基于内源激素调控的木荷扦插生根研究.pdf

2023 年 6 月第 39 卷第 3 期27基于内源激素调控的木荷扦插生根研究*温汉平1陈家裕1钟雨庭2邹国岳2吴茗华3(1.紫金县生态公益林管理中心，广东 河源 517400；2.紫金县林业技术推广站，广东 河源 517400；3.华南农业大学，广东 广州 510642)摘要 以木荷 Schima superba 优树嫁接苗萌发嫩枝为插穗，分析了扦插生根过程中插穗解剖构造以及内源激素水平的变化。结果表明：普通木荷插穗（生根率 40%）无潜伏根原基，扦插 10 天时诱导产生不定根原始体，但插穗表观形态无明显改变，而扦插 20 天时产生不定根原基、茎基部明显愈伤化膨大，扦插 50 天不定根分化完成。与难生根基因型（生根率 80%）插穗中的 IAA 水平明显偏高，而 ZR、GA、ABA 无明显差异；扦插 20 天，插穗 IAA 较高，GA 偏低；扦插50 天，IAA、ABA 较高，而 ZR、GA 较低。在 0100 mg/L GA 合成抑制剂多效唑作用下，普通插穗生根率差异显著。其中，以 50 mg/L 多效唑处理下生根率最高，达 90.1%，较对照提升了 123.6%。研究认为，木荷属生根困难树种，内源性 IAA、GA 水平在不定根形成中起到关键作用，通过外源喷施多效唑能有效提高木荷生根能力，但鉴于 GA 在生根过程中的双重性作用，其施用浓度需控制在合适范围。关键词 木荷；不定根；内源激素；生长素；赤霉素中图分类号：S722.8文献标志码：A文章编号：2096-2053（2023）03-0027-07Study on Cutting Rooting Technology of Study on Cutting Rooting Technology of Schima superbaSchima superba Based on Based on Endogenous Hormone RegulationEndogenous Hormone RegulationWEN Hanping1CHEN Jiayu1ZHONG Yuting2ZOU Guoyue2WU Minghua3（1.Zijin Ecological Public Welfare Forest Management Center,Heyuan,Guangdong 517400,China;2.Zijin Forestry Technology Extension Station,Heyuan,Guangdong 514700,China;3.South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong 510642,China)Abstract The changes in anatomical structure and endogenous hormone level of cuttings in the process of rooting were analyzed by using the sprouted twigs of grafted seedlings of Schima superba as cuttings,to provide a theoretical reference for the construction of an efficient rooting technology system of S.superba.The results showed that there was no latent root primordium in general cuttings(rooting rate 40%)of S.superba.Adventitious root primordia were induced at 10 days of cutting,but there was no significant change in the apparent morphology of cuttings.Adventitious root primordia and stem base were significantly callused and expanded at 20 days of cutting,and adventitious root differentiation was completed at 50 days of cutting.Compared with the difficult rooting genotype(rooting rate 80%)was significantly higher,but there was no significant difference in ZR,GA,and ABA.Cutting 20 days,cuttings IAA higher,GA lower;Cutting 50 days,IAA,ABA higher,while ZR,GA*第一作者：温汉平（1974），男，高级工程师，主要从事主要从事森林资源培育、园林（乡村）绿化美化、古树名木保护、天然林生态修复与保护等研究，E-mail：。