利用转录组分析香菇子实体不分化组织.pdf

1 食用菌学报 2023.30（4）：2023.04.利用转录组分析香菇子实体不分化组织刘 昆，蒋 俊，宋小亚，路新彦，应国华，曾凡清（丽水市农林科学研究院，浙江 丽水 323000）摘 要：利用转录组分析香菇（Lentinula edodes）不分化组织与正常原基，探讨香菇子实体发育机制。结果表明：与正常原基相比，不分化组织中差异表达水平6的基因有62个（上调表达基因49个，下调表达基因13个），其中2个逆转座子核心蛋白基因上调表达，4个热激蛋白基因下调表达。GO功能富集分析结果显示，差异表达基因主要富集于细胞膜组件、细胞膜组成成分、细胞膜固有成分、胞内膜结合细胞器、膜结合细胞器这5个二级分类单元中。KEGG代谢途径富集分析结果表明，差异表达基因主要富集于精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，次生代谢物的生物合成，氧化磷酸化与MAPK信号通路等。关键词：香菇；不分化组织；原基；转录组分析Comparative Transcriptome Analysis of Undifferentiated Fruiting Body Tissue of Lentinula edodes LIU Kun,JIANG Jun,SONG Xiaoya,LU Xinyan,YING Guohua,ZENG Fanqing(Lishui Institute of Agriculture and Forestry Sciences,Lihui 323000,Zhejiang,China)Abstract:The mechanism of Lentinual edodes fruiting body development was studied by comparative transcriptome analysis of undifferentiated fruiting body tissue(Ndt)and normal fruiting body primordium(Pri)of L.edodes cultivar L808.The results showed that there were 62 genes with difference levels between Ndt and Pri greater than six,among which 49 genes were up-regulated and 13 genes were down-regulated.For example,two gag-polypeptide of LTR copia-type genes were up-regulated,and four heat shock protein genes were down-regulated.GO enrichment analysis showed that the differentially expressed genes(DEGs)were mainly enriched in cell membrane synthesis related functional units,including membrane part,integral component of membrane,intrinsic component of membrane,intracellular membrane-bounded organelle,and membrane-bounded organelle.KEGG pathway enrichment analysis showed that the DEGs were mainly enriched in arginine biosynthesis,alanine,aspartate and glutamate metabolism,biosynthesis of secondary metabolites,oxidative phosphorylation,and MAPK signaling pathway.Key words:Lentinula edodes;undifferentiated tissue;primordium;transcriptome analysis香菇（Lentinula edodes）已成为我国产量最高的食用菌。2020 年，我国香菇鲜品总产量达1 188.21万吨，占我国食用菌产量的29.25%1。香菇子实体品质直接决定其栽培产量与商品价值。如何调控香菇子实体的发育是香菇研究的核心问题，也是香菇栽培技术的关键问题。