基于镇静催眠作用的生半夏水煎液毒性研究.pdf

世界睡眠医学杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：国家自然科学基金项目（），山东省自然科学基金重大基础项目（），山东省中医药科技发展计划项目（）（）；山东省研究生教育优质课程（）（）作者简介：张艳（），女，博士，副教授，研究方向：中药复方作用机制及中药药性研究，：通信作者：刘西建（），男，博士，副教授，研究方向：方剂效用机制及针药结合研究，：睡眠实验医学 基于镇静催眠作用的生半夏水煎液毒性研究张艳杨?张亚楠刘西建（山东中医药大学中医学院，济南，；山东省委党校燕山校区卫生所，济南，）摘要目的：探讨不同剂量及煎煮时间的生半夏水煎液镇静催眠作用及急性、亚急性毒性。方法：观察小鼠自主活动次数、睡眠潜伏期、睡眠持续时间，探讨不同剂量及煎煮时间的生半夏水煎液镇静催眠作用，采用 最大给药量法探讨其急性毒性，连续 给药后，检测血清谷丙转氨酶（，），尿素氮（，）及病理组织，探讨其亚急性毒性。结果：与正常组比较，各给药组自主站立次数减少，睡眠潜伏期缩短，睡眠持续时间延长，差异有统计学意义（），以煎 中剂量效果最佳。急性毒性实验未见明显异常变化。亚急性毒性实验中，与正常组比较，生半夏煎 与煎 水煎液中、高剂量组 含量显著升高，差异有统计学意义（），升高呈剂量相关性。各给药组 含量均显著降低，差异有统计学意义（）；煎 比煎 同剂量组降低更明显，差异有统计学意义（）。结论：生半夏水煎液安神以 剂量效果最佳，符合吴鞠通“两安眠”之说，久煎有增效的趋势。生半夏水煎液无急性毒性，具有一定亚急性毒性，表现为肝肾毒性，肝损害呈剂量依赖性；肾损害无剂量相关性，但以中剂量最轻；久煎 未能降低肝肾毒性，认为与生半夏含有水溶性耐热的毒性成分有关，久煎 相对较好。关键词生半夏；镇静催眠；急性毒性；亚急性毒性；剂量；煎煮时间 ，（，；，）：，：，（），（），：，（），（），（）；，（）：，“（）”，；，；中图分类号：；文献标识码：半夏为天南星科植物半夏块茎，燥湿、化痰、安神，是治疗失眠常用药，在治疗失眠高频药物中排名第五 。研究表明，半夏具有镇静催眠作用 ，临床所用的各种炮制品中，以生半夏作用最佳 。而生 年 月第 卷第 期 ，世界睡眠医学杂志 半夏有毒，主要表现为刺激性，目前认为主要是由不溶于水的草酸钙和蛋白质组成的针状晶体引起，可其刺激性却可以通过充分煎煮去除 ，陆永辉等 研究也表明生半夏水煎液无急性毒性。但半夏治疗失眠一般需连续用药，目前仍缺乏基于镇静催眠作用的半夏水煎液亚急性毒性研究。根据我们前期的理论研究，半夏安神一般需用 以上才有安神良效，必要时可用生品，但建议先煎至少 。本文通过不同剂量、不同煎煮时间的生半夏水煎液镇静催眠作用及急性毒性、亚急性毒性的研究，以进一步明确生半夏安神的剂量范围、煎煮时间及其安全性。材料与方法 材料 动物 只 级 周龄昆明种小鼠，雌雄各半，体质量（），济南朋悦实验动物繁育有 限 公 司 提 供 动 物 许 可 证 号 （鲁）。本研究获得了山东中医药大学实验动物伦理委员会的批准，该方案符合国家实验动物伦理相关指导原则 ，于室温（），湿度 环境下饲养，自由饮水与进食。药物中药生半夏采购于郑州瑞龙制药股份有限公司，山东中医药大学中药鉴定室鉴定为天南星科植物半夏 （）干燥块茎。