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trizol法提取RNA

植物总 RNA 的提取
抽提RNA 所用的研钵酒精灼烧5-10min。，其他器皿均用0.1%的DEPC 水处理,24hr。
后高温高压灭菌两次，以去除RNA 酶,所有试剂都保证没有RNA 酶污染。
1） 1.5ml 离心管中加入1ml Trizol,取0。1g 组织在液氮中研磨至粉末，加入到Trizol
中，立即充分混匀。
2） 将混匀的组织在 15—30℃放10min，使核酸蛋白复合体物完全分离.
3） 4℃,10000rpm 离心20min，取上清。
4） 加氯仿 200μl，5M NaCl 200μl，剧烈振荡15s，室温放置3min(或不放置，直接
离心）.
5) 4℃，10000rpm 离心20min,样品会分成3 层，取上层水相,取上清。
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6) 加 500μl 异丙醇，混匀,室温放置10min。
7） 4℃，10000rpm 离心15min，去上清，管底管侧形成胶状沉淀。
8） 加 1ml 75％乙醇,洗涤沉淀,重复两次，洗涤用4℃,7500rpm 离心5min，弃上
清。
9） 吹干约 15min。
10) 加 50μl DEPC 处理的水，65℃溶解,-20℃(最好—80℃)保存.

DNase I 处理消化植物总RNA 中的基因组DNA
1) 取5μl 的植物总RNA，然后顺序加入1μl 10×缓冲液,1μl DNase，3μl RNase—free
水，总体积10μl，充分混匀后,37℃温育30 min.
2) 加入1μl 终止缓冲液，65℃温育10min，使DNase 失活.

反转录 cDNA
1） 在上述总体积为11μl 反应液中加入1μl Oligo（dT)18 引物4μl 5×缓冲液，2 μl dNTP,
1μl 反转录酶,1μl RNase 抑制剂,总体积20μl,充分混匀后，42℃温育1—1。5hr。
2) 70℃温育10min,终止反应

trizol法提取RNA
步骤2010年03月09日 星期二 17：07从组织中提取总RNA
1）液氮研磨，组织块直接放入研体中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，
再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转移入离心管进行第2步操作。
2） 匀浆：组织样品按50—100mg/mlTrizol 加入Trizol,另外，组织体积不能超过Trizol体积
的10％,否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟.

从细胞中提取总RNA
1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。
2） 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
2．细胞或组织加Trizol后，室温放置5min,使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持.
3．12000rpm 离心5min，弃沉淀。
4．按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀15分钟，室温放置15min。注:禁用漩涡振荡器，
以免基因组DNA断裂。
5．4℃12000g离心15min。
6．吸取上层水相，至另一离心管中.
注：1）千万不要吸取中间界面。
2）若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。
7．按0。5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5—10min。
8．4℃ 12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
9．按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
10．4℃ 8000g离心5min，尽量弃上清。
11．室温晾干或真空干燥5-10min. 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
12．可用50ul H2O,TE buffer或0。5％SDS溶解RNA样品，55-60℃5-10min。
注：H2O、TE或0。5％SDS均须用DEPC处理并高压。
12、测O.D值定量DNA浓度.
注：1）此方法提取RNA A260/A280值在1。6—1.8之间。
2) 产率估计：组织标本:（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。
注：1、组织或细胞量过少,可酌情减少Trizol用量。
2、组织或细胞用量过多,会引起DNA对RNA的污染。
3、高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨
后须4℃ 1200离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物,则
也须去掉。
4、热天提RNA,带手套是必须的，手是RNase的主要来源。
5、组织块用液氮研磨,效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，
此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪将组织绞碎，然后再充分研磨。

植物总RNA提取—Trizol法
　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交, Poly（A）+分离,体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
　　1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50—100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10％.
　　2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
　　3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
　　4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇,涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
　　5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度.然后将RNA溶于水中，必要时可55℃—60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
　　[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作.
　　2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70％乙醇中可在4℃保存一周，—20℃保存一年.

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1。 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞,每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2。 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温15～30C下放置5分钟；
3。 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15℃～30℃）放置2~3分钟后，12000g(2℃～8℃）离心15分钟；
4. 取上层水相置于新EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃~30℃)放置10分钟，12000g（2℃～8℃）离心10分钟;
5。 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清;
6。 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
7。 用Rnase—free water 溶解RNA沉淀.
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RNA purification using TRizol——TRIZOL法提取RNA

TRIzol Reagent (Life Technologies cat＃ 15596-026) or TRI reagent (Sigma cat ＃ T-9424)

DEPC (RNase free） water or 0.5% SDS solution in DEPC treated water

Chloroform (Fisher ）

Isopropyl alcohol （2-Propanol） （Fisher）

75% Ethanol (in DEPC treated water)

Sterile or RNase treated pipette tips, microcentrifuge tubes， and pestles or motorized homogenizer.

