具有调节血糖功效的复合植物酵素的研究.pdf

具有调节血糖功效的复合植物酵素的研究陈青青，董墨思”，石岩，张雨婷”，杨宇峰，李苏红*食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESD0I:10.13995/ki.11-1802/ts.034073引用格式：陈青青，董墨思，石岩，等.具有调节血糖功效的复合植物酵素的研究J.食品与发酵工业，2 0 2 3，49（17）：6 8-6 2.CHEN Qingqing,DONG Mosi,SHI Yan,et al.Study on compound plant Jiaosu with blood glucose-regulating effect JJ.Foodand Fermentation Industries,2023,49(17):62-68.1（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳，110 8 6 6)2（辽宁中医药大学中西医结合学院、中医学院，辽宁沈阳，110 8 47)摘要该研究以红参、玉竹、马齿苋、枸杞、柚子、南瓜、生姜、芹菜、山药为原料制备酵素。通过单因素及星点设计-响应面试验确定酵素制备的最优条件，通过-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制试验及大鼠试验探究酵素的血糖调节功能。结果表明，发酵时间为49.5h，发酵温度为37，复合乳酸菌添加量为0.1%（质量分数）时效果最好，低聚果糖添加量对-淀粉酶抑制率无显著影响（P0.05）。酵素对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的ICso值分别为（16.540.40）和（46.546.50）mL/L，酵素含量为33.3mL/L时可完全抑制-淀粉酶活性。大鼠试验表明酵素能明显改善糖尿病大鼠的空腹血糖。该研究确定了复合植物酵素的最优发酵工艺，通过抑制酶活性和降低大鼠空腹血糖确定酵素有调节血糖作用，为开发具有调节血糖功效的复合植物酵素提供理论依据。关键词酵素；调节血糖；星点设计-响应面优化；-淀粉酶；-葡萄糖苷酶糖尿病是由于胰岛素代谢异常或胰岛素分泌不足而导致的慢性高血糖疾病,仅次于恶性肿瘤、心脑血管疾病，是危害人类健康的第三大疾病。长期的高血糖会增加心血管疾病、视网膜病变及神经性病变的风险,同时会导致患者产生糖尿病足、创口不愈合溃疡等现象2-4。目前糖尿病尚无治愈的方法,因此控制血糖对预防糖尿病及并发症具有重要作用，日常生活中人们食用具有调节血糖功效的功能性食品具有广阔的应用前景。食用植物酵素是以可用于食品加工的植物为主要原料，经酵母菌、乳酸菌和霉菌等益生菌发酵制得含有特定功能性成分可供人体食用的产品5。益生菌发酵能在改善产品风味的同时产生新的次级代谢产物和活性成分，增加酵素的保健功能。近年来，酵素的市场需求量日益增大,市售酵素种类逐渐增多，其研究主要集中在降脂减肥6 、改善肠道菌群7 、提高免疫力8 、增强消化功能和胃肠道吸收9 及抗氧化10 1等方面，调节血糖的酵素产品研究相对较少，且进口食用酵素售价普遍昂贵。故本研究以红参、玉竹、马齿苋、枸杞、柚子、南瓜、生姜、芹菜、山药为原料，复合乳酸菌为菌种，-淀粉酶抑制率为评价指标，通过星点设计-响应面试验优化发酵工艺，旨在探讨乳酸菌发酵对酵素-淀粉酶抑制率的影响，为开发具有调节血糖功效的功能型食用酵素提供理论支持。第一作者：硕士研究生（李苏红教授为通信作者，E-mail：l e e s u h o n g 12 6.c o m）收稿日期：2 0 2 2-10-2 6，改回日期：2 0 2 2-11-101材料与方法1.1材料与设备柚子、南瓜、生姜、芹菜、山药,市售；红参、玉竹、马齿苋,同仁堂;枸杞,安徽药知源中药饮片有限公司；复合乳酸菌NovumF312（活菌数为110 lCFU/g，包含乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌），山东中科嘉亿生物工程有限公司；低聚果糖，河南旗诺食品配料有限公司；猪胰-淀粉酶、链脲佐菌素（streptozotocin，ST Z）,Si g m a 公司；糖化酶，上海瑞恩生物科技有限公司；可溶性淀粉、无水乙醇、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司；中药复方益糖康红参、黄芪、黄精、甘草、白术、丹参、枸杞子、葛根、三七、茯苓、五味子、黄连（10:10：13:4:3:3:3:3:3:3:3:3）1，辽宁中医药大学附属医院。试验动物信息：SPF级雄性Wistar大鼠体质量（2 0 0 2 0）g，许可证号：SCXK（辽）2 0 2 0-0 0 0 1，辽宁长生生物技术有限公司。电热式压力蒸汽灭菌锅，浙江新丰医疗器械有限公司；超净工作台，苏州净化医疗器械有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州智博瑞仪器制造有限公司；数显高速分散均质机，上海标本模型厂制造；UV-5100紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；622023 Vol.49 No.17(Total 485)研究报告电脑控温恒温培养箱，宁波乐电仪器制造有限公司；加人5mL1%（质量分数）可溶性淀粉溶液，5min后SC-3614低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公立刻取1mL于试管中沸水浴,冷却后加入1mL蒸馏司；ACCU-CHEK血糖仪，中国罗氏制药有限公司。