半夏生品用 倍体积冷水浸泡 ，加热煮沸，分别煎煮 、，减压低温浓缩成生药 药液，置于 冰箱备用。试剂与仪器 多聚甲醛（北京莱博科技有限公司，货号：）。戊巴比妥钠（北京普博斯生物科技有限公司，批号：），地西泮片（山东省信宜制药有限公司，批号：），临用前用蒸馏水配成 溶液使用。多功能小鼠自主活动记录仪（上海市欣软信息科技有限公司，型号：），全自动酶标仪（芬兰 公司，型号：），全自动高 速 冷 冻 离 心 机（湖 南 省 离 心 机 厂，型 号：），干式恒温器（杭州市爽盛仪器，型号：），自动组织脱水机（湖北省康强医疗器械有限公司，型号：），石蜡切片机（徕卡显微系统有限公司，型号：），显微镜（徕卡显微系统有限公司，型号：）。镇静催眠实验 动物分组 只小鼠，随机数字表法分成 组，每组 只，雌雄各半。第 组为正常组，第 组分别为生半夏煎 水煎液低、中、高剂量组、生半夏煎 水煎液低、中、高剂量，第 组地西泮组。给药正常组小鼠灌胃给予生理盐水，各给药组分别灌胃给予生半夏煎 低、中、高剂量和煎 低、中、高剂量水煎液（根据 成人临床剂量 、换算）、，第 组地西泮组，按剂量 灌胃地西泮水溶液，次 ，连续 。检测指标自主站立次数：末次给药 后，置各组小鼠于自主活动记录仪中，记录 内自主站立次数。协同阈上剂量戊巴比妥钠对睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响：各组小鼠末次给药 后，按 腹腔注射戊巴比妥钠溶液，记录睡眠潜伏期与睡眠持续时间。急性毒性 动物分组将 只小鼠随机分为 组，生半夏煎 水煎液组、生半夏煎 水煎液组和正常组，每组 只，雌雄各半。给药采用 天最大给药量实验，禁食 后，各给药组灌胃给予 煎 和煎 的生半夏水煎液，正常组给予等体积生理盐水 。观察指标密切观察给药后小鼠的精神状态、外部反应、皮毛色泽、活动、呼吸、瞳孔变化、眼球凸出、眼睑下垂、进食、饮水情况、分泌物、排泄物等毒性反应和死亡情况。第 天起，每天观察 次，连续观察 ，并记录小鼠每日体质量。如果有小鼠出现死亡，立刻解剖，肉眼观察脑、心脏、肺脏、肝脏、脾、肾脏、胃、大肠和小肠等脏器的变化。后，将各组小鼠脱颈处死后进行解剖，并按上述方法肉眼观察主要脏器大体病理变化。亚急性毒性 动物分组 只小鼠随机分为 组，每组 只，雌雄各半。第 组：正常组，第 组为生半夏煎 水煎液低、中、高剂量组、生半夏煎 水煎液低、中、高剂量组。给药各组给药同生半夏镇静催眠实验给药，次 ，连续 。观察与检测指标实验期间，每天观察并记录小鼠一般状况和体质量。第 灌胃后，禁食 ，于第 摘眼球取血，在正常室温下静置 后，以 获取血清，法检测血清 、含量。冰台上取肝、肾、胃，甲醛固定后，常规石蜡包埋，切片，染色，普通光镜下观察。统计学方法采用 统计软件对数 世界睡眠医学杂志 年 月第 卷第 期 ，据进行分析，计量资料采用均值 标准差（珋 ）表示，进行 检验；计数资料采用率（）表示，进行 检验，以 为差异有统计学意义。结果 镇静催眠实验结果 对小鼠自主站立次数的影响连续给药 后，与正常组比较，生半夏煎 水煎液各剂量组、煎 高剂组和地西泮组小鼠自主站立次数显著减少，差异有统计学意义（），其余各给药组站立次数减少显著，差异有统计学意义（）。与地西泮组比较，各给药组小鼠自主站立次数差异无统计学意义。见表 。