狼毒大戟提取物对结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞的免疫机制研究.pdf

Mod Diagn Treat现代诊断与治疗2023 Jun 34渊12冤结核病目前仍是一种严重危害人类健康的传染病袁尽管已经采取多种措施进行预防尧治疗和控制袁但截止至今日仍排列全球十大死亡原因之一遥 我国对于降低结核病发病率和死亡率方面已经取得实质性进展袁但是由于 HIV尧糖尿病尧治疗其他疾病等多种因素导致对临床多种抗结核药物耐药的结核发生率一直居高不下咱1暂遥 目前临床主要通过规律服用抗结核药物进行治疗袁治疗周期长尧患者依从性差和药物副作用大袁最终导致治疗失败咱2暂遥 我国拥有几千年的中医文明袁在治疗结核病方面也积累了有疗效的方剂与治疗理念遥 有研究表明狼毒大戟根提取物在治疗多种疾病方面发挥一定作用咱3-5暂遥 赵奎君等咱6暂体外提取的狼毒不同组分对结核分枝杆菌的抑菌作用表明袁狼毒乙素具有最强的抑菌作用遥 目前临床上应用成熟的中成药结核灵片袁99%的成分为狼毒乙素袁主要用于治疗 M.tb 感染的多种结核咱7-9暂遥本研究旨在体外构建 M.tb 感染巨噬细胞的模型袁采用不同浓度的狼毒乙素进行干预袁 初步探讨狼毒乙素对感染后巨噬细胞免疫功能存在的影响遥 报道如下遥1材料与方法1.1材料狼毒乙素购自中检院曰RAW264.7 巨噬细胞和 M.tb 弱毒菌株 H37砸a 由本实验室培养和保存曰胎牛血清尧PBS 缓冲液和高糖 DMEM 培养液购自美国 Gibco 公司曰Lyso-Tracker Red 购自上海碧云天曰TNF-琢 和 IL-6 试剂盒购自广州宝润曰4%的台盼蓝染色液购自 Biosistems 公司曰LUNA-II 自动细胞计数仪曰TBhealthy 细菌超声分散仪曰Leica 倒置荧光显微镜曰ESCO 细胞培养箱遥1.2RAW264.7 巨噬细胞培养将冻存于液氮中的RAW264.7巨噬细胞取出袁于37益水浴箱中复苏 5 min袁再加含 10%胎牛血清的高糖 DMEM 培养基 10 ml袁最后置于 37益袁5%CO2浓度的培养箱中进行培养遥1.3RAW264.7 巨噬细胞活性检测将复苏完毕的巨噬细胞袁按 2伊104/孔的浓度接种于 96 孔板上袁并加入 10 滋l 配制好的台盼蓝工作液袁静置 15 min袁将含有台盼蓝的细胞溶液吸到计数板中袁并用 Luna 细胞计数仪自动计算细胞数袁以活细胞数大于 80%为合格袁并用于后续实验遥1.4M.tb 感染模型的建立将保存在-80益的 M.tb弱毒菌株 H37a 复苏后袁接种于 7H9 培养基中培养袁使用TBhealthy超声分散仪将菌液浓度调整至 0.5麦氏浓度袁将 RAW264.7 巨噬细胞与 H37Ra 按照 1颐10 的比例充分混匀袁并将混悬液置于合适条件的培养箱中培养遥1.5实验分组及处理以少量吐温助溶袁加蒸馏水配置成 1.6 mg/ml 的起始溶液遥 按照狼毒乙素含量不同分为院空白对照组尧狼毒乙素 0.1 滋g/ml 组尧狼毒乙素0.5 滋g/ml 组尧狼毒乙素 2.5 滋g/ml 组和狼毒乙素12.5滋g/ml 组袁每组设置 5 个复孔遥 分别加到 M.tb 感染巨噬细胞的模型里袁48 h 后收集上清液和细胞遥*院广州市中医药和中西医结合科技项目渊项目编号20202A010008冤曰广东省组织器官区域免疫与疾病重点实验室开放课题渊项目编号2019B030301009-003)#院通信作者狼毒大戟提取物对结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞的免疫机制研究*李云1袁李祥2袁姚银钗1袁刘慧1袁关平1#渊广州市胸科医院 1.检验科曰2.