生物素-亲和素市公开课获奖课件省名师优质课赛课一等奖课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考!,生物素,-,亲和素标识技术,食安,0501,类春燕 孙隽 陈春艳,孙晓丽 李臻佳,1/23,是生物体内广泛分布一个羧化酶辅酶，分子中有两个环状结构：,环为咪唑酮环，是与亲和素结合主要部位。,环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其它生物大分子（如：酶、蛋白质、抗体、,DNA,）唯一结构。,生物素,（,Biotin,）辅酶,R,、维生素,H,2/23,利用生物素羧基加以化学修饰可制成各种活性生物素，以适合与各种生物大分子结合需要。,主要有用于标识蛋白质氨基生物素,N,羟基丁二酰亚胺酯（,BNHS,）和生物素对硝基酚酯,(pBNP),其中以,BNHS,最为惯用。近年来，应用长臂生物素（,BCNHS,）标识生物大分子，能够降低位阻效应，增加检测灵敏度和特异性。用于标识蛋白质醛基、巯基和糖基衍生物有生物素酰肼（,BHZ,）及肼化生物素（,BCHZ,）。,3/23,4/23,亲和素（,Avidin,）,抗生物素蛋白、抗生物素,是从鸡蛋清中提取一个糖蛋白，它由四个相同氨基酸亚基组成，亚基之间经过二硫键连接，亲和素每一个亚基含有一个与生物素结合位点，并与生物素或其衍生物形成高度稳定复合物。,5/23,基本原理,生物素与抗体共价交联方法简单，条件温和，且普通不影响抗体活性。生物素与亲和素能快速结合，而且反应不受外界干扰，含有高度特异性和稳定性，二者亲和常数比抗原抗体反应高,10,100,万倍，结合快，呈不可逆反应，而且在,pH,，温度、有机溶剂或变性剂较大改变范围内均能稳定存在。,6/23,7/23,生物素亲和素系统（,BAS,）用于检测基本方法有三类：,标识亲和素连接生物素化大分子反应体系，称,BA,法，或标识亲和素生物素法（,LBA,）。,以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标识生物素，称为,BAB,法,，或桥联亲和素生物素法（,BRBA,）。,将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素生物素过氧化物酶复合物，再与生物素化抗抗体接触时，将抗原抗体反应体系与,ABC,标识体系连成一体，称为,ABC,法,，其中,A,Ab,为亲和素化抗体，,B-Ab,为生物素化抗体。,8/23,1.BA-,酶免疫技术,原理,亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再将生物素化抗体,Ab(,或抗原,Ag),包被于孔内。经过,BA,将免疫复合物与酶连接起来，能有效地放大,EIA,法，使其灵敏性增强。,9/23,优点,生物素反抗体和酶,标识率高,，又不影响其它活性。,生物素亲和素结合,极为稳定,，不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。,每个亲和素分子能结合,4,个生物素，能耦合更多联结生物素酶分子，,提升,EIA,敏感性。,10/23,双抗体夹心生物素,-,亲和素,ELISA,法检测 相思子毒素,用亲和素,-,生物素,ELISA,检测,GPV,抗体,生物素亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚,A,11/23,2.BA-,分子生物学技术,将引物生物素化，经过,PCR,反应后,用,(,链霉,),亲和素固定扩增产物，进行下一步显色或荧光等检测。,生物素化引物扩增目标基因,微孔板内链霉亲和素捕捉,PCR,扩增产物,用地高辛标识寡核苷酸探针进行杂交,酶标抗体进行显色反应,12/23,在分子生物学技术中较惯用技术还有：将核酸,探针结合上生物素，经过酶或其它示踪物标识亲和,素进行显色等。,扩增,rRNA,目标序列 与生物素化,探针进行杂交 经过微孔板内链霉亲,和素捕捉 被捕捉目标序列再次进,行碱性磷酸酶标识探针杂交反应,用化学发光微孔法检测,13/23,3.BA-,电化学免疫技术,原理,将酶,1,标识抗体结合在碳电极表面组成传感器，与液体中待检抗原和生物素化抗体及酶,2,标识亲和素免疫反应后，碳电极表面形成酶,1,和酶,2,免疫通道，结果电信号被放大。,14/23,优点,灵敏,快速,可定量,15/23,应用,临床诊疗,生物医学,生物化学,环境监测,16/23,4.BA-,免疫印迹技术,该技术将,BA,技术与免疫印迹技术相结合,进一,步提升检测灵敏度。,免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫,测定基础上发展起来一个新免疫学技术。是,凝胶电泳高分辨率和固相免疫测定特异性、,敏感性、稳定性及可重复性有机结合。,17/23,过碘酸钠,偶联,亲和素与,辣根过氧化物酶,生物素,酯化,（,生物素,+N-,羟基琥珀亚胺,N-,羟基琥珀酰亚胺生物素酯）,生物素酯,标识,单克隆抗体,样品经,SDS-PAGE,电泳,对醋酸纤维素膜,进行,BA-,酶免疫,染色,光密度计扫描,定量检测,18/23,5.BA-,组织化学技术,利用,BA,技术将染料浓聚于靶细胞表面，使其更利于观察，提升了检测灵敏度。,Xia Y1,等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤细胞结合后，加入碱性磷酸酶,-,亲和素进行染色检测，证实了黑皮质素结合受体位于黑色素瘤细胞表面。,PereiraMM,等将,ABC(,生物素,-,亲和素,-,过氧化物酶,),染色法用于钩端螺旋体组织细胞损害进行定位检验，结果简单易测，此法经惯用于免疫组织化学检测中。,19/23,6.BA-,分离提纯技术,待分离物生物素化，结合于亲和素包被固相载体上，洗脱后，到达分离提纯目标。,Morag G.,等使用硝基,-(,链霉,),亲和素吸附于分离柱上,分离提纯兔抗血清中免疫球蛋白、抗,-,转移因子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离柱生物学特征。,在制备特异性破骨细胞,cDNA,库时,加入,生物素化,mRNA,然后经过固相亲和素提取。,用斑点印迹法分析,发觉在此提取物中,高度聚集了特异性破骨细胞,cDNA,。,20/23,7.BA-,时间分辨荧光免疫技术（,BA-TR-FIA,）,应用,BA-TR-FIA,检测肿瘤细胞和血清中肌酸转移,BB(CK-BB),发觉,CK-BB,是乳腺癌一个敏感指标,前列腺癌病人血中,CK-BB,也显著提升,所以认为该方法是研究,CK-BB,与各种恶性肿瘤关系敏感特异方法。,该法中使用生物素化,Ab,和,Eu3+(Eu3+,是发光效率、涂敷稳定性、回收成本等最好荧光粉,),标识亲和素,经过,BA,技术多级放大作用,使得,Ag-Ab,复合物中螯合物,Eu3+,信号更强,提升了检测灵敏度。,21/23,8.BA-,预定位技术,这项研究近年来发展快速,现已从动物试验阶段进入临床应用研究。,Yao Z.,等利用植物血凝素能与肿瘤细胞表面糖蛋白和糖脂上糖分子结合,亲和素末端,N-,乙酰葡萄糖胺和甘露糖残基能与植物血凝素结合特征,用放射性同位素标识生物素进行肿瘤定位。,22/23,Thank you!,23/23,