对协同阈上剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期与睡眠持续时间的影响连续给药 后，与正常组比较，各给药组睡眠潜伏期显著缩短，睡眠持续时间显著延长，差异有统计学意义（或 ）；与地西泮组比较，生半夏水煎液煎 及煎 各剂量组睡眠潜伏期及睡眠持续时间差异无显著性。同剂量不同煎煮时间的各给药组之间睡眠潜伏期和睡眠持续时间虽然差异无显著性，但煎 的水煎液比煎 的同剂量组睡眠潜伏期减少趋势、睡眠持续时间延长。煎煮 的各给药组之间比较，以中剂量组睡眠潜伏期最短，睡眠持续时间最长。各给药组中，生半夏煎 水煎液中剂量组睡眠潜伏期最短，睡眠持续时间最长。见表 。急性毒性结果给药 后和连续 内，小鼠的精神状态、对外反应、皮毛颜色与光泽、呼吸、活动、进食、饮水情况、分泌物、排泄物等均未发现异常变化，瞳孔正常、眼球无凸出、眼睑无下垂。给药后小鼠没有出现死亡。给药前各组体质量差异无统计学意义。给药 和 ，生半夏煎 水煎液组体质量显著高于正常组，差异有统计学意义（），其余 则各组体质量差异无统计学意义，见图 。后，将小鼠全部脱颈处死后即刻解剖，肉眼观察各主要脏器，未见异常变化。图 小鼠急性毒性体质量变化注：与正常组比较，；正常组，生半夏煎 水煎液组，生半夏煎 水煎液组 亚急性毒性结果 一般情况及体质量连续给药 后，小鼠的活动、进食、饮水、排泄物、分泌物均未见异常。第 周时，与正常组比较，生半夏煎 水煎液中剂量组体质量显著降低，差异有统计学意义（），生半夏煎 水煎液高剂量组、煎 中高剂量组体质量降低明显，差异有统计学意义（）。见图 。图 小鼠亚急性毒性体质量变化注：与正常组比较，；正常组，生半夏煎 水煎液低剂量组，生半夏煎 水煎液中剂量组，生半夏煎 水煎液高剂量组，生半夏煎 水煎液低剂量组，生半夏煎 水煎液中剂量组，生半夏煎 水煎液高剂量组，地西泮组表 生半夏水煎液对小鼠自主站立次数、睡眠潜伏时间及睡眠持续时间的影响（珋 ）组别站立次数（次）睡眠潜伏期（）睡眠持续时间（）正常组 生半夏煎 水煎液低剂量组 生半夏煎 水煎液中剂量组 生半夏煎 水煎液高剂量组 生半夏煎 水煎液低剂量组 生半夏煎 水煎液中剂量组 生半夏煎 水煎液高剂量组 地西泮 注：与正常组比较，年 月第 卷第 期 ，世界睡眠医学杂志 表 生半夏水煎液对小鼠血清 、含量影响组别 （）（）正常组（生理盐水）生半夏水煎液（）低剂量组 生半夏水煎液（）中剂量组 生半夏水煎液（）高剂量组 生半夏水煎液（）低剂量组 生半夏水煎液（）中剂量组 生半夏水煎液（）高剂量组 注：与正常组比较，；与生半夏煎 水煎液中剂量组比较，；与生半夏煎 水煎液高剂量组比较，；与生半夏煎 水煎液低剂量组比较，；与生半夏煎 水煎液高剂量组比较，血清 、含量检测连续给药 后，与正常组比较，生半夏煎 水煎液与煎 中、高剂量组 含量升高，差异有统计学意义（）；相同的煎煮时间各给药组之间比较，升高呈现剂量相关性，剂量愈大，越高；相同剂量不同煎煮时间的各组之间比较，煎 中高剂量组升高更明显，差异有统计学意义（）。各给药组 的含量降低，差异有统计学意义（）；煎 比煎 同剂量组 的降低更明显，差异有统计学意义（或 ）；煎 中剂量组 相对其他给药组数值更接近正常组。见表 。肝、肾、胃病理形态学观察连续给药 后，肝脏病理学检查显示，煎 水煎液低剂量组肝小叶结构不清晰，部分肝细胞呈现疏松肿胀，细胞明显水肿；部分肝细胞脂肪变性，体积增大，胞浆内有较多中小型空泡，细胞核仍居中，有较多双核肝细胞和渗出性炎细胞。