通信作者：陈家裕（1992），男，工程师，主要从事森林培育、天然林保护与修复等方面研究，E-mail：。林 业 与 环 境 科 学2023 年6 月第 39 卷第 3 期28lower.Under the effect of 0-100 mg/L GA synthesis inhibitor,the rooting rate of general cuttings was significantly different.Among them,the rooting rate was the highest under the treatment of 50 mg/L paclobutrazol,reaching 90.1%,which increased by 123.6%compared with the control.The results showed that the endogenous IAA and GA levels played a key role in the formation of adventitious roots in S.superba,which was difficult to root.Spraying exogenous paclobutrazol could effectively improve the rooting ability of S.superba,but because of the dual role of GA in the rooting process,its application concentration should be controlled in the appropriate range.Keywords Schima superba；adventitious root；endogenous hormone；auxin；gibberellic acid木荷 Schima superba 属山茶科 Theaceae 木荷属乔木，在我国福建、台湾、江西、广东、海南、广西、贵州等华南、西南地区均有广泛分布。木荷利用价值高，开发应用前景广阔，既是优良的绿化、用材树种，又是较好的耐火、防火树种。作为我国珍贵的用材树种，木荷干形通直，材质坚韧、结构细致、经久耐用，且易加工，是纺织工业和桥梁、船舶、车辆、建筑、农具等方面优良用材。木荷树皮、树叶含鞣质，可以提取单宁1-2。然而，目前我国木荷人工林经营管理粗放，林分质量普遍不高。木荷林分遗传分化差异较大，加之结实量大小年现象明显，种苗良种化严重不足3。为加快产业发展，必须解决良种匮乏的问题。木荷育种周期长，通过无性繁殖既能保持亲本优良性状，同时还能有效缩短良种选育进程。扦插是进行林木优良种质无性繁育利用最为经济、常用的方式。以往研究表明，木荷属无性繁殖困难的树种，扦插效果不稳定4-7。不定根诱导是无性育苗中的关键瓶颈，激素在植物不定根形成中起到至关重要的作用6-7。为此，本试验以木荷优树嫁接苗上所采穗条为繁殖材料，通过扦插育苗的方法，分析不定根诱导过程中插穗根茎解剖构造与内源激素水平的变化，以期揭示内源激素对木荷扦插生根的影响，为木荷高效扦插育苗技术体系构建提供参考。1材料与方法1.1试验材料选择干形通直、生长优势明显的成年优树采集穗条进行嫁接，待嫁接成活后移至苗圃进行管理。选择当年萌发的长 810 cm、生长健壮、无病虫害枝条为试验材料，叶片剪掉一半后在控制环境条件下，进行容器扦插育苗试验。1.2试验方法1.2.1不定根诱导 以高温高压灭菌消毒过的等体积比混匀的泥炭土、珍珠岩、蛭石为扦插育苗基质，500 mg/L ABT1 为生根剂，用滑石粉将生根剂调成匀浆状，然后采用速沾法，将插穗基部 1 cm 处沾上生根剂后直接插入育苗基质。扦插在人工模拟的环境中进行，温度 260.5，光照强度2 000 lx，光照时间 17 h/d，空气湿度 90%，扦插 50 d 后统计生根率。1.2.2不定根解剖构造观察 木荷扦插生根困难，经笔者长期试验统计，生根优树插穗株数通常不足扦插总株数的一半。为观察木荷扦插生根过程，以扦插生根率为 40%左右的优树插穗为试验材料，在扦插过程中每隔 10 天取出穗条，经流水冲洗干净后切下穗条 1 cm 长基部，然后进行 FAA 固定，用 30%100%酒精系列脱水后进行透蜡和包埋。切片机切片后，采用番红固绿对染方法制作切片，在显微镜下观察不定根发生，重复 3 次取样进行观察拍照。根据不定根形成过程中解剖构造观测结果，以扦插第 0（初始期）、20（愈伤期：根原基形成）、50（分化期：不定根形成）天为木荷不定根形成的 3 个关键时期，并在各时期分别取样分析根茎解剖构造变化。1.2.3内源激素水平测定 基因型对木荷优树嫁接苗穗条生根能力影响显著。在前期试验基础上，以筛选出的生根困难（DR，生根率 80%）基因型插穗为对比试验材料，于扦插后第 0、20、50 天取样测定内源激素水平的变化。使用仪器：美国安捷伦公司生产的 Agilent 1290 液相色谱仪、Agilent 6460C三重四极杆质谱仪和配电喷雾离子源，测定内源激素包括吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GAs）、脱落酸（ABA）和玉米素核苷（ZR），激素标准品为Sigma 公司生产，色谱纯级。