香菇从菌丝体收稿日期：2023-02-11原稿；2023-04-06修改稿基金项目：丽水市科技局重点研发项目（2017ZDYF09）；国家现代农业产业技术体系（CARS-20）；浙江省农业新品种选育（食用菌新品种选育）重大科技专项（2021C02073-1-2）作者简介：刘 昆（1984），男，硕士，助理研究员，主要从事食用菌菌种质量相关研究。E-mail:112001 2 第 30 卷食 用 菌 学 报营养生长到子实体生殖生长是其生活史中重要的生理过程，子实体的发育受到遗传、环境、菌种质量等多方面的影响2。近几十年来，分子生物学与生物信息学蓬勃发展，极大地促进了香菇子实体发育相关基因的研究。研究者利用转录组、蛋白组等技术对香菇菌丝营养生长3、菌丝转色4-5、原基形成、菌柄菌盖发育多个生长阶段6-7的基因进行了深入分析，发现多个与香菇子实体发育相关的基因，如：原基期大量表达的priB8、Le.hyd1、Le.hyd29，在菌丝体与子实体成熟前期大量表达的Le.CDC510，只在子实体中表达的mfbC11和exg112，在菌褶中高度表达的uck1及促进菌褶褐变的Letyr13，在子实体凋亡与香菇多糖降解期间表达的tlg114。现有的研究多数集中于香菇正常发育过程的变化，对香菇突变体的发育研究较少。李海峰15和蔡为明等16利用差异显示技术对不分化球形香菇子实体菌株进行分析，获得多个差异基因片段。龚玉华等17利用差异蛋白组分析香菇菌褶发育缺失菌株雨花5号，发现菌褶突变子实体在原基期与幼菇期缺失175个蛋白。方子雅18研究发现，物理环境可能是产生香菇异形子实体的主要原因。YAN等19利用转录组研究香菇菌盖边缘发育异常子实体发现，跨膜转运、核糖体合成、氨基酸代谢相关通路基因在异常子实体中显著富集。笔者在进行香菇L808菌种活力研究中，在多个菌棒中发现不分化组织（图1）。这些菌棒上的菌丝在生长、转色等方面均正常，但在子实体形成过程中，类似原基组织发生后便不断膨大，表面仅有不规则的组织突起形成，直至老化腐烂死亡，未见菌柄、菌褶、菌盖分化，对其进行组织分离后再次栽培，不分化菌株在栽培过程中均未见形态分化，直至腐烂，这种现象在国内外未见报道。这些突变菌株的获得为研究香菇子实体分化机制提供了良好的材料。笔者利用转录组技术分析香菇不分化组织与正常香菇原基的差异表达基因，并对这些基因进行生物信息学分析，旨在发现调控香菇子实体分化的功能基因，探讨香菇子实体发育的分子机制，为香菇及其他食用菌的子实体发育机制研究提供参考。图 1 不分化组织Fig.1 Undifferentiated tissue1 材料与方法1.1 供试材料香菇（L.edodes）L808由丽水市大型真菌种质资源保藏库提供。2019年8月，参考陈俏彪等20的方法制作菌棒，采用秋季高棚层架定向出菇模式，在浙江松阳赤寿乡进行栽培，分别获得不分化 3 刘 昆，等：利用转录组分析香菇子实体不分化组织第 4 期组织（Ndt）和正常原基组织（Pri）。从菌棒中随机对两组样品取样，3个重复，样品用锡箔纸包裹，经液氮速冻后置于-80 保存，备用。1.2 试剂和仪器RNA 提取试剂盒购自成都百菲特科技有限公司；RNA 文库构建试剂盒（NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit）购自北京纽英伦生物技术有限公司；逆转录试剂盒（GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit Ver2）购自北京擎科生物科技有限公司。2100生物分析仪（美国Aglient公司）；N50超微量分光光度计（德国IMPLEN公司）；Qubit 2.0荧光定量仪（美国Thermo Fisher公司）；FQD-96A荧光定量PCR仪（杭州博日科技公司）。1.3 转录组文库构建与测序采用RNA提取试剂盒提取样品总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和生物分析仪检测总RNA的完整性。用超微量分光光度计检测RNA纯度。使用荧光定量仪测定RNA质量浓度。按照试剂盒说明书构建RNA文库，使用生物分析仪进行质检，合格后委托北京诺禾致源生物信息有限公司利用Illumina HiSeq2500高通量测序平台对文库进行双末端（PE150）测序。1.4 转录组数据处理与新基因预测经转录组测序后得到的原始数据（raw reads）经fastp软件过滤，去除测序接头重复冗余序列及低质量序列，获得用于后续分析的高质量序列（clean reads）21。使用HISAT2 v2.0.5软件将clean reads与香菇参考基因组序列进行比对22。