迷迭香酸甲酯通过抑制Akt_mTOR信号通路诱导人肝癌细胞凋亡.pdf

第 卷第期年月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)J o u r n a l o fX ia nJ i a o t o ngU n i v e r s i ty(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l N o S ep 本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版中医药研究迷迭香酸甲酯通过抑制A k t/m T O R信号通路诱导人肝癌细胞凋亡鲜瑶,江伟,刘润坤,涂康生,高士杰,王军,张雷(西安交通大学第一附属医院营养科,陕西西安 ;邵阳学院护理学院,湖南邵阳 ;西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 ;西安交通大学第一附属医院急诊与重症医学科(东院区),陕西西安 ;西安交通大学第一附属医院老年外科,陕西西安 )摘要:目的探讨迷迭香酸甲酯(m e t h y l r o s m a r i n a t e,MR)诱导人肝癌细胞(HC C)H e p B、S K H e p 凋亡的作用及其机制.方法C C K 法检测各浓度MR(m o l/L)对H e p B、S K H e p、M I HA细胞的增殖毒性作用;光学显微镜观察不同浓度MR处理三种细胞后的形态变化;E d U实验及流式细胞术分别检测H e p B、S K H e p 细胞增殖及凋亡情况;T r a n s w e l l迁移和侵袭实验检测MR对H e p B、S K H e p 细胞迁移与侵袭能力的影响;W e s t e r nb l o t t i n g检测凋亡、上皮间质转化(e p i t h e l i a l m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n,EMT)及A k t/m T O R信号通路相关蛋白的表达情况.结果不同浓度MR(m o l/L)处理H e p B、S K H e p 细胞 h,其细胞活性呈浓度依赖性显著降低(P ),而对M I HA细胞活性无显著影响(P ),H e p B、S K H e p 细胞MR的I C 分别为 m o l/L和 m o l/L.MR(m o l/L)处理后显著抑制H e p B、S K H e p 细胞增殖(P ),通过光学显微镜观察到H e p B、S K H e p 贴壁细胞死亡脱落和细胞外形凹陷萎缩,而M I HA细胞形态无明显改变.与对照组相比,、m o l/LMR诱导H e p B、S K H e p 细胞凋亡,凋亡蛋白B a x和c l e a v e dP A R P的表达显著增加(P ),而抗凋亡蛋白B c l 的表达显著下降(P );且HC C细胞的迁移和侵袭均被抑制,E c a d h e r i n的表达显著增加,N c a d h e r i n和V i m e n t i n的表达 降低(P ).W e s t e r nb l o t t i n g检测 结果 显示,经MR处 理 的H e p B和S K H e p 的p A k t和p m T O R的表达显著降低且呈剂量依赖性,这提示MR可能通过抑制A k t/m T O R信号通路发挥抗癌作用.结论MR促进H e p B、S K H e p 细胞凋亡,其作用机制可能与抑制A k t/mT OR信号通路有关.关键词:迷迭香酸甲酯;原发性肝癌;增殖;迁移;凋亡;A k t/mT O R通路中图分类号:R 文献标志码:AD O I:/j d y x b 收稿日期:修回日期:基金项目:陕西省自然科学基础研究计划(N o J C QN );陕西省重点研发计划(N o S F ,N o KW );西安交通大学第一附属医院院基金(N o Z Y T S ,N o Z Y T S )资助S u p p o r t e db y t h eN a t u r a l S c i e n c eB a s i cR e s e a r c hP r o g r a mo f S h a a n x i P r o v i n c e(N o J C QN ),t h eK e yR e s e a r c ha n dD e v e l o p m e n tP r o g r a mo fS h a a n x i,C h i n a(N o S F ,N o KW ),a n dI n s t i t u t i o n a lF o u n d a t i o no fT h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fX ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y(N o Z Y T S ,N o Z Y T S )通信作者:张雷,外科学博士,副主任医师 E m a i l:z h a n g l e i x j t u e d u c n网络出版地址:h t t p s:/k n s c n k i n e t/k c m s/d e t a i l/r h t m()M e t h y l r o s m a r i n a t e i n d u c e s c e l l a p o p t o s i s i nh u m a nh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ac e l l s v i a i n h i b i t i n g t h eA k t/m T O Rs i g n a l i n gp a t h w a y sX I ANY a o,J I ANG W e i,L I UR u n k u n,TU K a n g s h e n g,GAOS h i j i e,WANGJ u n,Z HANGL e i(D e p a r t m e n to fN u t r i t i o n,T h eF i r s tA f f l i l i a t e dH o s p i t a l o fX ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X ia n ;S c h o o l o fN u r s i n g,S h a o y a n gU n i v e r s i t y,S h a o y a n g ;D e p a r t m e n to fH e p a t o b i l i a r yS u r g e r y,T h eF i r s tA f f l i l i a t e dH o s p i t a l o fX ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X ia n ;D e p a r t m e n to fEm e r g e n c ya n dI n t e n s i v eC a r eU n i t(E a s tD i s t r i c t),T h eF i r s tA f f l i l i a t e dH o s p i t a l o fX ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X ia n ;D e p a r t m e n to fG e r i a t r i cS u r g e r y,T h eF i r s tA f f l i l i a t e dH o s p i t a l o fX ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X ia n ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v eT oi n v e s t iga t et h ec e l ld e a t h i n d u c i nge f f e c to fm e t hylr o s m a r i n a t e(MR)o nh u m a nh epa t o m aH ep Ba n dS K H epc e l l s a n d t h e i rpo t e n t i a lm e c h a n i s m s M e t h o d s T h ee f f e c t so fMRo nt h ev i a b i l i ty期鲜瑶,江伟,刘润坤,等迷迭香酸甲酯通过抑制A k t/mT OR信号通路诱导人肝癌细胞凋亡本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版o fH ep B,S K H epa n d M I HAc e l l sw e r ed e t e r m i n e dbyc e l lc o u n t i ngk i t (C C K )a s s ay T h em o rph o l ogi c a lc h a nge so f t h r e ek i n d so fc e l l st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fMR w e r eo b s e r v e dbyopt i c a lm i c r o s c op yE d Ua s s aya n df l o wcyt o m e t ryw e r eu s e dt od e t e c tt h epr o l i f e r a t i o na n dapopt o s i so fH ep Ba n dS K H epc e l l s T r a n s w e l l a s s ayw a su s e dt os t u dyt