色谱条件和质谱条29温汉平等：基于内源激素调控的木荷扦插生根研究件参照王会周等8的方法，在不同扦插时间分别取各基因型 410 株插穗基部 1 cm 长的根茎为测试样品，约 2 g，于液氮中研磨成粉末，分离上清液，过聚乙烯聚吡咯烷酮 PVPP 柱和二乙基氨基乙基交联葡聚糖凝胶（DEAESephadex A-25）柱净化，过 0.22 m 滤膜后检测，3 次生物学重复性取样进行测定。1.2.4外源生长调节剂促根处理 根据解剖构造与内源激素水平分析结果，以扦插生根率为 40%左右的优树插穗为试验材料，在生根处理 20 天后，参照前人研究方法9，以蒸馏水（0 mg/L 多效唑）为对照，25、50、75、100 mg/L 多效唑水溶液为试验处理进行插穗针叶喷施，每株喷施 5 mL，每隔 10 天喷施一次，连续喷施 3 次。于扦插50 天，取出插穗观察 GA 荧光免疫组化定位及内源激素水平、生根率变化。扦插生根环境条件同1.2.1。其中，GA 荧光免疫组化定位参照 Jirecek等10的方法进行观测。1.3数据处理本试验中各处理每个指标的统计观测结果均分别来源于 4 个重复，每重复 70 株苗。其中，500 mg L-1 ABT1 处理共设 12 重复，4 个重复用于 40%生根率优树插穗生根解剖构造观察；4 个重复用于 DR 基因型和 4 个重复用于 ER 基因型的内源激素水平观测。对 0100 mg/L 多效唑处理，各浓度处理设 12 个重复，每 4 重复分别用于 GA荧光免疫组化定位、内源激素水平及生根率观测。数据采用 SPSS19.0 统计分析软件进行单因素方差分析，用 LSD 法进行多重比较，t-test 进行两个处理间差异比较。2结果与分析2.1扦插生根解剖构造变化以木荷成年优树嫁接苗上当年萌发嫩枝为试验材料进行扦插，通过每扦插 10 天取样观察其生根解剖构造变化发现，木荷插穗无内生根原基（图 1A），在扦插 10 天时插穗外观无明显变化，但在维管形成层薄壁细胞中诱导出不定根原始体（图 1B，红色箭头所示）。扦插 20 天时插穗基部膨大，愈伤化明显，插穗中形成完整的根原基（图 1C），而扦插 50 天时不定根分化形成（图1D）。上述生根解剖构造变化结果表明，木荷插穗扦插处理第 20 和 50 天，可分别作为木荷扦插不注：A，扦插 0 天；B，扦插 10 天；C，扦插 20 天；D，扦插 50 天。比例尺：200 m。红色箭头示不定根。Note:A,cutting after 0 day;B,cutting after 10 days;C,cutting after 20 days;D,cutting after 50 days.Scale bars:200 m.Red arrows indicate adventitious root primordium.图 1木荷扦插生根过程中解剖构造变化Fig.1VariationsforanatomicalstructureduringcuttingrootinginS.superba定根形成两个关键时期。2.2内源激素水平变化内源激素在不定根形成与发育中起到关键调控作用8。以生根容易（ER）和生根困难（DR）基因型为研究对象，通过分析扦插生根过程中插穗中内源性生长素（IAA）、细胞分裂素（ZR）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GAs）水平变化发现，4 种激素在扦插初始材料中除 IAA 外，ZR、ABA和 GA 均无显著差异（图 2）。在扦插 20 天根原基形成期，ER 材料中 IAA 水平较高，GA 水平较低，而 ZR 和 ABA 无明显变化。在扦插 50 天不定根分化时，4 种激素水平均差异显著，其中 ER插穗中 IAA、ABA 水平高于 DR，而 ZR 和 GA 水平低于 DR。从扦插生根过程中 4 种激素水平变化趋势来看，ER 表现为：随着扦插时间延长，IAA为先上升后下降，ZR、GA 为逐渐下降，ABA 为逐渐上升；DR 则表现为：IAA 为先上升后下降，其变化趋势与 ER 一致，ZR 无明显变化，而 ABA逐渐下降、GA 逐渐上升，与 ER 插穗中 ABA 与GA 变化趋势相反。这说明，高水平 IAA、ABA，低水平 ZR、GA 利于插穗生根。而扦插 2050 天林 业 与 环 境 科 学2023 年6 月第 39 卷第 3 期30时，ER 和 DR 插穗中差异显著的 IAA、GA，则表明 IAA 与 GA 是影响木荷生根重要激素。2.3多效唑生根作用效果IAA 在不定根形成中核心调控作用是已公认的11，然而目前有关 GA 对不定根形成影响方面的研究尚鲜少见。为此，为进一步解析木荷扦插生根过程中 GA 的作用，参照前人方法9，采用 GA 生物合成抑制剂多效唑为促根剂在扦插 20天后喷施插穗叶片，分析多效唑对木荷插穗生根能力的影响。图 3 结果表明，插穗生根率与喷施多效唑浓度呈明显的先上升后下降的二次项关系（R2=0.98），表明多效唑的施用能显著提升扦插生根率，但需控制在适宜浓度范围。从不同浓度多效唑处理下，插穗中内源激素水平与生根率的相关性分析来看，内源性 IAA、ABA、GA 水平与生根率相关性明显，R2值为 0.781.00，而 ZR 与生根率相关性不明显，R2值仅为 0.30。