抗原修复方法在免疫组织化学染色中的应用及研究进展.pdf

292本期策划实用医技杂志2 0 2 3年4月第30 卷第4期Journal of Practical Medical Techniques，A p r i l 2 0 2 3，Vo l.30,No.4编者按：免疫组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，具有特异性强，细胞水平定位准确、简便、快速、鲜明等优点，应用日益广泛，已成为现代研究生物和医学的重要手段之一。本期重点对免疫组织化学检测中的抗原修复方法进行系统性回顾并对新的应用进行综合论述，研究影响抗原修复相关因素及最新应用进展，以期找到更好的抗原修复方案。本刊编辑部抗原修复方法在免疫组织化学染色中的应用及研究进展李碧奇韦康来广西医科大学附属第二医院病理科，南宁530 0 0 0【摘要】免疫组织化学染色作为目前应用最广泛,技术相对最成熟的病理辅助诊断手段,对疾病诊断、预后判断、用药指导具有非常重要的作用。随着精准医疗的推进，精准病理诊断对免疫组织化学染色提出了越来越高的要求，抗原修复作为免疫组织化学检测中关键的一步，近年来发展迅速，相关研究越来越成熟，应用也越来越广泛，在修复方式、修复试剂、修复应用上出现大量深入研究，使得抗原回收的稳定性和回收率得到大幅的提高，本文将对抗原修复进行系统性回顾并对新的应用进行综合论述。【关键词】石蜡包埋；免疫组织化学；抗原修复；回顾性研究基金项目：广西自然科学基金项目（2 0 2 2 GXNSFAA035496)D0I:10.19522/ki.1671-5098.2023.04.01618世纪末德国学者FerdinandBlum发现了甲醛固定组织的功能,随后甲醛固定的石蜡组织成为病理组织样本的经典制备方法1,即中性甲醛固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin embedded，FFPE)样本,其是指人或动物组织或细胞经甲醛固定并进行石蜡包埋的样本,是病理技术中最常见的样本类型,也是长期保存病理标本的标准方法2 ,可用于病理形态学观察及蛋白、基因等方面的检测。然而由于这种固定过程中，甲醛可与多种蛋白质氨基酸残基发生反应或交联,形成亚甲基桥联，把抗原决定簇封闭起来，导致在进行免疫组织化学染色时抗原蛋白检测信号降低甚至假阴性情况发生3。1991年Shi等4 用含有金属盐的多种溶液微波加热,用于恢复甲醛固定、石蜡包埋组织的免疫反应性，这种把甲醛固定、石蜡包埋的组织切片，在进行免疫组织化学染色前利用化学试剂（酶)或加热解开交联作用，重新暴露被遮蔽的抗原决定簇的过程称为“抗原修复”。由于大幅提高了FFPE样本免疫组织化学检测的抗原回收率有人将该研究成果定义为免疫组织化学发展的分水岭技术5。随着精准诊断的不断推进,临床对病理诊断的要求也越来越高,免疫组织化学作为应用最广泛，技术相对最成熟的病理辅助诊断手段,对疾病诊断、预后、用药起到非常重要的作用6-7 ,而抗原修复作为免疫组织化学检测中关键的一步，近年来发展也非常迅速，在修复方式、修复试剂、修复应用上出现大量的深入研究，抗原回收的稳定性和回收率均得到较大程度的提高。本文将对抗原修复进行系统性回顾并对新的应用进行综合论述。目前抗原修复方法主要有化学法的酶修复(en-zyme antigen retrieval,EAR）和物理法热修复(heat-induced antigen retrieval，H I A R),酶修复采用一定实用医技杂志2 0 2 3年4月第30 卷第4期Journal of Practical Medical Techniques，A p r i l 2 0 2 3，Vo l.30,No.4293浓度蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等)在一定温度、pH等条件下对组织切片进行消化，达到重新断开桥联、暴露抗原决定簇的作用；而热修复则是采用不同的加热工具，如：微波炉、高压锅、水浴箱、电磁炉、修复仪等配合使用不同的抗原修复液，如pH值6.0 的柠檬酸、pH值8.0 的乙二胺四乙酸（EDTA）、p H 值9.0 的Tris-EDTA等修复液加热处理石蜡切片，达到重新断开桥联、暴露抗原决定簇的目的。