麋鹿角柄发育规律与相关内分泌及信号通路检测.pdf

Chinese Journal of Wildlife 2023，44（3）：565-571Chinese Journal of Wildlifehttp：/麋鹿角柄发育规律与相关内分泌及信号通路检测夏志强1，2，单云芳1，李俊芳1，张庆勋1，贺永惠2，崔艳红2，钟震宇1，柏超3，张成林3，白加德1，孟庆辉1*（1.北京市科学技术研究院北京麋鹿生态实验中心，北京，100076；2.河南科技学院动物科技学院，新乡，453003；3.圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京动物园管理处，北京，100044）摘 要鹿类角柄终生有2次发育，第1次在胚胎期，第2次在青春期，出生后角柄的激活和首次发育对于鹿角再生极为重要，角柄的青春期发育对于鹿类个性及等级序位形成、鹿角大小、争夺配偶、种间竞争和应对天敌等有重要意义。利用红外测距仪，开展麋鹿（Elaphurus davidianus）角柄生长发育的宏观测量，结合青春期骨膜组织取样、血液激素水平和信号通路表达情况检测，对麋鹿角柄发育情况进行研究。结果表明：与成年不同，幼龄雄性麋鹿在第1年秋季开始出生后的首次角柄发育，由毛旋处长出骨质突起，翌年23月角柄长至2.53.0 cm，逐渐形成初角基，56月首次生茸，冬至脱落，此时形成完整的角柄；随青春期发育和年龄增长，角柄逐渐变粗变短；角柄围长由2岁时的（17.171.00）cm增加到3岁时的（35.430.83）cm，差异极显著（F1，9=4.128 1，n=9，p=0.005 3）；角柄直径由2岁时的（3.660.59）cm增加到3岁时的（5.910.72）cm，差异极显著（F1，9=3.174 0，n=9，p=0.024 6）。血液激素检测表明睾酮分泌水平与角柄发育密切相关，睾酮分泌水平由1岁时的（564.2741.16）pg/mL增加到3岁时的（737.9666.57）pg/mL，差异极显著（F1，9=4.303 0，n=9，p=0.002 2）；分子检测结果也显示TGF-/Smads信号通路参与了角柄发育过程。研究揭示了麋鹿角柄发育规律，探讨与之相关的内分泌因素及分子表达情况，为今后持续开展麋鹿角柄发育及茸再生机制多样化奠定了基础。稿件运行过程收稿日期：2023-03-03修回日期：2023-03-20关键词：角柄发育；麋鹿；内分泌；信号通路；TGF-；SmadsKey words：Antler pedicle development；Pre David s deer（Ela-phurus davidianus）；Endocrine；Signaling pathways；TGF-；Smads中图分类号：Q344文献标识码：A文章编号：2310-1490（2023）-03-0565-07DOI：10.12375/ysdwxb.20230311基金项目：北京市自然科学基金面上项目（5212003）；北京动物园圈养野生动物技术北京市重点实验室开放课题（ZDK202101）第一作者简介：夏志强，男，25岁，硕士研究生；主要从事麋鹿保护研究。E-mail：*通信作者：孟庆辉，E-mail：野 生 动 物 学 报第44卷Development of Antler Pedicle in Male Pre David s Deer and Related Endocrine and Signaling Pathways DetectionXIA Zhiqiang1，2，SHAN Yunfang1，LI Junfang1，ZHANG Qingxun1，HE Yonghui2，CUI Yanhong2，ZHONG Zhenyu1，BAI Chao3，ZHANG Chenglin3，BAI Jiade1，MENG Qinghui1*（1.Beijing Milu Ecological Research Center，Beijing Academy of Science and Technology，Beijing，100076，China；2.College of Animal Science and Technology，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang，453003，China；3.Beijing Key Laboratory of Captive Wild Animal Technologies，Beijing Zoo，Beijing，100044，China）Abstract：The antler