生半夏煎 水煎液中剂量组肝小叶结构清晰，大部分肝细胞脂肪变性，细胞体积增大，细胞质中有较多小空泡，细胞核仍在中央。生半夏煎 水煎液高剂量组肝小叶结构清晰可见，部分肝细胞脂肪变性，体积变大，胞浆内小型空泡较多，双核肝细胞较多。生半夏煎 水煎液各剂量组均可见大部分肝细胞脂肪变性而且体积增大，核仍居中；低剂量组和中剂量组的肝小叶结构清楚可见，胞浆内存在较多大小不等的空泡，肝细胞双核和渗出性炎细胞；低剂量组个别肝细胞细胞核溶解消失；高剂量组肝小叶结构不清，细胞质有较多小空泡，部分肝细胞坏死，细胞核溶解消失。见图。连续给药 后，肾脏病理学检查显示，煎 水煎液低剂量组肾小管管腔变窄消失，管腔不规则，肾小管上皮细胞脂肪变性，体积增大，细胞质中有较多大小不等空泡；煎 水煎液中剂量组少数肾小管上皮细胞呈现脂肪变性，体积增大，细胞质中有多图 生半夏煎 与煎 水煎液小鼠亚急性毒性肝脏病理学变化（染色，）注：生半夏煎 水煎液低剂量组，生半夏煎 水煎液中剂量组，生半夏煎 水煎液高剂量组，生半夏煎 水煎液低剂量组，生半夏煎 水煎液中剂量组，生半夏煎 水煎液高剂量组个大小不等的空泡，肾间质毛细血管扩张和充血；煎水煎液高剂量组未见明显异常改变。煎 水煎液各剂量组均可见肾小管管腔变窄消失，管腔不规则；低剂量组与高剂量组均有较少肾小管上皮细胞体积变大，脂肪变性；中剂组与高剂组胞浆可见空泡多个且大小不等，肾间质毛细血管扩张充血；低剂量组细胞质中较多大小不等空泡；中剂量组则见到部分肾小管上皮细胞呈脂肪变性，体积增大。见图 。连续给药 后，胃病理形态学未见异常改变，胃黏膜完整，胃黏膜腺管单柱状，排列整齐，壁细胞与主细胞分界清晰，固有层胃腺排列紧密有序，无炎性细胞，黏膜下层无水肿。讨论半夏辛温有毒，乃天南星科植物半夏的块茎入药，始载于汉代 礼记月令：“五月半夏生，盖当夏之半也，故名。”半夏虽非传统安神药，但在古代文献 古今医鉴 冷庐医话 识小录 中均有半夏治疗失眠记载，为诸多医家喜用，实为治疗失眠的高 世界睡眠医学杂志 年 月第 卷第 期 ，图 生半夏煎 与煎 水煎液小鼠亚急性毒性肾脏病理学变化（染色，）注：生半夏煎 水煎液低剂量组，生半夏煎 水煎液中剂量组，生半夏煎 水煎液高剂量组，生半夏煎 水煎液低剂量组，生半夏煎 水煎液中剂量组，生半夏煎 水煎液高剂量组频中药 ，在半夏炮制品中，尤以生半夏镇静催眠作用最佳 。虽半夏有毒，主要表现为刺激性，但始自医圣张仲景，历代医家也不乏擅长使用并主张使用生半夏者 ，而且研究报道其刺激性可通过充分煎煮去除 。鉴于此，本文对半夏的镇静催眠作用、急性毒性和亚急性毒性进行了研究。药物使用须达到一定剂量方能起效，至于半夏安神的有效剂量，自清朝名医吴鞠通以来，就有“二两安眠”之说，我们的研究结果恰恰证实了这一结论的正确性。实验表明，生半夏水煎液中剂量 镇静催眠效果最好，该剂量约合 成人剂量为 ，折合古代剂量即为二两，该结果与文献 较为一致。但与文献报道不同的是，本结果表明，煎 与煎同剂量组比较，睡眠潜伏期减少、睡眠持续时间延长，提示久煎具有一定增效的趋势。半夏安神效果较好，但毕竟有毒，雷公炮炙论 有记载：“半夏，上有隙涎，令人气逆，肝气怒满”。本草新编 载：“半夏燥气之药，再耗肾中之气，气一耗，则火动水燥，不生精而生痰，势所必至，不特无益，反害之矣”。