一直以来都有学者对影响抗原修复相关因素进行研究，试图找出更好、更利于工作开展的最佳修复方案。1抗原热修复影响因素研究进展1.1pH值：Shi等8 使用7 种修复液，并设置1 10pH值范围,用于研究不同pH值分别对核、膜、质表达指标在FFPE标本的抗原回收情况,发现pH89的碱性修复液适用于大多数抗原修复。而马秀利等9 也做了类似研究，在修复温度为95时、修复时间为15min和30 min，分别采用pH值为6.0、7.0、8.0、9.0 的修复液，进行MLH1、M SH 2、M SH 6、PD-1、PD-L1、K i-6 7 修复效果对比,结果同样提示这些指标在偏碱性的修复液中阳性表达效果最佳。王璐10 ,蔡俊杰等11,李梅等12 研究均支持碱性修复液整体修复效果较好的结论。这些研究结果提示我们在临床实际工作中使用手工法做批量无差别修复时选择pH值9.0 的碱性修复液整体效果更好。1.2修复温度：George等13 的研究小组使用pH值6.0柠檬酸和pH值9.0 Tris-EDTA分别做2 0 min和45min水煮修复，对比4种不同修复方式时，发现在97、p H 9.0 T r is-ED T A 修复45min的方法可以成功回收组织中的大部分抗原；同时他们认为在使用pH值9.0 Tris-EDTA修复液时温度超过97 不可取,虽然通过更高的温度可以缩短修复时间,增加修复效率，但这可能增加胞核和结缔组织的非特异性着色概率。李绍刚等14 在对ER、PR、C-e r b B-2 使用pH值9.0 的修复液对比高压和微波加热修复的效果时发现这3个指标在高温高压碱性修复条件下抗原回收率更高。马秀利等9,蔡俊杰等1,贺占国等15 研究结果也有类似结论,表明高温高压碱性修复条件为相对理想的修复条件。虽然高温高压强碱的高强度修复方法,可能对一些困难修复的组织比较好，对一般组织的修复也起到缩短时间的作用，但是高强度的修复可能会破坏组织，导致脱片、褶皱、背景高等制片问题13,16 17 。1.3修复时间：虽然持续作用时间是影响抗原修复重要的因素之一，但温度的使用大多依据修复方式、修复液类型不同而选择不同，而实验室常见的pH值6.0 的柠檬酸修复液一般使用12 1高温高压修复，在高压锅喷气后计时3min,关火后焖10 min的时间组合。使用pH值9.0 Tris-EDTA修复液一般采用97 微开水煮2 0 min，焖10 min的时间组合修复。最佳修复方案是相对的，不同抗原有其最佳修复条件。影响抗原修复的时间、温度、pH值、压力之间的关系可以概括为：抗原修复的时间与温度、压力呈反比关系;pH值9.0 的EDTA修复液修复能力 pH值6.0 的柠檬酸修复液，修复液强度越强,所需修复温度、压力和时间越少。1.4其他影响抗原修复因素：以上介绍的是抗原修复里常见影响因素及其使用效果,随着抗原修复的广泛深人研究，一些学者开始尝试以外的修复研究,王晶等18 对比复合底铝压力锅和不锈钢压力锅作为修复工具的抗原回收率对比试验，结果显示Ki-67在复合铝底压力锅的抗原表达率仅为7 6%，不锈钢压力锅该指标的表达率达到9 6%，表明不锈钢压力锅修复效果明显优于复合铝底压力锅，其认为在使用电磁炉作为加热工具时，不锈钢锅比复合铝底高压锅的加热效率更高，加热更均匀。丰平等19 利用丙三醇的沸点高达12 0 的特点，使用50%的丙三醇修复2 0 min与pH值6.0 的柠檬酸修复2 0 min对比实验，结果显示丙三醇的修复效果优于柠檬酸。在针对疑难抗原修复的案例中，单纯的热修复或单纯的酶修复抗原回收效果都不理想时，有学者开始考虑使用组合修复方案,取得比较好的结果。如骨、软骨等易脱片的组织使用常规的高温修复方式通常达不到理想效果，表现为修复强度足够时，脱片较严重，而为了保证不脱片，修复强度又不足的现象。