其中，IAA与生根率为线性相关，而 ABA、GA 与生根率均呈二次项关系，这说明高水平 IAA 利于生根，而ABA 与 GA 需控制在中度水平，过高或过低的ABA 与 GA 水平将抑制插穗生根。IAA/GA 与生根率相关性较差（R2=0.30），说明对 IAA 和 GA而言，相较于单一激素的明显生根调控作用，激素间串扰性对生根能力的影响较小。为验证多效唑对内源性 GA 水平的影响，对多效唑处理下扦插 50 天插穗中 GA 进行了荧光免疫组织化学定位观察。从图 4 可以看出，未施用多效唑时，根茎横切面中可见明显的 GA 荧光定位（图 4A），细胞排列紊乱，不定根原始体发育困难（图 4B），而施用多效唑后，GA 荧光定位明注：不同小写、大写字母分别表示在=0.05 水平不同扦插生根时间和同一扦插时间两个生根处理间内源激素水平的差异显著性。Note:Diff erent lowercase and uppercase letters indicate signifi cant diff erences in endogenous hormone levels among diff erent cutting time and between rooting treatments within a cutting time at=0.05,respectively.图 2木荷不定根生根过程中内源激素水平变化Fig.2EndogenoushormonelevelsduringadventitiousrootinginS.superba31温汉平等：基于内源激素调控的木荷扦插生根研究dcabdy=-11.56x2+70.64x-20.90R2=0.98304050607080901001100255075100生根率生根率/%Rooting rate多效唑浓度多效唑浓度/(mgL-1)Paclobutrazol concentrationy=1.06x-19.22R2=0.882030405060708090100405060708090100110生根率生根率/%Rooting rateIAA 浓度浓度/(ngg-1)IAA concentrationy=-3.10 x2+52.68x-137.73R2=0.782030405060708090100468101214生根率生根率/%Rooting rateGA 浓度浓度/(ngg-1)GA concentrationy=-14.79x+157.96R2=0.38203040506070809010055.566.577.58生根率生根率/%Rooting rateZR浓度浓度/(ngg-1)ZR concentrationy=-0.10 x2+9.65x-135.13R2=1.002030405060708090100203040506070生根率生根率/%Rooting rateABA 浓度浓度/(ngg-1)ABA concentrationy=2.58x+35.85R2=0.3020304050607080901003579111315生根率生根率/%Rooting rateIAA/GA注：不同小写字母表示在=0.05 水平不同浓度多效唑处理间生根率的差异显著性。Note:Different lowercase letters indicate significant differences in rooting rate among different paclobutrazol treatments at=0.05.图 3多效唑对木荷插穗生根率及其与内源激素相关性影响Fig.3EffectsofpaclobutrazolonrootingrateandcorrelationbetweenrootingrateandendogenoushormoneinS.superba cuttingsy=-11.56x2+70.64x-20.90R2=0.98y=-3.10 x2+52.68x-137.73R2=0.78y=-0.10 x2+9.65x-135.13R2=1.00y=1.06x-19.22R2=0.88y=-14.79x+157.96R2=0.38y=2.58x+35.85R2=0.30林 业 与 环 境 科 学2023 年6 月第 39 卷第 3 期32显减少（图 4C），且细胞排列有序，不定根发育正常（图 4D）。这说明，多效唑对木荷插穗生根的促根性，主要与插穗中降低的 GA 水平有关。3结论与讨论从形态解剖学来看，林木生根有 3 种方式：由根原基生根、皮层内部产生不定根和愈伤组织生根12-14。产生不定根原基的组织很多，一般因植物种类而异。通常，多数根原基细胞在髓射线与形成层的交叉点上形成15。一般易生根的树种常有潜伏根原基，而不易生根的树种只能先诱导根原基或愈伤组织产生，然后再由此形成不定根，其需要时间较长，生根缓慢，而且这些根多数没有与维管束相连，成活困难16。本试验木荷插穗生根解剖构造表明，木荷插穗无潜伏根原基，不定根都是由维管形成层薄壁细胞诱生根原基直接发育形成。从本质上说，不定根发生与激素密切相关。