药剂科袁广东 广州 510095冤摘要院目的研究狼毒大戟提取物渊狼毒乙素冤在结核分枝杆菌渊M.tb冤感染巨噬细胞中的作用及免疫机制遥方法建立结核分枝杆菌H37Ra感染巨噬细胞模型袁并用4%台盼蓝检测M.tb感染巨噬细胞后的活性进行检测袁用不同浓度的狼毒乙素渊0.1 滋g/ml尧0.5 滋g/ml尧2.5 滋g/ml尧12.5 滋g/ml冤干预模型袁利用Lyso-Tracker Red染色检测巨噬细胞内溶酶体发生的酸性变化曰采用TNF-琢和IL-6酶联免疫吸附试剂盒检测细胞因子的分泌状况遥结果Lyso-Tracker Red染色结果显示袁狼毒乙素能促进自噬体产生袁使溶酶体的正常酸化程度增强袁从而提高RAW264.7巨噬细胞的自噬能力遥与空白对照组相比袁在狼毒乙素干预下袁炎性细胞因子TNF-琢和IL-6受到抑制袁并且呈剂量相关性渊P约0.05冤曰随着狼毒乙素的浓度增加袁细胞因子的分泌受到抑制程度也增大袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥结论狼毒乙素通过诱导RAW264.7巨噬细胞的自噬袁来增强RAW264.7巨噬细胞清除M.tb的能力遥狼毒乙素能够降低炎性细胞因子的水平袁且与剂量成明显负相关袁说明狼毒乙素具有抗炎作用袁可以减弱炎症细胞因子的释放遥关键词院狼毒乙素曰RAW264.7巨噬细胞曰TNF-琢曰IL-6曰结核分枝杆菌中图分类号院R446.6文献标志码院B文章编号院1001轧8174渊2023冤12轧1821轧031821窑窑Mod Diagn Treat现代诊断与治疗2023 Jun 34渊12冤1.6Lyso-Tracker Red 染色严格按照试剂说明进行实验操作袁配制 Lyso-Tracker Red 工作液袁使得工作液最终浓度达到 50 nmol/L遥 将空白组和各浓度药物组分别以 PBS 冲洗两次袁再加入 Lyso-Tracker Red工作液袁置于 37益温箱中袁培养 50 min遥 将未进入细胞内的残余 Lyso-Tracker Red 吸出袁并加入新配制的 DMEM袁在倒置荧光显微镜下进行观察遥此时可观察到巨噬细胞内的溶酶体呈现明亮的红色荧光袁根据荧光的强弱变化间接反映溶酶体内的酸性变化遥1.7TNF-琢 和 IL-6 含量测定在 6 孔板里以 1伊106个/ml 的密度将 RAW264.7 巨噬细胞巨噬细胞进行接种袁并进行相同的细胞分组和处理袁每个水平的浓度设置 5 个复孔遥 48 h 后吸取细胞上清液袁并严格按照产品说明书袁用 ELISA 试剂盒进行测定遥调整酶标仪波长至 450 nm袁细胞因子的浓度根据标准曲线计算出遥1.8统计学处理采用 SPSS 23.0 统计学软件进行处理遥 计量资料采用渊x依s冤表示袁行 t 检验曰连续变量数据通过 Shapir-Wilk 测试是否符合正态分布袁若符合袁则使用单因素方差分析曰若不符袁则采用多个独立样本非参数检验分析遥 P约0.05 表示差异有统计学意义遥2结果2.1狼毒乙素阻碍巨噬细胞的酸化采用 Lyso-Tracker Red 来探究狼毒乙素对 M.tb 感染后的RAW264.7 巨噬细胞溶酶体 pH 的影响遥 Lyso-Tracker Red 的红色荧光会随着细胞内溶酶体酸性程度的增加而增加遥 结果显示袁与空白对照组相比袁除 0.1 滋g/ml 组袁其他浓度的狼毒乙素处理组都随着浓度的升高而升高袁细胞内的红色荧光强度更强袁且染色也更鲜艳袁0.1 滋g/ml 组红色荧光强度弱袁染色较暗淡遥 说明狼毒乙素促进了 M.tb 感染后的巨噬细胞溶酶体的正常酸化袁从而激活了巨噬细胞启动自噬遥见图 1遥2.5 滋mol/L12.5 滋mol/L图1狼毒乙素对M.tb感染RAW264.7巨噬细胞巨噬细胞内溶酶体的影响Blank0.1 滋mol/L0.5 滋mol/L2.3不同狼毒乙素干预后对 TNF-琢 和 IL-6 分泌影响TNF-琢 和 IL-6 在不同浓度狼毒乙素干预 M.tb感染 RAW264.7 