为此,张富军等2 0 尝试先应用10 mol/L尿素37 修复2 0 min,后应用复合酶37 修复2 0 min的组合修复方案，结果显示抗原均充分暴露，定位准确、背景低。为不能采用热修复的骨、软骨组织的等容易脱片的组织提供有效修复方案。陈余朋等2 1 应用单纯酶、单纯热修复以及混合柠檬酸6.0+胰酶等9种修复方式对IV胶原蛋白进行免疫组织化学染色对比，结果表明IV型胶原蛋白在混合柠檬酸6.0+胰酶修复中修复效果最好。祝亚猛等2 2 也做了同样的研究，他们对294比了MLH1指标在0.0 1%枸橡酸修复液于微波炉中9 6 处理15min的组合修复与0.1%胰酶室温消化组织切片15min单纯修复效果，结果显示组合修复效果比单纯酶修复效果好。这些研究结果提示我们在疑难抗原修复案例选择修复方案时提供思路。同时为未来提高抗原回收率的研究上提供了方向。在抗原修复的研究里有两个热门方向，一个是抗原修复影响因素上的研究，另一个就是抗原修复应用上的研究2抗原热修复应用研究的进展2.1抗原修复在全自动免疫组织化学平台的应用：近年病理技术发展非常快速，全自动免疫组织化学染色平台也越来越普及，这些自动化平台使用独立控温的加热模块,可以实现单项0 10 0 的自由控温修复，独立控温系统与自由选择修复液的组合可满足针对不同抗原的个性化修复方案需求，从而达到提高抗原回收率的目的。与人工操作相比，全自动免疫组织化学机染色降低了人为操作误差，提高了实验的精密度，既提高了工作效率，又保证了操作准确性2 3。但受限于修复压力和温度,全自动免疫组织化学平台在高原地区的使用中存在组织抗原修复不足的现象，因此在高原地区应选用具有低压加热功能的全自动免疫组织化学染色平台16 2.2抗原修复在多重免疫荧光染色中的应用：应用多重免疫化学染色技术研究肿瘤微环境越来越广泛，多重免疫组织化学/免疫荧光已成为最具应用前景的技术2 4。抗原修复作为影响多重免疫化学染色的关键技术，其修复效果直接影响多重免疫化学染色效果。在进行主流的多重免疫组织化学染色时，每增加一种抗体染色时就需要增加一次抗原修复，反复多次重复抗原修复后，组织切片上阳性信号会出现衰减、丢失以及脱片等问题发生。为了在脱片和抗原修复效果上取得平衡,许特等2 5 通过研究对比发现使用滤纸夹层-蒸蛋器的抗原修复辅助装置，缩小了液体在组织切片表面可流动的空间和力度，降低水分子在加热时对组织切片的冲击力，与柠康酐(pH=7.5)修复液的组合取得较好多重免疫化学染色效果。而在多重免疫荧光染色应用中，范瑾瑾等2 6 认为在pH6.0枸橡酸缓冲液适合于胞质抗原的修复；而pH8.0的EDTA缓冲液则适合于核抗原修复，因此需要根据抗原属性来选择不同pH值抗原修复液来获得最佳的多重荧光染色实用医技杂志2 0 2 3年4月第30 卷第4期Journal ofPracticalMedical Techniques，A p r i l 2 0 2 3，Vo l.30 No.4抗原修复除了提高FFPE样本免疫化学染色的抗原回收率的应用外，还可以在很多方面的技术应用上发挥效果。2.3抗原修复在提高被损坏组织苏木精-伊红(HE)染色质量上的应用：HE染色是病理诊断的基础手段,其染色效果会影响病理诊断质量，但临床上经常会遇到由于固定、脱水不良导致HE染色效果不理想的情况发生，有学者把抗原修复应用在由于固定、脱水不良等被损坏组织导致HE染色后出现严重的细胞核固缩现象,造成病理诊断和分型困难的修复上。陈余朋等2 7 通过使用pH值6.0 的柠檬酸高压修复由于前处理不当导致细胞核固缩的淋巴瘤样本，结果显示HE染色的优良率提高至87.5%，对淋巴瘤核固缩的损坏有较好的修复效果。虽然此类研究的数据不多，修复的机制尚不太明确，但或可在实际工作中对损坏的病理样本修复提供参考。2.4抗原修复在乙醇固定的免疫细胞化学染色(im-munocytochemistry,ICC)样本的应用：众所周知,抗原修复只针对FFPE标本，用于打开因甲醛在组织固定时形成的亚甲基桥联，从而重新暴露抗原决定簇的一种技术应用。