毒理学研究也表明半夏能导致机体主要靶器官毒性 ，因此本文同时就其安全性进行了研究。急性毒性研究采用 最大给药量实验，按 剂量灌胃小鼠给药（约合 成人剂量 ），虽然给药 、，生半夏水煎液 组体质量高于正常组，均有显著性差异，但 体质量并无差异。此外，小鼠一般状况良好，肉眼没有发现肝、肾、心、脑、肺、脾、胃、大小肠、膀胱等主要脏器有异常病理变化，因此认为生半夏水煎液无急性毒性。虽然这不同于张丽美等 的报道，即小鼠单次灌胃 生半夏水提组分 后，出现肝功能 、升高并持续 有所不同，但与陆永辉等 报道基本一致，没有肝脏的急性损害。本文推测可能本实验剂量条件下生半夏造成的肝功能损害在短期内有恢复，但仍需通过生化指标及病理检测加以验证。鉴于半夏治疗失眠往往需要长期用药和常用汤剂的事实，本实验还采用水煎剂，连续 天灌胃给药，探讨了生半夏的亚急性毒性，结果与靳晓琪等 提出的通常大剂量会导致肝损害一致，这也与严晓莺等 连续 灌胃小鼠 、生半夏水煎液引起的肝毒性结果相似。本实验中，低剂量（）、中剂量（）、高剂量（）约合 成人 、，均属于大剂量用药，超过了临床正常剂量范围，连续给药 均显示肝毒性。结果显示生半夏煎 与煎 水煎液中、高剂量组 含量显著升高，病理检查可见脂肪变性、胞浆空泡、肝细胞双核，提示具有肝毒性，此外，上述 组小鼠体质量 周时也曾出现降低，本文认为，它与肝损害也并非无关；相同煎煮时间的各给药组之间比较，升高呈现剂量相关性，剂量愈大，越高，提示肝损害程度与剂量相关 ；尽管低剂量组（，约合 成人 ）没有显著升高，但病理检查显示脂肪变性、细胞水肿、细胞双核及炎细胞的肝损害改变。相同剂量不同煎煮时间的各组之间比较，煎 比煎 中高剂量组 升高更明显，差异极显著，说明久煎并未起到降低肝损害的作用。目前研究发现，半夏凝集素是肝毒性的主要物质基础，能激活核因子 信号通路促进炎症介质释放导致炎症；同时诱导细胞产生大量活性氧（，）从而发生氧化应激损伤导致肝毒性；网络药理学则发现其机制可能与作用于 、等靶点，途径、蛋白聚糖辛聚糖介导的信号通路、胰岛素途径等有关，但需进一步的实验验证 。本实验中，长期给药 后，各剂量均有一定肾毒性，这与严晓莺等 给药 出现肾毒性的结果基本一致。各给药组 含量降低，差异极显著，病理检测也显示肾损害，肾小管管腔变窄甚至消失，肾小管上皮细胞呈现脂肪变性，胞浆空泡，肾间质毛细血管扩张充血；而且煎 明显低于煎 同剂量组，表明既使长时间煎煮也不能降低肾损害；与其他给药组比较，煎 中剂量组 值接近正（下接第 页）世界睡眠医学杂志 年 月第 卷第 期 ，国妇幼健康研究，（）：刘寒静，赵金龙，程桂芹，等 产后抑郁的危险因素及正念减压疗法对产妇认知和 评分的影响 中国妇幼保健，（）：马海燕，滕红华，蒙艺元，等 产后抑郁影响因素 大众科技，（）：，魏晓薇，李强，翟宏，等 产后抑郁的社会心理影响因素：基于产后抑郁的认知行为模型 心理技术与应用，（）：刘璐，许子华，徐小青，等 高龄产妇产后抑郁影响因素的质性研究 中国现代医生，（）：田立红，丁承青，宋南南 分析细节化护理干预在改善产妇睡眠状况、负性情绪及减少产后出血中的作用 世界睡眠医学杂志，（）：廖小梅，伍志虹 综合护理干预改善产妇睡眠质量和产后出血的效果观察 世界睡眠医学杂志，（）：李慧，陈丽，柳秋实，等 二胎产妇产后抑郁现状及影响因素分析 