水和1.5mLDNS溶液,沸水浴中反应5min,冷却后1.2试验方法加蒸馏水补至10 mL，于540 nm处测定吸光度，用1.2.1酵素发酵工艺流程PBS代替酵素作为空白组，用PBS代替-淀粉酶作原料粉碎调配均质灭菌冷却接种发为样品对照,用PBS代替酵素和-淀粉酶作为空白酵离心成品对照。分别取12.5、16.7、2 0、2 5、33.3mL/L的酵素操作要点：选取干燥的红参（30 g）、玉竹（40 g）、28L,计算抑制率和ICso。抑制率的计算如公式（2)马齿苋（40 g）、枸杞（30 g）与新鲜的柚子（40 g）、南所示：瓜（40 g）、生姜（30 g）、芹菜（40 g）、山药（40 g）进行-淀粉酶抑制率/%=粉碎，原料与蒸馏水按3：10（质量比）的比例于榨汁机中磨浆，之后12 0 0 0 r/min均质5min。将均质后的样品于115条件下灭菌30 min，冷却至室温后接人复合乳酸菌进行发酵，最后于450 0 r/min离心3min,即得到复合植物酵素。由于酵素原液含量较高，试验测定时将其稀释至不同含量，稀释后酵素含量的计算如公式(1)所示：酵素母液体积/mL酵素含量/(mL/L)=稀释后酵素体积/L1.2.2单因素试验设计考察发酵时间（0、12、2 4、36、48、6 0 h）、发酵温度（2 8、31、34、37、40）、复合乳酸菌添加量（0、0.025%、0.0 5%、0.1%、0.2%、0.3%，质量分数，下同）、低聚果糖添加量（0、2%、4%、6%、8%、10%，质量分数，下同)对酵素-淀粉酶抑制率的影响。1.2.3星点设计-响应面优化试验根据单因素试验结果,利用Design-expert8.0.6分析软件设计响应面试验，优化酵素的发酵工艺。以发酵时间（h）、发酵温度（）及复合乳酸菌添加量（%）为自变量，以-淀粉酶抑制率为响应值,试验设计见表1。表1响应面试验因素与水平Table 1IResponse surface test factors and levels水平发酵时间/h-1.688-1240481721.68881.2.4-淀粉酶抑制率的测定及ICso的测定参照LI等I的方法略做修改。取2 8 L25mL/L的酵素溶液、1mL的PBS（p H 6.8,0.1mol/L）10 0 L-淀粉酶（2 9 U）溶液依次加入到10 mL离心管中，混合均匀,37 反应2 0 min后，(A-A)-(A,-Ao)A-Ao式中：A,空白吸光度；Ao，空白对照吸光度;Ax，样品吸光度；Ax0，样品对照吸光度。1.2.5酵素对-葡萄糖苷酶抑制率及ICso的测定试验参照刘雪蕊12 的方法。取40 L不同浓度的酵素（33.3、50、6 6.6、10 0、2 0 0 mL/L），分别与40L葡萄糖苷酶（0.0 2 U）溶液于37 加热(1)10min后,加人2 0 L7.5mmol/L4-硝基苯-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-D-glucopyranoside，pNPG）溶液，混合液反应10 min后加人10 0 L0.1mol/LNaCO,溶液终止反应，于40 5nm处测定吸光度,用0.1mol/LpH6.8的PBS代替酵素作为空白组,用PBS代替-葡萄糖苷酶溶液作为样品对照。计算抑制率和ICso。抑制率的计算如公式(3)所示：-葡萄糖苷酶抑制率/%=(3)A式中：A,空白吸光度;Ax，样品吸光度；Axo，样品对照吸光度。1.2.6酵素的指标测定pH的测定：采用pH计；总酸（以乳酸计）的测定参考GB12456一2 0 2 1食品安全国家标准食品中总酸的测定；乳酸菌的测定参考GB4789.352016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检因素发酵温度/3234374042100（2)A-(A,-Axo)2100菌添加量/%验；大肠菌群的测定参考GB4789.32016食品安0.016全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数；霉0.050.100.150.184菌的测定参考GB4789.152016食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数；金黄色葡萄球菌的测定参考GB4789.102016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验；沙门氏菌的测定参考GB4789.42016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验。1.2.7糖尿病大鼠造模方法选取SPF级健康Wistar大鼠40 只，随机设定2023 年第 49 卷第 17 期(总第 48 5 期)6 3食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES10只大鼠作为正常组，普通饮食喂养，其余30 只大鼠连续喂养高脂饮食（在饲料中加人猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸钠等成分）。维持上述喂养方法2 周后，禁食16 h,称重后，腹腔注射链脲佐菌素，剂量为45mg/kg,建立2 型糖尿病大鼠模型,以随机血糖值 16.7 mmol/L作为造模标准。