pedicle of deer develops twice in their lifetime，once in the embryonic stage and the second time in the adolescent stage.The activation and development of the antler pedicle after birth are very important for the regeneration of velvet，and the adolescent development of the antler pedicle is of great significance for the formation of personality and rank order，antler size，competition for mates，interspecific competition and coping with natural enemies.In this paper，infrared rangefinder was used to conduct macroscopic measurement of the growth and development of the antler pedicle of Pre David s deer（Elaphurus davidianus），combined with periosteal tissue sampling during the adolescent stage，blood hormone levels，and signal pathway expression detection，to study the development of Pre David s deer antler pedicle.The results showed that，the young male Pre David s deer began to develop the first antler pedicle in the autumn of the first year，with a bone process growing from the hair whorl.The antler pedicle grew to 2.5-3.0 cm in February to March of the next year，and gradually formed the primary antler base.With the increase of adolescence and age，the antler pedicle gradually becomes thicker and shorter.The antler pedicle circumference increased from（17.171.00）cm at 2 years of age to（35.430.83）cm at 3 years of age，and the difference was extremely significant（F1，9=4.1281，n=9，p=0.0053）.The antler pedicle diameter increased from（3.660.59）cm at 2 years of age to（5.910.72）cm at 3 years of age，and the difference was extremely significant（F1，9=3.1740，n=9，p=0.0246）.The level of testosterone increased from（564.2741.16）pg/mL at one year old to（737.9666.57）pg/mL at 3 years old，and the difference was extremely significant（F1，9=4.3030，n=9，p=0.0022）.Molecular analysis also showed that TGF-/Smads signaling pathway was involved in the development of the antler pedicle.This study revealed the developmental rules of Pre David s deer antler pedicle for the first time，and explored the related endocrine factors and molecular expression，which laid a foundation for continued development of Pre David s deer antler pedicle development and diversification of antler regeneration mechanisms in the future.