易中毒,温 度：,10,30,；相对湿度：,80,；最好是恒温、恒湿远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施,HPLC,的日常维护与保养,HPLC,的日常操作条件：,1 Alliance,液相色谱系统日常维护：开机程序,2 Alliance,液相色谱系统日常维护：开机程序,HPLC,的日常操作,选择流动相时应注意的几个问题：,（,1,）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（,2,）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定相等。,（,3,）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（,4,）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,手柄位在,Load,位置时，用微量进样针将样品从进样孔注射进入定量环中,(,定量环充满后，多余样品从放空孔排出,),手柄转动至,Inject,位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，将样品进入色谱柱中进行分析,工作原理：,1.,六通阀进样器的使用及保养,手柄转动要快速,：,手柄处于,Load,和,Inject,之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在中途停留,部分装液法,：进样量最多为定量环体积的,75,要求每次进样体积准确、相同,完全装液法,：进样量最少为定量环体积的,3,至,5,倍,将定量环内残留的溶液完全置换样品，达到所要求的精密度及重现性,两种装液方法,:,样品必须过滤,：,用,0.45(0.22),m,的滤膜过滤,防止微粒阻塞进样阀,减少对进样阀的磨损,进样结束冲洗进样器,：,用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，,在进样阀的,Load,和,Inject,位置反复冲洗,再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧,使用流动相尽量要清洁,进液处的砂芯过滤头要经常清洗,流动相交换时要防止沉淀,避免泵内堵塞或有气泡,每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染,2.,泵的保养,在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱,当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净,要注意流动相的脱气,避免使用高粘度的溶剂作为流动相,进样样品要提纯；严格控制进样量,2.,色谱柱的保养,每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品,每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱,若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭,在分析前应先平衡色谱柱，差不多后，再开检测器；,在分析完成后马上关闭检测器,3.,紫外灯的保养,“分析型液相色谱”目的,:,得到数据,-,定性及定量分析,灵敏度的要求,样品的复杂性,样品量的要求,精度及准确度的要求,容易使用,HPLC,的应用,“制备型液相色谱”目的,:,得到纯品,-,分离及纯化,化合物的稳定性,样品的复杂性,制备量的要求,纯度的要求，及纯度的鉴定,方法的安全性,色谱图,(Chromatogram):,色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间,HPLC,色谱图名词术语,色谱峰,(,Peak,):):,色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号,峰底,(,Peak Base,):):,峰的起点与终点之间连接的直线,峰高,(,Peak Height,):):,峰最大值到峰底的距离,峰面积,(Peak Area):):,峰与峰底之间的面积,又称响应值,色谱图名词术语,:,基线,(Baseline):,在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号,基线飘移,(Baseline Drift):,基线随时间定向的缓慢变化,基线噪声,(N)N)(Baseline Noise):,由各种因素所引起的基线波动,谱带扩展,(Band Broadening):,由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象,色谱图名词术语,:,保留时间,(tR)(Retention time):,组分从进样到出现峰最大值所需的时间,死时间,(t0)(Dead time):,不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的时间,保留体积,(VR)(Retention volume):,组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,死体积,(V0)(Dead