空白组大鼠根据体重注射同等体积的柠檬酸钠缓冲液（0.1mmol/L）。1.2.8实验分组和给药造模成功后的大鼠随机分为模型组、中药组（中药复方益糖康）、酵素组，每组10 只。各组大鼠采用每日经口灌胃方式给药1次,连续8 周。正常组和模型组每日10 mL/(kgd)的生理盐水灌胃,中药组以每日10 mL/(kgd)的中药复方益糖康灌胃,酵素组以每日 10 mL/(kgd)的酵素灌胃。1.2.9大鼠空腹血糖测定大鼠禁食16 h后尾尖取血,使用血糖仪测量各组大鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。1.3数据处理使用Origin2019b和Excel2019软件进行作图，Design-Expert.V8.0.6进行响应面分析。使用SPSS11.6进行二次多项式回归分析,P0.05表示具有a二二-淀粉酶抑制率100b%/率保烈-0806040d20H0C100-pH%/率伴保乳-0b80604020000.0250.05菌添加量/%a-发酵时间对-淀粉酶抑制率的影响;b-发酵温度对-淀粉酶抑制率的影响;c-菌添加量对-淀粉酶抑制率的影响；d-低聚果糖添加量对-淀粉酶抑制率的影响图1单因素试验结果Fig.1Single-factortest results注：不同小写字母代表差异显著（P0.05），说为：发酵时间49.5h，发酵温度37，复合乳酸菌添明添加低聚果糖不影响酵素的发酵速度及对-淀粉加量0.1%。在此条件下进行3次平行试验，测得酵酶的抑制作用。由此说明乳酸菌依靠原料中的碳源素的-淀粉酶抑制率为（9 6.8 31.8）%，与预测值能够完成发酵,并不需要额外添加。因此选择不添加基本相符，表明经星点设计-响应面法优化后的发酵低聚果糖,且响应面试验中去掉该因素。条件具有一定的可行性。2.2星点设计-响应面试验优化结果表3回归模型方差分析结果星点设计-响应面试验优化发酵工艺结果见表Table3Regression model ANOVA results2。以-淀粉酶抑制率（Y）为响应值，利用Design方差平方和自由度均值F值P值显著性来源Expert.V8.0.6对试验结果进行分析，建立发酵时间模型15 122.77（A）、发酵温度（B）、复合乳酸菌添加量（C)3因素的AB二次多项回归方程为：C3 930.16AB161.10Y=95.28+11.18A-3.46B+16.96C+4.49AB+4.21AC-AC8.46BC-10.55A-20.54B-12.27C2BC表2 星点设计-响应面试验设计及结果A2B2Table 2Central composite design-response surfaceC?test design and results残差失拟项186.70发酵时发酵温间h度/11.0021.0030.0040.005-1.006-1.0070.0081.6890.00100.0011-1.6812-1.00130.00140.00151.00160.00171.0018-1.00190.00200.00表3的方差分析结果表明，模型的P值极显著（P0.05），证明试验残差是由随机误差引起的。决定系数 Ra,=0.9705,表明该模型可解释约9 7.0 5%响应值的变化。R=0.9845,说明方程拟合良好，该模型合理,可以充分反映各因素与响应值之间的关系。通过F值的大小可知,各因素对-淀粉酶抑制率的影响大小依次是C（复合乳酸菌添加量）A（发酵时间）B（发酵温度）。通过响应面试验得出最佳发酵91 706.121163.79111141.961572.9111 604.4216 079.5512 168.2812 168.2890.79238.81105复合乳酸菌-淀粉酶添加量/%抑制率/%1.001.001.00-1.000.000.000.000.001.00-1.00-1.001.000.001.680.000.000.00-1.680.000.000.000.001.001.000.000.000.000.00-1.00-1.00-1.680.00-1.001.00-1.00-1.001.680.000.000.001 680.311 706.12163.793 930.16164.57161.106.75141.965.94572.9123.991 604.4267.186 079.55254.5723.8837.34纯误差52.11总误差15 361.5875.6R2=0.984 545.7注：*P0.05代表差异显著，*P0.01代表差异极显著。98.692.132.575.889.489.931.594.640.735.991.196.733.840.287.928.933.998.670.3671.446.860.000 10.000 13.580.0938不显著510.4219Ra;=0.970 52.3酵素的质量评价以复合乳酸菌为菌种制备酵素，可提高发酵速度，显著降低酵素的pH值，提高总酸含量4。由表4知，各项理化指标均符合QB/T53232018植物酵素的要求。酵素发酵前对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶均有抑制作用,经乳酸菌发酵后抑制率显著提高,可能是原料本身保留了营养成分的同时，乳酸菌发酵有利于2 种酶活性抑制成分的生成。且最佳发酵工艺制备的酵素色泽良好，甘苦味适中，口感细腻无异味，质地均匀，无致病菌检出。