金黄色葡萄球菌检测讲义.ppt

金黄色葡萄球菌检测,内 容,概述,流行病学,实验室检验,生物学特性,检验程序及检验方法,质量控制,概 述,金黄色葡萄球菌是国内外最常见的细菌性食物中毒病原菌之一。在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的,33%,；加拿大则占,45%,；我国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒事件的,25%,。金黄色葡萄球菌肠毒素已成为世界性卫生问题,流行病学,-,分布,在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中均可找到,作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，,50%,以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多,流行病学,-,临床症状,化脓性炎症,局部化脓性炎症,全身感染（如败血症、脓毒血症等）,毒素性疾病,食物中毒,(,多表现为急性胃肠炎,),烫伤样皮肤综合症,中毒性休克综合症,假膜炎肠炎,流行病学,-,食物中毒,金葡菌引起的食物中毒：是金葡菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之,当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经,8-10,小时即可相当数量的肠毒素,流行病学,-,食物中毒,中毒的季节分布：多见于春夏季,潜伏期：,2-4,小时,中毒相关食品种类：奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。,流行病学,-,食物中毒,传染源：是被金葡菌感染的人和动物化脓性,感染部位,传播途径：经食物传播,流行病学,-,肠毒素形成条件,存放温度，在,37,C,内，温度越高，产毒时间越短,存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素,食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成,污染的控制防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成,在低温和通风良好的条件下贮藏食物，并且食用前要彻底加热,防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品及食物的污染,肉制品加工厂所用的原材料经高温或其他适当方式处理后才能进行加工生产,定期对食品生产加工人员和餐饮服务人员进行健康检查,实验室检验,生物学特性,-,菌体形态及培养特征,革兰氏阳性球菌，直径为,0.8-1.0,微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的葡萄串状,无芽孢，无鞭毛，无荚膜,需氧或兼性厌氧菌,可在,10%-15%,氯化钠和,40%,胆汁中生长,血平板上菌落周围形成透明的溶血环,生物学特性,-,菌体形态及培养特征,大多数菌株能生长在,6.5-46,之间；最适温度,37,。能在,pH4.2-9.3,之间生长最适为,pH7.4,大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色。该色素为脂溶性，局限于菌落内,生物学特性,-,生化反应,接触酶阳性,产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌株可水解天然的动物蛋白，例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸；,所有的毒株产生凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆,金葡菌的毒素和酶,a.,溶血素：外毒素，分,、,、,、,四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死,b.,杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞,c.,血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关,d.,脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌,e.,肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为,A,、,B,、,C,、,D,、,E,五种。一般认为产肠毒素的菌株通常是凝固酶阳性株,生物学特性,-,耐受力,几乎所有的消毒试剂以及热加工过程对金黄色葡萄球菌都有严重的破坏作用,肠毒素耐热，可耐受,100 30,分钟不被破坏,检测步骤,-,增菌,利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受,15%,的氯化钠），用含,10%,氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌,检测步骤,-,分离,血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环,血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈,检测步骤,-,分离,BP,平板,胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素,丙酮酸钠是一种生长促进剂,亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色,卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环,甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用,检测步骤,-,分离,在,BP,平板上其典型菌落为：圆形，光滑突起，湿润，直径,2-3mm,，颜色呈灰色到黑玉色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感,偶然会遇到不分解脂肪菌株，除无混浊带及透明圈外，其他外观基本相同,长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥,B-P,平板,检测步骤,-,鉴定,金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶，因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶,对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他实验来进一步确认，例如：厌氧葡萄糖、甘露醇发酵；溶葡萄球菌酶敏感性实验；耐热核酸酶实验等,所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据（产毒的依据是检测出肠毒素）,凝固酶试验,-,原理,凝固酶试验是鉴定葡萄球菌致病性的重要试验。致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是与细胞壁结合的凝聚因子，称结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使发生沉淀，包围于细菌外面而凝聚成块，玻片法阳性结果是由此凝聚因子所致；另一种凝固酶是分泌至菌体外，称为游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法可同时测定结合型和游离型凝固酶,凝固酶试验,-,试管法,方法,于试管内加,1,：,4,稀释的兔或人血浆,0.5ml,，加入,0.5ml,金黄色葡萄球菌营养肉汤,24,小时培养物（或,1-2,个待试菌菌落）充分混匀，置,37,水浴，每,30min,观察,1,次结果，连续观察,6,小时,结果,出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。,应用,仅用于致病性葡萄球的鉴定,金黄色葡萄球菌为阳性，,中间葡萄球菌和猪葡萄球菌有延迟弱阳性,36,1 24hr,报告结果,定性,检测,36,1 24hr,36,1 24hr,36,1 6hr,BP,平板,25g,样品,+225ml,生理盐水,5mL,样品匀液（,1:10,）,+50mL,胰酪胨大豆肉汤,血平板,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶,实验,25g,样品,+225ml,生理盐水,5mL,样品匀液（,1:10,）,+50mL,胰酪胨大豆肉汤,血平板,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶,实验,36,1 48hr,报告结果,MPN/g(mL),定量,检测,（,MPN,法）,25g,样品,+225ml,生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度各取,3mL,加入,3,管胰酪胨大豆肉汤,将有生长的管划线接种,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶,实验,36,1 48hr,36,1 24hr,36,1 6hr,适用于检测可能含有少量金黄色葡萄球菌，却带有大量竞争菌的样品,梯度稀释,25g,样品,+225ml,生理盐水,36,1 48hr,报告结果,金葡菌数,/g(mL),定量,检测,（平板法）,每种类型至少选取一个菌落,36,1 24hr,36,1 6hr,适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于,10/g,（,mL,）的食品,梯度稀释,选三个连续梯度，每个梯度分别取,1mL,接种之至表面干燥的,BP,平板（如,0.4mL,，,0.3mL,，,0.3mL,）,平板计数（分别记录每种类型的菌落数）,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶实验,3M,Petrifilm,金黄色葡萄球菌快速检验法的检验程序,3M,金黄色葡萄球菌快速测试片法,原理,:,该测试片由两部分组成,第一部分是金黄色葡萄球菌培养基片,此检测片含有改良的,Baird-Parker,营养物及一冷水可溶的胶体,第二部分是热稳定核酸酶,(Tnase),反应片,包含有,DNA,甲苯胺蓝,(toluidine blue-O),及四唑指示剂,(tetrazolium),此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌热稳定核酸酶的存在。,最快可以,6,小时培养出菌落数,金葡菌肠毒素的检验,VIDAS,（,自动酶联免疫检测系统,）：,肠毒素的检测,毒素基因：如肠毒素,A-E(entA,entB,entC,entD,entE),毒素基因等，常用的方法有,PCR,、荧光,PCR,等,质量控制,采用受控的检验方法,设立微生物培养基的质量控制程序,设立质控菌株,设立实验仪器的质量控制程序：如高压锅、培养箱、生物安全柜等,人员培训,谢谢大家,后面内容直接删除就行,资料可以编辑修改使用,资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等,公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、,PPT,设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,