巨噬细胞巨噬细胞后袁分泌较空白对照组有不同程度降低袁并且随狼毒乙素药量的增加袁分泌量受抑制的程度也随狼毒乙素的增加而增加袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥 见图 2遥3讨论结核分枝杆菌渊M.tb冤不能独立生存袁通常把巨噬细胞视为自己的避难所袁并在巨噬细胞内完成其感染的大部分周期袁因此巨噬细胞是抗结核分枝杆菌发挥重要作用遥M.tb 感染巨噬细胞以后袁巨噬细胞分泌细胞因子尧产生氧和氮产物尧促进溶酶体酸化和诱导吞噬体-溶酶体融合等咱10暂遥巨噬细胞分泌的 TNF-琢 反过来刺激自身合成一氧化氮合酶(NOS2)袁使寄居在细胞内的 M.tb 被杀死遥 TNF-琢 和 TNF-琢 受体缺乏会表现出结核易感性和肉芽肿形成受损遥 TNF-琢 分泌过量也会导致严重的病理状况袁如脓毒血症和类风湿性关节炎等咱11暂遥早期机体的炎症反应是 IL-1822窑窑Mod Diagn Treat现代诊断与治疗2023 Jun 34渊12冤6 与 TNF-琢 共同参与的袁诱导淋巴细胞增殖分化袁促使急性时相蛋白的生成遥有研究表明咱12暂袁IL-6 可以作为结核病患者治疗效果和康复的候选标志物遥 通过实验发现袁狼毒乙素干预 M.tb 感染 RAW264.7 巨噬细胞后袁TNF-琢 和 IL-6 在细胞上清液中的分泌量受到抑制遥 因此狼毒乙素可以调节 RAW264.7 巨噬细胞细胞因子的分泌袁从而起到一定的抗炎作用袁对结核病的治疗起到辅助疗效遥自噬是机体为了维持细胞内环境的稳定袁将侵入细胞内的病原微生物尧受损细胞器及待清除物质递送至溶酶体降解的过程遥M.tb 感染宿主以后袁机体将启动自噬程序袁最终完成对 M.tb 的清除遥 有研究表明他汀类药物尧维生素 D3尧依维莫司和宽缨酮等会增强自噬作用和促进吞噬体成熟来达到减少 M.tb的负荷咱13-15暂遥本研究显示袁狼毒乙素能够促进 M.tb 感染后的 RAW264.7 巨噬细胞巨噬细胞的自噬增强袁并且与药物的剂量性有关渊P约0.05冤袁因为自噬就是机体重要的先天免疫抗感染机制遥因此袁自噬增强能够促进巨噬细胞的杀菌机制遥 使用传统中药治疗结核病的思路是对机体免疫系统进行整体调节袁与现在提出的宿主导向的治疗策略渊HDT冤相同遥 寻找有效的中药单体成分与常规抗结核药物联合使用可以缩短治疗周期尧降低化学药物的耐药性等优点遥综上所述袁狼毒乙素通过诱导 RAW264.7 巨噬细胞的自噬袁来增强 RAW264.7 巨噬细胞清除 M.tb的能力遥狼毒乙素能够降低炎性细胞因子的水平袁且与剂量成明显负相关袁说明狼毒乙素具有抗炎作用袁可以减弱炎症细胞因子的释放遥参考文献咱1暂王晓君,李月华,易凤莲,等.19902017年中国结核病流行与控制情况咱J暂.中华流行病学杂志,2020,41(6):856轧860.咱2暂KAULG,KAPOORE,DASGUPTAA,et al.Management of multidrug-resistant tuberculosis in the 21st century咱J暂.Drugs of today:Medica鄄mentos de actualidad,2019,55(3):215轧224.咱3暂XiuyanHan,ChangmingChen,HongleiWang,et al.GlmU inhibitor fromthe roots of Euphorbia ebracteolata as an anti-tuberculosis agent咱J暂.RSC Adv,2022,12(28):18266轧18273.咱4暂王晓阳,康廷国.狼毒大戟萜类化学成分及抗肿瘤活性研究进展咱J暂.中华中医药学刊,2021,39(8):30轧35.咱5暂Huang Y,Lu 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