有角动物存在于有蹄类反刍动物分支中，现存约80个属，近300个种，超过30亿的个体1，其角可以分为骨质角和角质角2个类群，鹿类是现存具骨质角的哺乳动物类群2。牛羊的角因内含骨质核3，终生不脱落，随年龄增长逐渐变粗大，幼龄阶段如因营养紧缺生长受限，待成年营养解除限制后，也无法代偿性恢复生长4；而鹿角则不同，会周期性全部脱落，留下骨柄5，并在12个月内实现完全再生，后期逐渐骨化和脱落茸皮，把骨质角裸露在外，作为性选择重要特征，参与繁殖争霸6。出生后雄鹿角柄的激活对于鹿角的生长极为重要7，鹿类角柄的青春期发育对于鹿的个性与等级序位形成8、鹿角大小9、争夺配偶10、种间竞争11及应对天敌12等有重要的意义。麋鹿（Elaphurus davidianus）属季节性繁殖动物，作为其强大攻击和保护性武器的角，分枝向后与生境形成了完美匹配，成功占据了湿地生态位，导致其从演替出现直至灭绝都尚未走出湿地的死胡同窘境，成就了“成也麋鹿，败也麋鹿”局面13。经过近38年的保护努力，中国境内共有10 000余头麋鹿，重566夏志强等：麋鹿角柄发育规律与相关内分泌及信号通路检测第3期新恢复了野生种群，但是遗传多样性指数仍然较低，除大丰和石首2种群超过1 000头外，其他分布地麋鹿均在 200 头以下且随时可能面临再次灭绝的风险，因此需要加强麋鹿保护界的居安思危和对麋鹿保护重启新的重视14。本研究利用红外测距仪，开展麋鹿角柄生长发育规律的宏观测量；对不同年龄组1岁、2岁和3岁的角柄骨膜组织取样，对信号通路表达和血液样品激素水平进行检测。角不仅可作为动物本身重要的性选择标志，对于人类医学也具有重要研究价值，针对麋鹿角柄骨膜发育的初步研究，以期为幼龄鹿类的饲养管理、鹿品种培育、茸再生、再生医学和中药材应用奠定基础。1材料与方法1.1实验动物1985年从英国乌邦寺重引进的麋鹿，半散放于北京南海子，平均海拔9.6 m，年均气温13.1，年均降水量约600 mm，常年湿度30%70%，年均日照时间5 0006 200 h，无霜期（132.09.7）d15。麋鹿种群自由采食、饮水和繁衍，雄性麋鹿冬季解角。因受生态承载力限制，北京麋鹿种群常年维持在160220头，每年出生幼子50头左右，其中雄性1530头。试验选取健康无病、体况优良、同父异母和出生日期（2018年4月525日）接近的雄性麋鹿，依出生时间佩戴耳标以阿拉伯数字编号。试验麋鹿饲养方案：每日09：00、15：30各投喂1次，自由饮水，符合北京麋鹿苑麋鹿四季饲养管理方案，粗料为主，精料为辅15。试验分2组，分别是角柄发育前、角柄发育后两阶段，其中角柄发育后阶段又分为首次生茸前（12月122日）和生茸期（12月 23日翌年 3月 15日）。血样采集于2020年1月2022年12月，每月第1周周一上午，其中2020年29份，2021年27份，2022年 20份，共76份。1.2研究方法1.2.1角柄发育与骨膜取样每日饲喂的同时观察和测量幼龄麋鹿角柄发育及生茸状况。对不同发育阶段的角柄拍照，记录角柄发育过程和生茸过程中顶端伤口愈合、分枝时间。角脱落后记录编号，切取鹿角基部第1片横切片（厚1 mm），称其质量15。2020、2021和2022年分别于生茸前和生茸期进行角柄皮下骨膜组织采样，软尺测量茸长度，记录左、右侧茸发育情况。组织取样后立刻送回实验室，分别浸泡在甲醛液中固定，-80 冷冻保存。1.2.2血液激素水平检测采用上海酶联生物科技有限公司的酶联免疫试剂盒测定血清中的激素含量，提前将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡12 h。（1）加样：标准孔加不同浓度的标准品 50 L；待测样品孔中先加稀释液40 L，再向孔底部加入血清样品10 L，轻晃均匀。（2）加酶：除空白孔外，每孔加入100 L。（3）温育：封板，干燥箱中37 温育60 min。（4）配液：洗涤液稀释后备用。（5）洗涤：每孔加满洗涤液，静置 30 s后弃去，重复5次。（6）显色：加入显色液A 50 L，显色液B 50 L，混匀后置于37 避光显色15 min。