内源激素作为植物与生俱来的一种次生(D)(A)(B)(C)注：AB，对照。A，荧光场；B，白光场。CD：50 mg/L 多效唑喷施处理。C，荧光场；D，白光场。比例尺：100 m。Note:A-B,control without paclobutrazol treatment.A,fluores-cence field;B,white-light field.C-D,spraying 50 mg/L paclobutrazol treatment.C,fluorescence field;D,white-light field.Scale bars:100 m.图 4多效唑处理下木荷生根插穗中 GA 荧光免疫组织化学定位Fig.4FluorescenceimmunohistochemicallocalizationofGAinS.superbarootingcuttingsunderpaclobutrazoltreatment代谢产物，在植物不定根形成中起到关键性的作用17-18。因此，探讨木荷扦插生根过程中内源激素水平变化，为构建高效木荷生根技术能提供可靠、科学的理论指导。目前确认的植物内源激素种类主要有生长素（吲哚乙酸）(indoleacetic acid,IAA)、赤霉素(gib-berellic acid,GA)、细胞分裂素(cytokinin,CTK)、乙烯(ethene,ETH)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、油菜素类固醇(brassinosteroids,BR)、多胺(poly-amine,PA)、茉莉酮酸(jasmonic acid,JA)、水杨酸(salicylic acid,SA)9 种。其中，IAA 是植物不定根发生中的一个关键因子，可直接作用于胞内组分而影响细胞反应19。而其它植物激素如：GA、ABA、CTK 等通过与 IAA 互作调控诱导根原基启动及不定根发育11。在本试验研究中，木荷扦插2050 天时，上升趋势明显的 IAA 水平及易生根插穗中较高水平的 IAA 均反映了 IAA 在木荷插穗生根中的核心调控作用。笔者认为，木荷扦插生根需要以 IAA 为主的内源激素达到一定较高水平，才能启动普通细胞进入向根原基细胞转变的脱分化和再分化进程。目前有关 IAA 在植物生根中的作用机理与信号途径已十分明确11,19，虽通过施用外源生长调节剂能有效调节内源激素水平的变化，但 IAA 见光易分解，化学性质不稳定，不易于在生产中作为生根剂直接进行使用20。GA 作为一种重要的植物激素，具有与 IAA类似的生长调节作用，能加速细胞的伸长与分裂，促进茎、叶的伸长生长21。传统研究认为，GA作为信号物质能调节蛋白酶活性，并能降低束缚态 IAA 的含量，抑制 IAA 氧化酶（IAAO）的活性，从而促进 IAA 的合成。在本研究中笔者发现，木荷插穗生根过程中内源性 GA 与 ABA 水平变化趋势相反，从 GA、ABA 生物合成代谢过程来看，这是符合客观事实的。但 GA 逐渐下降与 IAA 先上升后下降的不同变化趋势，暗示了 GA 对 IAA的合成存在双重作用，这与以往研究中认为的 GA对 IAA 合成的促进性是不同的，这可能与 GA 浓度有关。在不定根发育中，GA 水平较低时，主要作用是通过调节 IAA 水平来实现自身的生根促进性，这点与本试验中当施用 GA 合成抑制剂多效唑浓度超过 50 mg/L，达 100 mg/L 时，生根率与未使用多效唑处理无显著差异是相吻合的，因此GA 水平过低不利于生根，这与邓海勇等9研究结33温汉平等：基于内源激素调控的木荷扦插生根研究论是相似的。而当 GA 浓度过高时，作为信号物质，可能导致细胞中钙积累，代谢活动紊乱，活性氧增加，IAAO 活性增大，IAA 发生降解，IAA水平降低，不定根发生困难22。综上表明，木荷属生根困难树种，其不定根发生与内源性 IAA、GA 密切相关。通过外源喷施 50 mg/L 多效唑，能有效抑制内源性 GA 水平、增加 IAA 水平，生根能力显著改善。参考文献1 鲁成文,刘忠颖.木荷的经济价值及培育措施J.绿色科技,2021,23(5):74-76.2 熊静,虞木奎,成向荣,等.光照和氮磷供应比对木荷生长及化学计量特征的影响J.生态学报,2021,41(6):2140-2150.3 陶思晨,张笑颜,赵珍,等.不同城市化梯度下木荷(Schima superba)功能性状差异J.生态学报,2021,41(10):4099-4109.4 何绍斌.木荷扦插技术研究J.林业勘察设计,2015,(1):115-119；123.5 杨逸廷,钟少伟,石建军,等.木荷嫩枝扦插繁殖技术研究J.湖南林业科技,2017,44(4):31-33.6 陈杰连,陈一群,蓝燕群,等.木荷扦插不同生根剂处理效果分析J.林业与环境科学,2017,33(6):39-42.7 何春华.木荷繁殖技术研究进展J.绿色科技,2021,23(19):167-169.8 王会周,陈志东,石礼盛,等.湿地松不定根诱导中内源激素水平变化J.林业与环境科学,2022,38(2):96-101.9 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