参考基因组来源于日本岩手县生物技术研究中心（Iwate Biotechnology Research Center）公布的NBRC 111 202菌株（GenBank登录号：GCA_002003045.1）。采用StringTie软件进行新基因预测23。1.5 基因定量与差异基因分析将预测得到的新基因与参考基因组注释信息进行合并，使用Subread软件中featureCounts工具计算比对到的基因数量，根据基因长度计算每个基因的FPKM（pair reads per kb million reads）24。使用DESeq2软件将两组差异表达基因的read count进行标准化处理25。使用负二项分布法对片段分布进行估计，并对P值进行多重假设检验校正，以|log2(fold change)|0、P0.05为标准对差异基因进行筛选。采用clusterProfiler软件对差异基因进行GO（gene ontology）功能富集和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）代谢途径富集分析，确定差异表达基因参与的代谢和信号转导途径26。1.6 实时荧光定量PCR验证用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。随机选取10个上调和10个下调表达的差异显著基因，以-actin为内参基因进行荧光定量PCR验证27，每个基因3个重复，基因相对表达量使用2-Ct法计算28，基因及对应引物信息见表1。表 1 荧光定量 PCR 所用引物Table 1 Primers used for RT-qPCR基因Gene 编码蛋白Protein上游引物序列Forward primer(5 3)下游引物序列Reverse primer(53)-actin-肌动蛋白-actinGCATCCTGTCCTTCTTACCGAG AAGAGCGAAACCCTCGTAGATGLENED_007669Copia 逆转座子 gag 多肽Gag-polypeptide of LTR copia-typeGGCAGCGTTTGCATTCTTCTTCCCAAGTTCTCCCAACAGCLENED_010728假定蛋白Hypothetical proteinATGTGAGCGCTTGTGGTTTGCGCTATTCAAGCGCATTGCTLENED_007668Copia 逆转座子 gag 多肽Gag-polypeptide of LTR copia-typeCCTCCATACCCGTGAACTGCCCCTGCATCTGCATCGTTTC 4 第 30 卷食 用 菌 学 报基因Gene 编码蛋白Protein上游引物序列Forward primer(5 3)下游引物序列Reverse primer(53)LENED_001145枯草杆菌家族蛋白酶Subtilase family proteaseGCGCCTCCCTTTGTAAGTGTGCTGGTAAGGTCTGGTTCGTLENED_0077884-羟基苯甲酸异戊烯基转移酶4-Hydroxybenzoate polyprenyltransferaseTATGGTGTCCCGCACGAAAGGCAAGAAACACTCCCAGCACLENED_003056假定蛋白Hypothetical proteinATCCATCCTGGGTAGCCGATAAGTAACACACGCCGACCATLENED_0077864-羟基苯甲酸异戊烯基转移酶4-Hydroxybenzoate polyprenyl transferaseTCTTCTGCCTTGCTCTGTGGAAGTCTCTGCAATCAGCGGGLENED_007229假定蛋白Hypothetical proteinTATTCTGGGACATCTGCGGTGGCTTGTAGCCGGAACCATGALENED_004874假定蛋白Hypothetical proteinAGCTGTGTGAAGTAAGTCCCC CATGGATGCCAAGACCCTGALENED_007666假定蛋白Hypothetical proteinATAGCCATAGCGGCAGCAAAGCCTGGAAGGAGATCGACACLENED_000557热激蛋白Hsp20TTGACCACCCACCTTGACACAGAACCTTGTCACCGCTTCALENED_000558热激蛋白Hsp20ACTTGCACGAAAACGCTGACGAAGACACCTTGCTTTCGCCLENED_003869主要协助转运蛋白超家族Major facilitator superfamilyTTGCCAATGACTCACAGGGGGTGCTGCTGCTTTGTGCTAALENED_004615假定蛋白Hypothetical