Microcentrifuge

1.Homogenization for Cell Suspensions

a。Place 1 ml aliquots of the cell suspension in sterile RNase free 1。5 ml microcentrifuge tubes。

b。Centrifuge for 1 minute to pellet the cells.

c.Pour off the supernatant。

d。Add 1 ml of TRIzol or TRI reagent to the tubes.

e.Lyse cells by repetitive pipetting.

f。Centrifuge homogenate at 12000 x g for 10 minutes at 4℃.

g。Transfer the homogenate in a sterile microcentrifuge tube.

h.If this RNA will be used for RT-PCR, repeat steps f and g twice。

Modification for tissues

a。Add 1 ml of TRIzol or TRI reagent to every 50-100 mg of tissue. Sample volume should not exceed 100 μl. If you using 1。5 —2 ml microcentrifuge tube and pestle for homogenization, start with 500 μl of TRIzol or TRI reagent, then add remaining 500 μl.

b.Homogenize the samples using a sterile or RNAse free plastic, glass pestles or power homogenizer and tubes。

Modification for monolayers

a。Lyse cells directly in a culture dish by adding 1 ml of TRIzol or TRI reagent to a 3。5 cm diameter dish。

b.Pass the cells through a pipette several times。

2。 Phase Separation

a。Incubate samples （from 1g) for 5 minutes at room temperature。

b。Add 0。2 ml of chloroform to each tube.

b。Cap each tube. Shake samples vigorously by hand for 15 seconds.

c。Incubate samples for 5 minutes at room temperature。

d。Centrifuge samples for 15 minutes at 12,000 x g at 4oC。

3. RNA Precipitation

a。Transfer the upper aqueous phase to a fresh tube.

b。Add 0。5 ml of isopropyl alcohol to precipitate RNA。 If this RNA will be used for RT—PCR， first add 50 μl isopropyl alcohol， mix， incubate the samples at room temperature for 5 minutes and centrifuge at 12,000 x g for 10 minutes at 4oC. Transfer the sample in a new tube。

c。Incubate for 5—10 minutes at room temperature。

d。Centrifuge for 10 minutes at 12,000 x g at 4oC。 The RNA will form a pellet on the side or bottom of the tube.

4。 RNA Wash

a。Discard the supernatant。

b。Wash pellet with 1 ml 75% ethanol。

c.Mix sample by vortexing。 The RNA pellet may float。

d.Centrifuge at 12000 x g for 5 minutes at 4oC。 If this RNA will be used for RT-PCR repeat steps a，b and c twice。

e。RNA pellet may be stored in ethanol at -70oC for months。

5. Redissolving the RNA

a。Remove supernatant.

b.Air dry the pellet for 5-10 minutes. Do not completely dry out the pellet.

c。Dissolve pellet in 30 to 60 μl RNase free water or 0.5% SDS by passing the solution through a pipette tip and incubating for 10 minutes at 55—60oC.

6. Determination of RNA Concentration and Purity

a.Take 2 to 5 μl RNA sample from the original stock， diluted with 998 or 995 μl RNase free water in a 1。5 ml microcentrifuge tube。 This will give you 500 or 200 time dilution of the RNA sample.

b。Pipet 1 ml RNAse free water in a clean cuvette and read absorbance as blank.

c.Pipet the diluted RNA sample in to a clean cuvette and read absorbance at 260 nm and 280 nm.

d。 Use the formula below to determine RNA Concentration of the original sample：

［RNA μg/μl]= A260 x 33 x dilution factor / 1000

e. To determine the purity of the RNA sample， calculate ratio of A260/A280. Ratios between 1。7 to 2 represent good RNA。

Preparation of RNase-free water

a。Measure water into RNase—free glass bottles。

b.Add 0.01% （v/v） diethylpyrocarbonate (DEPC）。

c。Let stand overnight。

d.Autoclave。

Note： RNase free DEPC treated water is Biotecx brand （cat ＃ BL—5611）。

Note： If using 0.5％ SDS solution to resuspend the RNA。 It must be prepared in RNase free water