volume):,不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,色谱图名词术语,:,等度在整个运行过程中溶剂组成保持不变如,(60:40,甲醇,/,水,),HPLC,实验的基本类型,-,等度,梯度在运行过程中溶剂组成变化渐变或台阶式变化如,100%H20/0%MeOH,到,0%H2O/100%MeOH,HPLC,实验的基本类型,-,梯度,这些是导出理论和定义所必需的基本测量,洗脱体积和峰宽,简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远,分离度,(R),的定义式,计算分离度的实例,:,分离程度的量度,k,是样品与填料作用强度的直接量度,保留因子,(k):,保留能力的量度,是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述,分离因子,(,):,峰分离程度的量度,理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度,用于评价色谱柱的性能,(,中国,2015,版药典,),理论塔板数,(N):,分离效率的量度,色谱峰对称性的测量方法,中国药典要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品溶液或系统适应性溶液对色谱系统进行试验和调整,要达到规定的要求,色谱系统的适应性实验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子四个指标,要求,:,理论塔板数,N:,大于规定值,(,按半峰宽法计算,),分离度,R:,应大于,1.5,重复性,:,连续进样,5,次,峰面积的相对标准偏差不大于,2.0%,拖尾因子,T:,应在,0.95-1.05,之间,中国药典对系统适用性的规定,在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物,液相色谱定量是相对定量的方法,:,即由已知量的纯标样推算混合物中被测物的量,液相色谱法定量的依据是,:,被测组分的量与响应值,(,峰高或峰面积,),成正比,液相色谱定量分析原理,用“标样”的保留时间(Rt)确认被测组份,鉴别需定量的色谱峰,(,定性,),定性鉴别每个要定量的色谱峰,首先用标样确定欲定量之色谱峰的保留时间,(Rt),通过比较保留时间,找到未知样中各色谱峰所对应的组份,色谱定性是用与标样比较保留时间的方法,因此要明确：,保留时间相同，可能是同样的组份,保留时间不同，肯定不是同样的组份,鉴别需定量的色谱峰,(,定性,),标准加入法,同时用其它方法,1,其它色谱方法,(,改变机理,如,:,用不同的色谱柱,),2,其它检测器,o,PDA,光谱图比较、谱库检,索,o,MS,，质谱图解析、谱库检,索,3,其它,仪,器方法,进一步的确认,(,定性,),确认定量峰的一致性,PDA,纯度角原理,PDA,纯度角测定结果,标准曲线法,分为,外,标法和,内,标法,:,-,外,标法,:,液相色谱中用得,最,多,-,内,标法,准确，,但,是,麻烦,在标准方法中用得,最,多,常用的定量方法,液相色谱定量分析的步骤,外标法定量,(1),外标法定量,(2),外标法定量,(3),外 标 法 按 各 品 种 项 下 的 规 定，精 密 称（量）取对照品和供试品，配 制 成 溶 液，分 别 精 密 取 一 定 量，进 样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积,(,或峰高），按 下 式 计 算 含 量：,外 标 法中国药典,2015,内标法定量,(1),内标法定量,(2),内标法定量,(3),内标法定量,(4),测 定 杂 质 含 量 时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在 建 立 方 法 时，按各品种项下的规定，精 密 称（量,),取待测 物对照品和参比物质对照品各适量，配制待测物校 正因子的溶 液，进 样，记录色谱图，按下式计算 待测物的校正因子,加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照,也 可 精 密 称（量）取 主 成 分 对 照 品 和 杂 质 对 照 品 各 适量，分 别 配 制 成 不 同 浓 度 的 溶 液，进 样，记 录 色 谱 图，绘制主 成 分浓 度 和 杂质 浓度 对其 峰面 积的 回归 曲线，以主成分回归 直 线斜 率与 杂质 回归 直线 斜率 的比 计算 校正 因 子。,加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照,除 另 有 规 定 外，通 常 含 量 低 于,0.5%,的 杂 质，峰 面 积 的相 对标 准偏 差（,RSD),应 小 于,10%;,含 量 在,0.5%2%,的 杂 质，峰 面 积 的,RSD,应 小 于,5%;,含 量 大 于,2%,的杂质，峰 面 积 的,RSD,应 小 于,2%,。,加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照精密度,测 定 杂质 含量时，若 无 法 获 得 待 测 杂 质 的 校 正 因 子，或 校 正 因 子 可 以 忽略，也 可 采 用 不 加 校 正 因 子 的 主 成 分 自 身 对 照 法。,不加校正因子的主成分自身对照法,按 各 品 种 项 下 的 规 定，配制供试品溶 液，取 一 定 量 进 样，记 录 色 谱 图。测量各峰的面积和色谱图 上 除 溶 剂 峰以 外的 总色 谱峰 面 积，计算各峰面积占总峰面积 的 百 分 率。用 于 杂 质 检 查 时，由 于 仪 器 响 应 的 线 性 限 制，峰 面 积 归 一 化 法 一 般不 宜用 于 微 量杂 质 的 检 査。,面 积 归 一 化,液相色谱定量的精密度,精密度的衡量,准确度的衡量,影响准确度的因素,校正曲线的检测范围,