proteinCTGATTGCGGATGCGGTATGTTCAAGTAGGGAGCAGAGGGALENED_004809卤代酸脱卤酶样水解酶Haloacid dehalogenase-like hydrolaseGCAATAGCCAGACAGACCGAGTATTTGCGCCTTGAACGGTLENED_002372假定蛋白Hypothetical proteinGCGTTTTGGTTCCCTTGCATGGCTGCTGGAACAACCAAAGLENED_010058假定蛋白Hypothetical proteinTATGGGTCGTTTGGATGCCCTCCCAAGCCAGATAGACCGALENED_003931热激蛋白Hsp20CCGAGGTTCATAAGGCCCAAGACGCCTTGAGGAAGCTGTALENED_003930热激蛋白Hsp20TTTGGGAACGTCACCGTCAGTGGCAAGTTCTCGCGTATGTLENED_012872热激蛋白Hsp20GCACACACCCCGAAAATACGTTGCCTTTGTCTCCATCGCT2 结果与分析2.1 测序质量评估结果六个样品测序原始数据经过滤共获得 3.1 Gb 高质量序列。将高质量序列与参考基因组序列（GenBank登录号：GCA_002003045.1）进行比对，结果表明，所有样品的clean reads比对到参考基因组中的比例均超过83%，比对到参考基因组唯一位置的clean reads均超过总数的80%（表2），说明测序质量较好，可以满足下游生物信息数据统计分析工作。经StringTie软件预测，共发现1 466条新转录本，这些转录本的获得丰富了香菇基因组基因库。续表 5 刘 昆，等：利用转录组分析香菇子实体不分化组织第 4 期表 2 测序数据与参考基因比对结果Table 2 Comparison of sequencing data and reference genome样品Sample编号No.Clean read 总数Total clean reads比对到基因组的clean reads 数Number of clean reads mapped to the reference genome有唯一比对位置的clean reads 数 Number of uniquely mapped clean reads有多个比对位置的clean reads 数Number of multi-mapped clean reads 正常原基组织Normal primordialtissuePri_157 144 16249 440 886(86.52%)48 855 403(85.50%)585 483(1.02%)Pri_257 783 91249 775 177(86.14%)49 155 950(85.07%)619 227(1.07%)Pri_341 402 56434 770 405(83.98%)34 368 759(83.01%)401 646(0.97%)不分化组织UndifferentiatedtissueNdt_154 734 06245 733 559(83.56%)45 188 098(82.56%)545 461(1.00%)Ndt_245 189 55838 370 280(84.91%)37 941 303(83.96%)428 977(0.95%)Ndt_356 697 41647 351 044(83.52%)46 791 329(82.53%)559 715(0.99%)注：括号中为比对到参考基因组的clean reads 百分比。Note:percentages of clean reads mapped to the reference genome are in brackets.2.2 差异表达基因分析将Ndt与Pri的转录组数据进行差异表达基因筛选与热图聚类分析，结果见图2A。结果表明，两组样品之间上调（红色）与下调（蓝色）基因的聚类结果差异明显。组内3个重复之间表达情况较一致。Ndt与Pri之间差异显著表达基因共5 700个，其中上调基因2 914个，下调基因2 786个。Ndt与Pri的差异表达基因火山图见图2B，图中红色与蓝色点分别代表显著上调与下调基因；横坐标为两组织中基因表达量差异倍数的对数值，离坐标原点越远，差异越大；纵坐标为显著表达基因表达量的多重假设检验校正的负对数值，纵坐标数值越大，基因差异表达越显著，筛选到的差异表达基因更可靠。Ndt与Pri之间差异水平|log2(fold change)|2的共有194个基因，6的基因有62个，其中上调表达基因数目为49个，下调表达仅13个。