（7）终止：加终止液50 L终止反应。（8）测定：450 nm波长测量各孔的吸光度（OD值）。绘制标准曲线，计算实际浓度。1.2.3信号通路检测称取样品组织，利用Trizol法提取组织RNA，并通过紫外分光光度计检测 RNA 样品浓度及纯度。根据反转录试剂盒对RNA进行反转录，反转录结束后将样品稀释分装保存。参照NCBI网站提供的马鹿基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计所需引物，所有引物均由北京擎科创新生物科技有限公司合成，具体引物序列见表1。1.2.4数据处理试验结果均符合正态分布，齐次性检验中，若方差齐时选择LSD法检验各个水平间存在的差异；若方差不齐时选择 Tamhane s T2 检验总体方差不等的两组之间的差异，通过使用ANOVA分析及LSD多重比较来分析不同激素的年度变化及判断不 同激素与角柄及茸再生的相关性差异。显著性水平0.05。2结果2.1角柄发育初生仔鹿额部未表现隆凸，仅有左右对称的逆序毛旋，旋毛稍长、色深；雄性麋鹿在第1年秋季开始出生后的角柄发育，由毛旋处长出骨质突起，逐渐形成初角基，是茸角生长的基础；翌年23月角柄567野 生 动 物 学 报第44卷长度2.53.0 cm，初角茸不分枝，与成年麋鹿不同，56月陆续开始首次生茸，冬至脱落，形成完整的角柄。经初角茸后，角柄继续发育，直至体成熟，角柄骨膜不断地持续增殖，在此期间，鹿角每年发生周期性脱落，翌年茸再生变大分枝增多；角柄逐渐变粗变短，至完全成熟（图1）。亚成体麋鹿角脱落与再生期角柄的发育，也主要经历生茸初期、快速生长期及生茸后期等阶段。（1）生茸初期，脱角形成的碗状伤口 12 d结痂，伤口周围“皮肤环”增殖变厚，是茸生长的基础8。生茸 89 d表面开始长出稀疏浅白色茸毛，中心伤口结痂也不断向内收缩变小，鹿茸主枝形成，生长速度逐渐加快。此阶段，角柄逐渐恢复营养供给，变粗大，骨芯代偿加快，皮肤和血管也开始活跃，代谢加速，为下一阶段茸快速生长做足准备。（2）快速生长期，茸主枝增长到一定长度后顶端出现2个生长中心（生茸 2325 d），待眉枝完全出现（生茸 30 d 左右），结痂脱落，伤口处完全愈合且不留疤痕，是皮肤再生能力的体现9。此时，角柄代谢达到 最旺盛状态，局部血液循坏加快，角柄秋季萎缩 造成的阻塞管道全部打通，营养供给达年度最高峰，角柄和茸生长最快。（3）生茸后期，鹿茸成型并逐渐停止增长（生茸 70 d），鹿茸开始骨化变硬，茸皮逐渐脱落，最终形成坚硬鹿角。角柄也逐渐开始萎缩，血管封闭，钙磷代谢减慢，并有少部分矿物质回流（表2）。随年龄增长角柄不断地变粗成熟，雄鹿由于每年生茸前，角柄内部钙质被吸收，脱落时带走了部分死亡的细胞和骨质，老年后角柄逐渐缩短，角基盘和生长面不断扩大和下移；解角后，创面逐年变大，封口时间逐年延长。2.2角柄发育参数青春期角柄第2次发育后，随年龄增长，逐渐变粗；老年后随脱落次数增多，角柄逐渐变短。角柄围长由 2 岁时的（17.171.00）cm 增加到 3 岁时的（35.430.83）cm，差异极显著（F1，9=4.128 1，n=9，p=0.005 3）；角柄直径由2岁时的（3.660.59）cm增加到3岁时的（5.910.72）cm，差异极显著（F1，9=3.174 0，图1幼龄阶段雄性麋鹿角柄发育Fig.1 Antler pedicle development in young male Pre David s deer表1RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-PCR基因GeneTGF-1TGF-1RSmad2Smad3序列信息（53）Sequence information（53）F：GGACCTGGGCTGGAAGTGGATTR：GGAGCGCACGATCATGTTGGAF：GCTGTGAAGCCTTGCGAGTAR：GATGCCTTCCTGCTGACTGAF：AGCCAGTTACTTACTCAGAGCCTR：ATGTCTTCTTGTCATTTCTACCGF：GCAGGAGGAGAAGTGGTGCGAGAAR：AGGCGGCAGTAGATGACGTGGG产物大小/bpSize of product247125203198基因库登录号GenBank entry numberXM_043899247.1XM_043891244.1XM_043889684.1XM_043919841.1568夏志强等：麋鹿角柄发育规律与相关内分泌及信号通路检测第3期n=9，p=0.024 6）；角 横 切 面 外 径 长 由 2 岁 时 的（10.301.25）mm增加到3岁时的（32.503.11）mm，差异极显著（F1，9=5.266 1，n=9，p=0.000 9）；角横切面外径宽由 2 岁时的（7.600.83）mm 增加到 3 岁 时的（27.501.84）mm，差异极显著（F1，9=4.820 3，n=9，p=0.001 5）（表3）。