h ee f f e c t so fMRo nt h em igr a t i o na n di n v a s i o no fH ep Ba n dS K H epc e l l s W e s t e r nb l o t t i ngw a su s e dt oe v a l u a t et h epr o t e i ne xpr e s s i o nl e v e l so fapopt o s i s,EMTa n dA k t/m T O Rs ign a l i ngpa t h w ays R e s u l t s A f t e r t r e a t e dw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fMR(m o l/L)f o r h,H ep Ba n dS K H epc e l l sa c t i v i t i e sw e r es ign i f i c a n t lyd e c r e a s e di nac o n c e n t r a t i o n d epe n d e n tm a n n e r(P),w h i l et h e r ew a sn os ign i f i c a n t e f f e c t o nM I HAc e l l a c t i v i ty(P),a n d t h e I C o fH ep Ba n dS K H epc e l l sw e r e a n d m o l/L,r e spe c t i v e ly MRt r e a t m e n t(m o l/L)s ign i f i c a n t lyi n h i b i t e d t h epr o l i f e r a t i o no fH ep Ba n dS K H epc e l l s(P),w h i l ec e l l d e t a c h m e n t a n d s h r i n k agew e r eo b s e r v e dbyopt i c a lm i c r o s c op yo nt h eH ep Ba n dS K H epc e l l s,w h i l et h em o rph o l og yo fM I HAc e l l sw a sn o t c h a nge d C o mpa r e dw i t ht h ec o n t r o lgr o up,MR(,m o l/L)i n d u c e dapopt o s i s i nH ep Ba n dS K H epc e l l s,t h ee xpr e s s i o n l e v e l so f t h epr o apopt o t i cpr o t e i n sB a xa n dc l e a v e dP AR Pw e r es ign i f i c a n t lyi n c r e a s e d(P),w h i l et h ee xpr e s s i o nl e v e lo ft h ea n t i apopt o t i cpr o t e i nB c l w a ss ign i f i c a n t lyd e c r e a s e d(P)MR(,m o l/L)a l s oi n h i b i t e dt h em igr a t i o na n di n v a s i o no fHC Cc e l l s,s ign i f i c a n t lyi n c r e a s e dt h ee xpr e s s i o no fE c a d h e r i na n dd e c r e a s e dt h ee xpr e s s i o no fN c a d h e r i na n dV i m e n t i nc o mpa r e dw i t ht h ec o n t r o lgr o up(P)F i n a l ly,W e s t e r nb l o t t i ngr e s u l t s s h o w e dt h a t t h ee xpr e s s i o n so fp A k ta n dp m T ORi n H ep Ba n dS K H ept r e a t e dbyMR w e r es ign i f i c a n t lyr e d u c e di nad o s e d epe n d e n tm a n n e r,s ug ge s t i ngt h a tMR m aypl aya na n t i c a n c e rr o l ebyi n h i b i t i ngA k t/m T ORs ign a l i ngpa t h w ayC o n c l u s i o nMRc a npr o m