图 2 Ndt 与 Pri 的差异表达基因热图（A）与火山图（B）Fig.2 Heatmap(A)and volcano map(B)of differentially expressed genes between undifferentiated tissue(Ndt)and normal primordial tissue(Pri)6 第 30 卷食 用 菌 学 报对上述62个基因进行功能注释分析发现，可以比对到相关功能的上调表达基因中包含逆转座子核心蛋白（gag-polypeptide of LTR copia-type）、枯草杆菌家族蛋白酶（subtilase family）、裂解糖基转移酶（lytic transglycolase）、糖苷水解酶（glycosyl hydrolases family）基因等，其中逆转座子核心蛋白基因有两个拷贝，且均位于同一个scaffold中；而下调表达的13个基因中，4个基因功能均为热激蛋白基因（Hsp20），其他基因包括真菌疏水蛋白、主要协助转运蛋白超家族、卤代酸脱卤酶样水解酶基因等。2.3 差异表达基因的GO功能富集与KEGG代谢途径富集分析为深入分析子实体不分化组织中差异表达基因的所属功能，将所有差异表达基因进行 GO功能富集分析（图 3）。差异表达基因分成生物学过程（biological process）、细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）3大类。与Pri相比较，Ndt中细胞组分一级分类下的细胞膜功能相关基因差异最为显著，其中细胞膜组分（membrane part）、细胞膜组成成分（integral component of membrane）、细胞膜固有成分（intrinsic component of membrane）、胞内膜结合细胞器（intracellular membrane-bounded organelle）、膜结合细胞器（membrane-bounded organelle）这5个二级分类单元中，富集到的差异表达基因数目分别达到249、220、220、102、102个。这与Ndt处于不断生长，细胞不断分裂增加的表型相对应，这些基因可能参与Ndt的发育过程。7 刘 昆，等：利用转录组分析香菇子实体不分化组织第 4 期注：A.上调表达；B.下调表达。Notes:A.up-regulated;B.down-regulated.图 3 差异表达基因 GO 功能富集分析 Fig.3 GO enrichment analysis of differentially expressed genesKEGG是整合基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库。对Ndt与Pri两组样品所有差异表达基因进行KEGG代谢途径富集分析，未见显著富集结果。分别单独对上调表达与下调表达基因进行富集分析，发现上调基因主要富集于精氨酸生物合成（arginine biosynthesis），丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸代谢（alanine,aspartate and glutamate metabolism），次生代谢物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites），氨基酸合成（biosynthesis of amino acids），RNA转运（RNA transport），抗生素生成合成（biosynthesis of antibiotics）等代谢途径（图4A）。下调基因主要富集于氧化磷酸化通路（oxidative phosphorylation）和MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）（图4B）。2.4 荧光定量PCR验证结果综合以上分析结果，笔者选取在Ndt中显著上调表达与显著下调表达各10个基因进行荧光定量PCR验证。结果表明，荧光定量PCR结果与转录组测序结果趋势一致（图5），证明转录组数据分析结果可靠。8 第 30 卷食 用 菌 学 报注：A.上调表达；B.下调表达。Notes:A.up-regulated;B.down-regulated.图4 差异表达基因KEGG代谢途径富集分析 Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes 9 刘 昆，等：利用转录组分析香菇子实体不分化组织第 4 期图 5 差异表达基因量荧光定量 PCR 验证结果Fig.5 Verification of differential gene expression by qPCR3 讨论香菇子实体发育是自身基因与环境共同调节的复杂生命过程。