2.3血液激素水平幼龄雄性麋鹿睾酮的分泌水平与角柄发育密切相关，生长素、IGF-1与角柄发育也存在关联。睾酮分泌水平由1岁时的（564.2741.16）pg/mL增加到3 岁时的（737.9666.57）pg/mL，差异极显著（F1，9=4.303 0，n=9，p=0.002 2）；生长素分泌水平由 1 岁 时的（3.100.32）ng/mL 增 加 到 3 岁 时 的（6.60 0.57）ng/mL，差异显著（F1，9=2.511 5，n=9，p=0.035 9）；IGF-1 分泌水平由 1 岁时的（122.5512.21）ng/mL增加到 3 岁时的（169.1333.18）ng/mL，差异显著（F1，9=2.773 0，n=9，p=0.020 1）（表4）。2.4信号通路表达水平信号通路TGF-/Smads与幼龄麋鹿角柄骨膜发育有关。TGF-1 mRNA 相对表达水平由角柄萌发前的（1.070.04）增加到 3 岁时的（4.471.14），差异极显著（F1，9=3.711 7，n=9，p=0.006 6）；TGF-1R mRNA相对表达水平由角柄萌发前的（0.960.07）增加到 3 岁时的（2.010.34），差异极显著（F1，9=3.332 9，n=9，p=0.009 9）（表5）。表2鹿茸生长阶段及角柄特征变化Tab.2 Characteristics of Pre David s deer antler and pedicle in different growth stages阶段Stages脱角Shedding结痂Scab封口Heal茄包 Bun拔桩Rising分化Split分枝Branch定型Shapen脱茸皮Casting骨化Ossify外观特征Observation of characteristics茸胚成熟，旧角脱落，角桩处有伤口，并有血液流出茸胚继续发育，角桩伤口出现凹陷和结痂，血管封闭和愈合茸芽组织继续增殖，累积势能，“皮肤环”增厚，包裹着中心愈合痂茸组织继续生长，呈粉红色，结痂收缩变小并不再凹陷，稀疏茸毛长出茸身白色，茸毛明显可见，颜色变深，“封口环”逐渐脱落，开始纵轴生长茸主枝顶端出现2个生长中心，茸侧枝和主干逐渐分离茸侧枝与主干增殖加快，麋鹿茸特有特征初步长出茸快速生长阶段，主枝生长到特定长度，茸增殖速度进入平台期，茸开始成型茸逐步钙化，血管封闭，神经死亡，麋鹿寻找铁丝网、树干等蹭掉茸皮角形成，裸露在外，可参与打斗，脱落后角柄逐渐缩短，珍珠盘和生长面不断扩大和下移再生时间/dRegeneration days01229约10约152325约306070约80约90表3不同年龄段麋鹿角柄生长数据Tab.3 Growth data of Pre David s deer antler pedicle at different ages项目 Items角柄围长/cm Antler pedicle circumference角柄直径/cm Antler pedicle diameter角主干围长/cm Trunk circumference of antler主分枝长/cm Antler main bifurcation long角横切单片质量/g Single crosscut weight角横切面外径长/mm Outside diameter length角横切面外径宽/mm Outside diameter width角横切面内径长/mm Inner diameter length角横切面内径宽/mm Inner diameter width1岁 One-year-old2岁 Two-year-old17.171.003.660.5913.831.866.571.030.190.0610.301.257.600.832.700.311.900.163岁 Three-year-old35.430.835.910.7232.400.4614.971.561.380.2432.503.1127.501.8419.702.2413.901.19569野 生 动 物 学 报第44卷3讨论不同鹿科（Cervidae）动物因分布纬度不同，占据生态位不同，丘陵狍（Capreolus pygargus）、林缘梅花鹿（Cervus nippon）、高山森林马鹿（C.elaphus）和平原湿地麋鹿的鹿角脱落周期节律与繁殖期节律各异16。