但有研究表明,用乙醇固定的ICC也可以在无抗原修复干预下取得免疫染色成功。Cizkova等2 8 通过应用pH值6.0 的柠檬酸对乙醇固定甲状腺患者的细胞样本进行热修复，在抗原表达率一致的前提下，修复后的样本可以提高一抗的稀释度,且背景更低。但相关研究还很初级,研究资料也不多，标准化操作仍需更多的研究数据支持，期待在未来发展中得到更好、更成熟应用。2.5抗原修复在冷冻切片的拓展应用：Shi等2 9 将抗原热修复技术应用在冷冻切片的免疫组织化学染色上，研究小组使用2 6 种抗体对比甲醛和丙酮2组不同固定方式下的抗原回收率，结果显示有8 种抗体在甲醛固定的样本中用抗原热修复后抗原回收率比丙酮固定高，16 种抗体结果相近，仅有2 种抗体丙酮固定效果更好。其研究表明胞质蛋白在2组固定中抗原回收率相近，但核蛋白在甲醛固定后使用抗原热修复可以得到比丙酮固定更高的抗原回收率。综上，抗原修复技术的研究越来越成熟，应用也越来越广泛,但随着精准医疗大背景的推进,精准诊断对免疫组织化学的定量要求越来越高，为适应精效果。实用医技杂志2 0 2 3年4月第30 卷第4期Journal of Practical Medical Techniques，A p r i l 2 0 2 3，Vo l.30,No.4295准诊断要求，针对抗原指标个性化最佳修复条件的研究是趋势，目前多数的全自动化组织染色平台可以满足单项精确控制的修复条件，为实现个性化精准抗原修复提供基础，为免疫组织化学的人工智能发展奠定基础。在提升抗原回收率的研究和疑难修复的案例上，组合修复或许为我们提供更好的选择。需要指出的是，在做最佳修复方案研究时,并没有绝对的固定最佳方案，各因素间并非独立影响结果30 。也就是说并非把各种研究最佳数据放进一个方案里就是一个理想的修复组合,因此在做某指标的最佳修复方案时应该全面考虑如：抗原指标、pH、温度、压力、作用时间、一抗浓度等因素的最佳组合。良好的修复,可以提高一抗的稀释浓度,这时一抗浓度是因修复的效果而定的，并无绝对的最佳。目前研究表明,抗原热修复联合消化酶的组合效果更好，值得更多更深入的研究。2 种修复方法组合应用时，作用时间是关键，应力求在最高抗原回收率和防脱片、高背景等过度修复问题间找到平衡，提高修复质量。参考文献1 Fox CH,Johnson FB,Whiting J,et al.Formaldehyde fixationJ.J Histochem Cytochem,1985,33(8):845-853.2 Rivero ER,Neves AC,Silva Valenzuela MG,et al.Simple salt-ing-out method for DNA extraction from formalin-fixed,paraffin-embedded tissuesJ.Pathol Res Prac,2006,202(7):523-529.3】朱忆凌，周丽菲，黄渊，等.高压锅和微波炉加热抗原修复方法的比较J.温州医学院学报，2 0 0 5,35（6)：50 3-50 4.D0I10.3969/j.issn.1000-2138.2005.06.025.4 Shi SR,Key ME,Kalra KL.Antigen retrieval in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues:an enhancement method for immuno-histochemical staining based on microwave oven heating of tissuesectionsJ.J Histochem Cytochem,1991,39(6):741-748.DOI:10.1177/39.6.1709656【5石善溶.基于抗原修复技术的定量免疫组化：从实验、假说到研究计划J临床与实验病理学杂志,2 0 11,2 7(12):12 7 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