在环境影响下，子实体分化还需要相关基因协同作用。筛选相关功能基因最直接最有效的方法是在生产中寻找突变体，对正常与突变菌株进行比对分析，但香菇栽培所用菌株为无性繁殖，突变机率较小，国内仅有少量报道关注畸形香菇子实体，如“荔枝菇”、“松果菇”、“蜡烛菇”、“富士香菇”等29-30。引起香菇畸形的原因主要有遗传15-16,31、病毒32、环境等33。笔者对Ndt与Pri分别进行组织分离，并进行栽培验证与病毒检测。两菌株在相同条件下再次栽培，Ndt菌株在栽培过程中，其组织未见形态分化，直至腐烂；Pri菌株的子实体形态正常，均有菌盖、菌褶和菌柄发育，两菌株在相同环境中表型稳定。笔者后来用荧光定量PCR分析Ndt和Pri菌株中病毒，结果发现两菌株中均存在LeV-HKB病毒，组织中的病毒相对含量相近，因此，病毒可能不是引起Ndt发生变化的原因。转录组分析发现，Ndt与Pri的差异表达基因中，逆转录转座子（gag-polypeptide of LTR copia-type）与热激蛋白（Hsp20）基因的差异水平6，且拷贝数分别有2个和4个，2个逆转录转座子基因连续排列于同一个scaffold中，4个热激蛋白基因分两组，同样前后分布在两个scaffold中，这表明Ndt发生遗传突变的可能性较高，后期需使用正向或反向遗传手段进行深入研究。在真菌中，以RNA介导转座的类转座子最为常见34-35。长未端逆转录转座子（LTR）则在类转座子中占比最高36。在担子菌基因组中，LTR中的Gypsy与Copia两个超家族（superfamilies）占据主导地位34。在通常情况下，基因组中的LTR会被宿主严格控制，而处于沉默或低转录水平，以避免不利突变的产生37-38，但LTR可被多种生物或非生物的环境因素激活而产生活性，如榆枯萎病菌（Ophiostoma novo-ulmi）中POHIO2转座子可被紫外线与冷胁迫激活38。具有活性的转座子对真菌有多种影响，如在裂褶菌（Schizophyllum commune）中，Scooter转座子影响两个基因的调节功能39。在大麦坚黑粉菌（Ustilago hordei）中，转座子插入到一个无毒基因识别位点，阻碍多个植物宿主对其进行识别，提高自身适应性40。在多个病原真菌中，位于转座元件丰富区域的效应蛋白基因可以积累更多的突变，提高真菌对环境的适应性41。在宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）某些菌株中，还发现一个超大转座子，可以抑制宿主对5种重金属的富集42。本研究中，Ndt中的逆转录转座子大量表达，可能是受到某种内在或外在因素的影响而被激活。根据正常原基中热激蛋白的大量表达推断，热胁迫可能扮演重要角色。热激蛋白也称为热休克蛋白，是生物体为应对生物或非生物胁迫而表达的一组蛋白或分子伴侣，用于行使相应的生物功能。热激蛋白可以参与转录、翻译及翻译后的蛋白修饰、蛋白折叠、蛋 10 第 30 卷食 用 菌 学 报白聚集与解聚等多个生物过程43。真菌中热激蛋白包括HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40及小分子热激蛋白（small HSPs）等家族。HSP20便是一种小分子热激蛋白，同时也是一种分子伴侣，可以辅助蛋白质的折叠，阻止不正确的非功能折叠，抑制不可逆聚合物产生44。HSP20已被证明可提升双孢蘑菇（Agaricus bisporus）45和香菇46耐热性，同时在适应高温环境的硬毛粗盖孔菌（Coriolopsis trogii）基因组中，也发现串联存在的Hsp20基因可在高温条件下大量表达47。本研究中Hsp20基因在Pri中大量表达，而Ndt中表达量极低，表明Ndt中应对热胁迫相关的基因可能发生变异。本研究利用转录组测序技术分析香菇 L808子实体不分化组织与正常原基的差异表达基因，这为下一步研究香菇及其他食用菌子实体发育分子调控机制提供了思路，但本研究仅是对子实体不分化组织发生原因的初步分析，后续还需结合更多方法进行深入地分析验证，期望未来能对香菇子实体发育过程有更深入地认知。参考文献1 中国食用菌协会.2020年度全国食用菌统计调查结果分析EB/OL.(2021-12-28)2023-01-10.https:/ 宋林丽,邢晓科,郭顺星.大型真菌子实体发生的形态学过程及调控机制J.菌物学报,2018,37(6):671-684.3 李军辉.香菇(Lentinula edodes)菌丝不同发育形态差异表达基因的克隆及表达分析D.南京:南京农业大学,2006.4 YOO S 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