o t eapopt o s i s i nH ep Ba n dS K H epc e l l s,w h i c hm ayb ec l o s e lyr e l a t e dt ot h ei n h i b i t i o no fA k t/m T ORs ign a l i ngpa t h w ayK E Y WO R D S:m e t hyl r o s m a r i n a t e;h epa t o c e l l u l a rc a r c i n o m a(H C C);pr o l i f e r a t i o n;m igr a t i o n;apopt o s i s;A k t/m T ORpa t h w ay肝癌是全球范围内与癌症相关死亡的第四大病因,在新发病例中数量排名第六位,预计到 年每年将影响 万人 .在原发性肝癌中,肝细胞癌(h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a,HC C)是最 常见的形 式(占),它通常与慢性肝病相关,其中乙型肝炎病毒(h e p a t i t i sBV i r u s,H B V)及丙型肝炎病毒(h e p a t i t i sCv i r u s,HC V)感染、酒精滥用和非酒精性脂肪性肝病是主要病因 .肝癌的治疗方式主要取决于肿瘤的分期,肝切除术和肝移植是早期HC C患者的首选,年生存率为 ,射频消融可以作为局部治疗的一种选择.对于中期HC C患者,经动脉化疗栓塞(t r a n s a r t e r i a lc h e m o e m b o l i z a t i o n,T A C E)已成为标准的治疗方式.对于晚期HC C患者,免疫检查点抑制剂阿特珠单抗(a t e z o l i z u m a b,抗P D L)和贝伐珠单抗(b e v a c i z u m a b,抗V E G F)的联合疗法可改善患者的预后,已作为晚期H C C患者的一线疗法,晚期H C C患者在接受索拉非尼治疗后的总生存期仅为 个月 ,而大多数晚期H C C患者不能耐受手术,多种化疗效果不佳.因此,探索安全、高效的药物可为H C C治疗中发挥关键作用.迷迭香酸甲酯(m e t h y l r o s m a r i n a t e,MR)是迷迭香酸的衍生物,是从丹参、紫苏、黄荆等唇形科植物中分离得到的天然活性成分,具有抗炎、抗菌、抗氧化作用.研究发现,MR具有抑制胃癌及宫颈癌细胞增殖的作用 ,然而MR在HC C中的抗肿瘤活性尚不明确.本研究通过体外实验探索MR对肝癌细胞的细胞毒性及治疗作用和A k t/mTO R信号通路诱导细胞凋亡相关机制.材料与方法细胞株与主要制剂人HC C细胞系H e p B、S K H e p 和人正常肝细胞系(M I HA)均购自于中科院上海细胞所细胞库,MR(分析标准品,H P L C)购自上海源叶生物科技 有 限 公 司,MR分 子 式C H O,分 子 量 ,其结构式见图,将m gMR溶解于DM S O中,保存.D u l b e c c o的改良E a g l e培养基(S i g m a),胰酶及胎 牛 血 清(G i b c o),C C K 试 剂 盒(碧 云 天),E c a d h e r i n、N c a d h e r i n、V i m e n t i n、a c t i n抗体(P r o t e i n t e c h),B a x、B c l 抗体(S a n t aC r u z).细胞培养将H e p B、S K H e p、M I HA细胞培养在含双抗、m L/L胎牛血清的DMEM培养基中,放置于 m L/LC O、细胞培养箱中,取处于对数生长期的细胞进行后续实验.西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版图MR的结构式F i g T h es t r u c t u r a l f o r m u l ao fMRC C K 法测定细胞增殖将对数期H e p B、S K H e p 和M I HA细胞用胰酶消化,接种在 孔板上.接种 h后待细胞贴壁生长良好时更换新的培养基,并加入不同浓度(、m o l/L)MR,分别培养、h后,每孔加入 LC C K 试剂,孵育h后,在 n m波长下酶标仪检测各孔吸光度(A)值,根据回归方程求半数抑制浓度(I C).细胞形态观察将H e p B、S K H e p 和M I HA细胞用MR(、m o l/L)处理 h,采用O l y m p u s光学显微镜观察并拍摄照片.E d U细胞增殖实验取对数生长期的H e p B、S K H e p 细胞,接种于 孔板中,分别加入浓度为、m o l/L的MR于培养箱中培养 h,按照操作说明进行E d U标记、细胞固化、A p o l l o染色、D N A染色及图像获取.计算E d U阳性细胞比并对结果进行统计学分析.