中国妇幼保健，（）：余秀钦 综合护理干预对产妇睡眠质量和产后出血的影响 世界睡眠医学杂志，（）：，廖月红 妇产护理干预对产妇睡眠质量及产后出血的影响 世界睡眠医学杂志，（）：刘丹 轻度产后抑郁介入的个案工作实务研究 吉安：井冈山大学，孙颖 细节化护理对产妇睡眠状况、负性情绪的影响研究 实用妇科内分泌（连续型电子期刊），（）：杨乐，李永佳，杨晶晶 产后抑郁影响因素与健康护理策略研究进展 全科护理，（）：田丽映 中药足浴对剖宫产产妇产后康复的影响 中国民间疗法，（）：徐灿娟 睡眠护理干预对初产妇产后睡眠质量和抑郁的影响 世界睡眠医学杂志，（）：程絆恒，吴莲芝，王高华 新产程标准下产后抑郁倾向的影响因素 武汉大学学报：医学版：段海娜 护理干预对产妇的睡眠质量及产后出血的影响研究 世界睡眠医学杂志，（）：赵晓英 护理干预在改善产妇睡眠质量及减少产后出血的效果分析 世界睡眠医学杂志，（）：丁云 住院产妇睡眠质量的相关影响因素与护理进展 护理与康复，（）：葛军，夏天，张帅，等 细节化护理干预改善产妇睡眠状况、负性情绪及减少产后出血量的效果观察 世界睡眠医学杂志，（）：（上接第 页）常组，说明煎 中剂量造成的肾损害相对较小。本实验胃组织病理检测未发现异常，认为长期应用生半夏水煎液不会造成胃损伤。综上所述，各剂量生半夏（折合 成人约 ）均有安神作用，以中剂量效果最佳，约相当于 成人约 。生半夏水煎液无急性毒性。长期用药无胃损害，但存在肝肾毒性，肝损害程度与剂量呈相关性；中剂量造成的肾损害相对较小，久煎 未能起到降低肝肾损害的作用，因此认为久煎 即可，久煎未能降低毒性则可能与半夏含有的水溶性耐热毒性成分有关。因此，生半夏安神最佳剂量为 ，煎煮 ，不宜长期用药。利益冲突声明：无。参考文献 李晓东 基于数据挖掘失眠处方用药规律的研究 太原：山西中医药大学，：，：方媚媚，林思思，袁拯忠 不同半夏炮制品对小鼠镇静作用的比较 医学研究杂志，（）：，（）：陆永辉，王丽，黄幼异，等 半夏不同组分小鼠急性毒性的比较研究 中国药物警戒，（）：张艳 论半夏安神治失眠 西部中医药，（）：国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会 实验动物：福利伦理审查指南 宋咏梅，崔利锐，李军伟 古代失眠方药的文献分析 山东中医药大学学报，（）：苏萍，杨雪梅，肖林榕 经方治疗失眠方药的统计分析 福建中医学院学报，（）：王苗，李倩，周钰，等 中医治疗失眠医案用药方剂计量学分析 中华中医药杂志，（）：潘会朝，郭富礼 中药汤剂当用生半夏 时珍国医国药，（）：刘云 学习仲景重用生半夏的体会 江苏中医杂志，（）：丁学成 临床运用生半夏初探 中医药研究，（）：向家华 浅谈中药生半夏的临床合理应用 中医临床研究，（）：王婷婷，王芮，杨伟丽，等 六味安神中药对小鼠镇静催眠作用影响的研究 河北中医药学报，（）：黄凤英，高健美，龚其海 半夏药理作用及其毒性研究进展 天然产物研究与开发，（）：张丽美，鲍志烨，黄幼异，等 半夏水提组分对小鼠肝毒性“量时 毒”关系研究 中国药物警戒，（）：靳晓琪，黄传奇，张耕 半夏的毒性物质基础及其炮制解毒机制 时珍国医国药，（）：严晓莺，陈巨鹏，董菊，等 中药生半夏水煎液的毒性研究 中医药信息，（）：李浩然，李维英，吴宏?，等 基于分子对接与数据挖掘探讨生姜解半夏毒的相关机制 世界中医药，（）：