平原湿地麋鹿因生态位决定13需要在5月底开始圈群、打斗、争夺配偶和繁殖17，所以须在严寒冬季，微调内分泌水平和相关因子表达水平，提前开始旧角脱落和新茸再生，使其在发情期到来之前形成坚实的硬角，参与竞争繁殖。而幼龄麋鹿与成年麋鹿不同15，出生后第2年56月开始首次生茸（出生后第2年23月角柄生长长度为2.53.0 cm，为初角基），冬至脱落，此时形成完整的角柄18。青春期麋鹿经初角茸后，角柄则继续发育，直至体成熟19，角柄骨膜不断地持续增殖，在此期间，鹿角每年发生周期性脱落，翌年茸再生变大在原来基础上分枝逐渐增多8，20，推测角柄骨膜细胞具有记忆功能。本研究表明，青春期雄性麋鹿睾酮分泌水平与角柄发育密切相关（F1，9=4.303 0，n=9，p=0.002 2），生长素、IGF-1与角柄发育存在关联，信号通路TGF-/Smads也参与了角柄骨膜的发育。TGF-1可能收到来自雄激素刺激的下游信号激活鹿茸角柄骨膜组织细胞膜上的受体，随后由Smad2、Smad3将信号传递到角柄骨膜组织细胞核内并与Smad4结合形成复合物，识别靶基因并调控转录因子的表达，最终完成信号的传递和角柄的增殖。结果显示，在角柄骨膜快速增殖的细胞分裂阶段，TGF-/Smads通路十分活跃，说明TGF-1还能通过参与调节鹿茸骨膜细胞的细胞分裂周期，增加S期细胞比例，并可能促进细胞周期的转换，参与骨膜细胞增殖。角柄是鹿茸周期性再生的基础21。幼龄鹿类角柄发育及调控研究目前仍进展缓慢，本研究对麋鹿角柄发育及机制开展了初步研究，探讨了幼龄阶段雄性麋鹿激素发育水平的变化规律与相关分子表达情况，为持续开展麋鹿角柄发育、旧角脱落与新茸冬至再生多样化机制奠定了基础，对提高幼龄鹿类的管理与福利水平等有重要实际应用意义。致谢：本研究是在北京麋鹿生态实验中心多位员工的参与下共同完成的，在此对所有参与人员表示感谢。参考文献：1 LIN Z S，CHEN L，CHEN X Q，et al.Biological adaptations in the Arctic cervid，the reindeer（Rangifer tarandus）J.Science，2019，364（6446）：eaav6312.2 HASSANIN A，DELSUC F，ROPIQUET A，et al.Pattern and timing of diversification of Cetartiodactyla（Mammalia，Laurasiatheria），as revealed by a comprehensive analysis of mitochon表4不同年龄段幼龄雄性麋鹿血液激素水平Tab.4 Blood hormone levels of young male Pre David s deer at different ages年龄段Different ages角柄萌发前 Antler pedicle germination1岁 One-year-old2岁Two-year-old3岁Three-year-old睾酮/（pgmL-1）T52.332.19564.2741.16651.7328.77737.9666.57生长素/（ngmL-1）GH1.180.163.100.323.400.226.600.57IGF-1/（ngmL-1）60.181.24122.5512.21146.4824.52169.1333.18表5幼龄麋鹿角柄组织mRNA相对表达情况Tab.5 mRNA relative expression in antler pedicle tissues of young male Pre David s deermRNATGF-1TGF-1RSmad2Smad3角柄萌发前Antler pedicle germination1.070.040.960.071.020.081.060.011岁One-year-old2岁Two-year-old3.300.661.530.221.120.040.560.073岁Three-year-old4.471.142.010.341.260.230.620.12570夏志强等：麋鹿角柄发育规律与相关内分泌及信号通路检测第3期drial genomesJ.Comptes Rendus Biologies，2012，335（1）：32-50.3 WANG Y，ZHANG C 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