流式细胞仪测定细胞凋亡将对数生长期的H e p B和S K H e p 细胞接种在六孔板上,用MR(、m o l/L)处理 h,收集细胞,经预冷的磷酸缓冲盐溶液(P B S)漂洗后,重悬收集细胞,并用P B S洗涤次.加入A n n e x i nV F I T C混匀,室温避光染色 m i n,再加入碘化丙啶(P I),室温避光染色,在h内使用F CM流式细胞仪检查荧光强度,观察各组细胞的凋亡情况.T r a n s w e l l迁移和侵袭实验用不同浓度MR(、m o l/L)处理H e p B和S K H e p 细胞 h,利用T r a n s w e l l小室测定细胞的迁移和侵袭能力.测定迁移能力时,在小室底部加入含 m L/LF B S的DMEM作为化学引诱剂,并用m孔的聚碳酸酯膜将小室的上下层隔开,将MR处理后的HC C细胞经无血清培养基混悬并接种在小室上层,然后将小 室 在 培 养 箱 中 培 养 h,用g/L结晶紫染色,显微镜下拍照和计数.测定侵袭能力时,M a t r i g e l基质胶按 稀释加入小室上室面,其余操作同上.W e s t e r nb l o t t i n g检测用不同浓度的MR(、m o l/L)处理H e p B和S K H e p 细胞 h后,利用R I P A裂解液抽提细胞的总蛋白并用B C A法进行蛋白定量.将待检测蛋白样品按 g/孔上样后行S D S P AG E电泳,然后通过湿转法将蛋白转移至P V D F膜上,将膜用 g/L脱脂牛奶封闭h后进行一抗(c l e a v e dP A R P:;A c t i n:;B a x:;B c l :;E c a d h e r i n:;N c a d h e r i n:;V i m e n t i n:;p A k t:;p mTO R:;A k t:;mTO R:)孵育过夜后,用T B S T溶液洗膜次,每次 m i n;二抗室温孵育h;T B S T洗膜次,每次 m i n;最后,在暗室进行E C L化学发光显影.统计学分析利用S P S S 统计软件进行数据统计分析.符合正态分布的计量资料以均数标准差(xs)表示.组间比较采用t检验,P 为差异有统计学意义.结果MR抑制H C C细胞活力和细胞增殖不同浓度的MR(、m o l/L)处理细胞 h后发现,随着浓度的增加,H e p B、S K H e p 细胞活性显著下降,具有浓度依赖性,并且H e p B和S K H e p 的I C 分别为 、m o l/L(图 A、图 B,P ).接着选取I C 和稍高一个梯度的浓度即 、m o l/LMR干预H e p B、S K H e p 的结果发现,与对照组相比,随着处理时间的延长,其细胞活力均显著下降(图 A、图 B,P ),因此,MR对HC C细 胞 的 抑 制 具 有 时 间 依 赖 性.M I HA细胞在不同MR处理浓度和不同处理时间下,其 细 胞 活 力 变 化 无 统 计 学 意 义(图 C,P ).E d U实验(A p o l l o染色)结果显示,与对照组相比,、m o l/L MR干预H e p B和S K H e p 细胞时,两组细胞的E d U阳性率显著降低,提示经MR处理的HC C增殖能力呈剂量依赖的方式显著降低(图 D、图 E,P ).期鲜瑶,江伟,刘润坤,等迷迭香酸甲酯通过抑制A k t/mT OR信号通路诱导人肝癌细胞凋亡本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版AC:C C K 实验检测MR对H e p B、S K H e p、M I HA细胞毒性作用.与对照组(DM S O处理组)比较,P,P;D、E:E d U实验观察MR对H e p B、S K H e p 细胞增殖的影响(A p o l l o染色,).图MR抑制H C C细胞活力和细胞增殖F i g MRi n h i b i t e dv i a b i l i t ya n dc e l l p r o l i f e r a t i o no fHC Cc e l l sMR诱导肝癌细胞的形态学变化、m o l/L的MR处理的HC C细胞和正常肝细胞 h,观察到随着浓度的增加,H e p B和S K H e p 细胞以剂量依赖的方式出现了贴壁细胞死亡脱落和细胞外形凹陷萎缩,细胞的分布密度显著变稀疏,而M I HA细胞在MR处理后没有明显的形态变化和细胞脱落(图).图光学显微镜观察MR对H C C细胞形态的影响()F i g O p t i c a lm i c r o s c o p i co b s e r v a t i o no f t h ee f f e c to fMRo nt h em o r p h o l o g yo fHC Cc e l l s()西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版MR诱导H C C细胞凋亡并改变细胞凋亡蛋白的表达流式细胞术检测结果显示,不同浓度的MR处理H e p B和S K H e p 细胞后,细胞凋亡率显著增加且呈剂量依赖性,说明MR显著促进了H e p B和S K H e p 细胞凋亡(图 A、图 B,P).W e s t e r nb l o t t i n g结果显示,MR处理组的H e p B和S K H e p 细胞的促凋亡蛋白B a x和C l e a v e dP A R P的表达显著上调,而抗凋亡蛋白B c l 的表达显著下降(图 C、图 D,P),表明MR显著促进了肝癌细胞的凋亡.A、B:流式细胞术检测MR对H e p B、S K H e p 细胞凋亡的影响;C、D:W e s t e r nb l o t t i n g检测H e p B、S K H e p 细胞凋亡相关蛋白的表达及比较.