表 4酵素的指标Table 4Indicators of Jiaosu指标标准要求发酵前pH值4.54.83 0.04a总酸含量/g/(100g)0.81.41 0.11 a乳酸菌/(CFU/mL)1 105-淀粉酶抑制率/%一-葡萄糖苷酶抑制/%一霉菌/(CFU/mL)20大肠菌群/(CFU/mL)1金黄色葡萄球菌不得检出未检出沙门氏菌不得检出未检出注：同行不同小写字母表示差异显著（P0.05）。2023 年第49 卷第17 期(总第48 5期)0.000 10.00010.025 60.000 10.026 60.035 00.000 60.000 1发酵后3.35 0.05b3.94 0.08b一1.65 101119.94 4.58a96.83 1.80b28.68 2.41497.84 2.51b未检出未检出未检出未检出未检出未检出65*食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES2.4酵素对-淀粉酶与-葡萄糖苷酶的抑制作用如表5所示,酵素对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制呈浓度依赖性特征，计算得出酵素对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的ICso值分别为（16.540.40）和（46.546.50）mL/L,表明酵素对-淀粉酶的抑制率达到50%所需要的浓度低于同等酶活力时-葡萄糖苷酶抑制率达到50%所需要的浓度，即在同浓度下,酵素对-淀粉酶的抑制强于-葡萄糖苷酶。2.5酵素对大鼠空腹血糖的影响酵素干预糖尿病大鼠的空腹血糖变化结果如表6所示,造模成功后，与正常组相比，喂食高脂饲料的3组大鼠在干预前空腹血糖值显著升高（P0.01）。干预2 周后,与模型组相比，中药组大鼠的FBG明显干预前正常组5.3 0.26模型组22.8 2.55*中药组22.4 1.38*酵素组22.9 1.22*注：与正常组比较，*P0.05，*P 0.0 1；与模型组比较，P0.05，*P 0.0 1。3讨论与化学合成物相比，天然产物更加经济、安全，利用天然产物开发调节血糖的功能性产品已成为预防和治疗糖尿病的新趋势15-17 。发酵能在改善产品风味的同时提高其功能性，故发酵产品的研制已成为研究热点。研究显示,水果酵素对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制率分别为9 9.57%和8 1.6 7%，酶抑制率较高,其中多酚对-淀粉酶有抑制效果18 ,但该酵素为自然发酵,发酵周期长,易受多种微生物影响,需要严格控制发酵条件以保证品质【19 ；紫薯汁发酵后对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制率分别为6 3.5%和70.9%，且发酵后提高了多糖、总酚、总酮含量2 0 1；由乳酸菌发酵制备出富含多酚的接骨木果汁,其对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制率分别为6 8.6 2%和72.39%21。大量研究表明，发酵可提高多糖含量2 ,释放黄酮2 3 和多酚物质2 4,且植物中的黄酮、多酚、多糖等高活性物质是天然降血糖提取物的研究热点2 5。结合上述研究,推测酵素中含黄酮、多酚或多糖类物质,并具有改善血糖的效果。本研究酵素碳源充足，制备工艺简单，发酵周期短,微量酵素抑制酶活性效果显著,经发酵后对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制率分别提高了4.8 6 倍662023 Vol.49 No.17(Total 485)降低（P0.05）；从第4周开始,中药组和酵素组的FBG显著降低（P0.05).The ICso values of Jiaosuon-amylase and-glucosidase were(16.54 0.40)and(46.54 6.50)mL/L,under the concentration of 33.3 mL/L Jiaosu,the-amylase activity could be completely inhibited.The rat test showed that the Jiaosu significantly improved the fasting blood glucose of dia-betic rats.In this study,the optimal fermentation process of the compound plant Jiaosu was determined,and the effect of the Jiaosu onregulating blood glucose was confirmed by the inhibition of enzyme activity and reduction of fasting blood glucose in rats,which provides atheoretical basis for the development of the compound plant Jiaosu with the effect of regulating blood glucose.Key words Jiaosu;regulate blood glucose;central composite design-response surface optimization;-amylase;-glucosidase682023 Vol.49 No.17(Total 485)