与对照组(m o l/L组)比较,P.图MR诱导H C C细胞凋亡并改变细胞凋亡蛋白的表达F i g MRi n d u c e da p o p t o s i s i nHC Cc e l l sa n da l t e r e dt h ee x p r e s s i o no f a p o p t o s i sp r o t e i n sMR抑制H C C细胞的迁移和侵袭能力及EMT进程T r a n s w e l l迁移和侵袭实验结果发现,MR以剂量依赖性显著降低了H e p B和S K H e p 细胞的迁移和侵袭能力(图 A、图 B,P).W e s t e r nb l o t t i n g检测HC C细胞的上皮标志物(E c a d h e r i n)和间质标志物(N c a d h e r i n和V i m e n t i n)表达的结果显示,H e p B和S K H e p 细胞经MR处理后,E c a d h e r i n的表达显著增加,而N c a d h e r i n和V i m e n t i n的表达显著降低且呈浓度依赖性(图 C、图 D,P),提示MR抑制HC C细胞的EMT进程.A、B:MR对H e p B、S K H e p 细胞的T r a n s w e l l迁移和侵袭实验结果(结晶紫染色,);C、D:W e s t e r nb l o t t i n g检测H e p B、S K H e p 细胞EMT相关蛋白的表达.与对照组(m o l/L组)比较,P.图MR抑制H C C细胞的迁移和侵袭F i g MRi n h i b i t e dt h em i g r a t i o na n d i n v a s i o no fHC Cc e l l s期鲜瑶,江伟,刘润坤,等迷迭香酸甲酯通过抑制A k t/mT OR信号通路诱导人肝癌细胞凋亡本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版MR通过抑制A k t/m T O R信号通路诱导肝癌细胞凋亡W e s t e r nb l o t t i n g检测结果显示,经MR处理的H e p B和S K H e p 的p A k t和p mTO R的表达显著降低且呈剂量依赖性(图 A、B,P).这提示MR可能通过抑制A k t/mTO R信号通路发挥抗癌作用.A:H e p B细胞;B:S K H e p 细胞.与对照组(m o l/L组)比较,P.图W e s t e r nb l o t t i n g检测MR对肝癌细胞A k t/m T O R信号通路蛋白的影响F i g W e s t e r nb l o t t i n gd e t e c t e dt h ep r o t e i ne x p r e s s i o no f t h eA k t/mTO Rs i g n a l i n gp a t h w a y s i nHC Cc e l l so fMRg r o u p s讨论传统医学不仅可以治疗一种疾病,而且将整个身体视为一个整体.MR是迷迭香酸的衍生物,广泛存在于 冬凌草、荆丹 参、西黄草、紫 苏等中草 药中.目前的研究发现,MR对胃癌细胞、宫颈癌细胞等多种人体实体恶性肿瘤细胞均有细胞毒性杀伤作用.庞磊等 发现,MR可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移等生物学功能,并通过上调L C 蛋白表达而诱导胃癌细胞发生凋亡.NAM等 发现,MR是一种新型的S K 蛋白相关抑制剂,可诱导宫颈癌细胞自噬和凋亡,而且MR增强了顺铂对宫颈癌细胞的抑制作用,这可能与mTO R/S K 抑制介导的自噬和凋亡有关.本研究结果显示,MR对肝癌细胞系H e p B和S K H e p 细胞具有明显的细胞毒性作用,并以时间的延长和剂量增加依赖性显著抑制了肝癌细胞的生长活力和增殖,并诱导两种HC C细胞系的形态发生改变.然而,不同浓度MR处理M I HA细胞后,其细胞活力及形态没有发生显著变化,提示MR对正常的肝细胞M I HA细胞没有显著的细胞毒性作用.EMT是一个高度保守的细胞程序,上皮细胞在此过程中失去 极化组织,进 而获 得 迁 移 和 侵 袭 能力.大多数来源于实体肿瘤的肿瘤细胞侵袭相邻的细胞层,这些细胞必须经过EMT的过程才能失去细胞与细胞的黏附,获得运动性.因此,EMT已被认为是促进肿瘤细胞侵袭和恶性肿瘤进展的原发性细胞事件.本研究发现,MR通过促进E c a d h e r i n的表达上调,N c a d h e r i n和V i m e n t i n的表达下调而达到抑制EMT过程.AK T/mTO R通路与肿瘤的增殖、侵 袭、转 移 和 分 化 相 关 .磷 酸 化AK T(p AK T)是激活AK T的关键步骤,活化AK T磷酸化并激活mTO R,磷酸化的mTO R(p mTO R)激活下游靶点,促进肿瘤恶性过程.细胞凋亡是受到精确调控的程序性细胞死亡的一种特殊形式,可使细胞分裂成紧密的膜封闭结构,称为凋亡小体,进而被邻近的细胞和吞噬细胞所吞噬,通常可以阻止炎症的发生及组织的损伤.细胞凋亡过程中首先出现细胞收缩和染色质凝结、核碎裂等细胞形态的改变,然后半胱氨酸蛋白酶活性引起的细胞膜包裹细胞内容物进入凋亡小体,半胱氨酸蛋白酶裂解多个蛋白,导致凋亡 小 体 被 吞 噬 细 胞 识别.细胞凋亡存在内外两种途径:线粒体通路(内在途径)主要通过B c l 家族成员触发凋亡,B c l 家族通过诱导线粒体外膜通透性、细胞色素c的释放及引发半胱氨酸蛋白酶级联反应,导致细胞凋亡;死亡受体的激活通路(外在途径)通常由死亡配体和死亡受体结合而发生,死亡配体主要为肿瘤坏死因子(t u m o rn e c r o s i sf a c t o r,T N F)家族,包括F a s配体、T N F受体和T N F相关的凋亡诱导配体,与死亡受体结合后招募c a s p a s e 及F a s相关死亡结构域蛋白进而组装成死亡诱导信号复合体,从而活化c a s p a s e 来执行细胞凋亡.本研究通过流式细胞仪检测发现MR可诱导肝癌细胞凋亡,并且MR处理后H e p B和S K H e p 中的促凋亡蛋白B a x和c l e a v e d P A R P的表达均显著升高,而抗凋亡调节因子B c l 表达显著降低,且p A k t和p mTO R表达明显降低.这提示MR通过抑制A k t/mTO R信号诱导人肝癌细胞西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版凋亡.本研究在一定程度上为肝癌的临床治疗提供了理论参考.参考文献:V I L L ANU E VA AH epa t o c e l l u l a rc a r c i n o m aJN E nglJM e d,():L L OV E TJM,K E L L E YRK,V I L L ANU E VAA,e t a l H epa t o c e l l u l a rc a r c i n o m aJ N a tR e vD i sP r i m e r s,():C RA I G AJ,VO NF E L D E NJ,GAR C I A L E Z ANAT,e ta l T u m o u re v o l u t i o ni nh epa t o c e l l u l a rc a r c i n o m aJN a tR e vG a s t r o e n t e r o lH epa t o l,():A B D E L RAHMANO,A B D E L WAHA B M,S HAK E R M,e ta l S o r a f e n i bv e r s u sc ape c i t a b i n ei nt h e m a n age m e n to fa d v a n c e dh epa t o c e l l u l a r c a r c i n o m aJ M e dO n c o l,():ZHU YJ,ZH E NGB,WANG H Y,e t a l N e wk n o w l e dgeo ft h em e c h a n i s m s o f s o r a f e n i br e s i s t a n c e i n l i v e r c a n c e rJ A c t aP h a r m a c o l S i n,():L L OV E TJM,R I C C IS,MA Z Z A F E RROV,e ta l S o r a f e n i bi na d v a n c e dh epa t o c e l l u l a r c a r c i n o m aJ NE ngl JM e d,():CH E NGAL,KANGYK,CH E NZ,e t a l E f f i c a cya n d s a f e tyo fs o r a f e n i bi npa t i e n t si nt h e A s i a P a c i f i cr egi o n w i t ha d v a n c e d h epa t o c e l l u l a rc a r c i n o m a:Aph a s eI I Ir a n d o m i s e d,d o u b l e b