聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌LBX-2烷烃羟化酶基因SaalkB的克隆与表达分析.pdf

书 书 书 年月第卷第期四川师范大学学报（自然科学版）（），收稿日期：接受日期：基金项目：国家自然科学基金青年基金（）通信作者简介：邵欢欢（），男，副教授，主要从事环境微生物与基因工程的研究，：引用格式：张榕麟，高田蕊，陈美菊，等聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基因的克隆与表达分析四川师范大学学报（自然科学版），（）：聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基因的克隆与表达分析张榕麟，高田蕊，陈美菊，熊爽，何欣怡，雍彬，邵欢欢（四川师范大学生命科学学院，四川成都）摘要：白浅灰链霉菌（）能够高效降解聚乙烯（，），而烷烃羟化酶基因在聚乙烯降解中可能发挥重要作用以基因组为模板，利用技术扩增基因，该基因全长 ，编码个氨基酸对该基因编码蛋白进行生物信息学分析，发现蛋白包含个跨膜结构域，无信号肽，属于亲水性蛋白，二级结构主要由无规则卷曲和螺旋组成，与链霉菌 的蛋白的同源性达将克隆得到的基因连接到表达载体上进行原核表达，且重组工程菌株能够降解 结果显示得到与预期蛋白分子量（）大小一致的蛋白利用荧光定量发现，白浅灰链霉菌在以为唯一碳源的培养基中基因的表达量约为在高氏一号培养基中的倍；蛋白质组学数据分析发现，白浅灰链霉菌在以为唯一碳源培养 和 时，蛋白的表达量比在高氏一号培养基中分别上调了 和 倍，表明基因可能是白浅灰链霉菌降解聚乙烯的关键基因关键词：白浅灰链霉菌；基因克隆；表达分析中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：塑料因其具有强度大、重量轻、柔韧性好、易于生产和成本低廉等特点，被广泛应用于人类生活、工业生产等各个领域据相关文献报道，全球塑料年产量约为亿，其中聚乙烯（，）约占，是塑料生产的重要组成部分然而废弃塑料造成的环境污染问题日益严重，随着时间推移，的塑料被风化分解为直径小于 的微塑料，广泛分布于全球各地，对河流、湖泊、耕地等造成严重污染，且在海洋、淡水、土壤、陆地生物体内均发现了微塑料的存在，严重危害生物体健康 分子排列紧密、疏水性强、表面能低且化学性质稳定，因此在自然界中很难被降解，导致废弃物在环境中大量积累，如何彻底降解废弃物已经成为一个全球性难题生物降解是一种绿色环保、低能耗的降解方式通过微生物降解将其无机矿化为和，该降解方式极有可能成为减少“白色污染”的有效途径之一生物降解的第一步是氧化，由微生物产生胞外酶氧化长烃链断裂研究发现烷烃羟化酶、漆酶以及过氧化物酶等多种酶类具有氧化降解的能力 等发现过氧化物酶可以显著提高高密度聚乙烯薄膜的亲水性 等发现赤红球菌分泌的漆酶可降低低密度聚乙烯的分子量及增加酮羰基指数，认为可由漆酶催化打断聚乙烯长链烷烃单加氧酶（，）是烷烃羟化酶（，）系统的催化组分，参与烃类代谢途径的第一步，通过末端或次末端氧化降解烃类低聚物烷烃羟化酶系统包含个组份，分别是个非血红素铁的膜整合的单加氧酶（第期张榕麟，等：聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基因的克隆与表达分析，）和个电子转移蛋白红素氧还蛋白（，）、红素氧还蛋白还原酶（，）等通过实时荧光定量检测烷烃羟化酶基因表达量，以监测聚乙烯降解菌的丰度 等将降解细菌铜绿假单胞菌的烷烃羟化酶基因在大肠杆菌中表达，经 堆肥生物降解将低分子量近的碳矿化为，认为基因在低分子量降解过程中发挥重要作用 等克隆了降解细菌铜绿假单胞菌的烷烃羟化酶基因并在大肠杆菌中表达，发现在含有低密度的培养基中转录水平增加了倍，重组菌株表现出对的高生物降解能力，而不含的菌株对完全无降解作用，证实了是降解聚乙烯不可或缺的基因本实验室前期从土壤中分离筛选得到一株能够降解聚乙烯的放线菌 白浅灰链霉菌，该菌株对淀粉聚乙烯降解 的失重率可达 蛋白质组与代谢组数据表明基因可能在白浅灰链霉菌降解的过程中发挥重要作用因此，本研究通过克隆白浅灰链霉菌烷烃单加氧酶基因，对基因片段进行测序及序列同源性分析，并对其编码蛋白氨基酸序列、理化性质、信号肽等进行生物信息学分析构建基因的原核表达载体并进行重组蛋白的原核表达，通过分析重组工程菌株对膜片的降解效果；通过荧光定量分析基因在聚乙烯降解过程中的表达情况；通过蛋白组数据分析蛋白在聚乙烯降解过程中的表达情况本研究可为深入探索基因在聚乙烯降解过程中的作用提供理论依据，也为研究白浅灰链霉菌降解聚乙烯的过程及机制提供思路材料和方法 实验材料白浅灰链霉菌由本实验室分离并保存 感受态、（）感受态与原核表达载体 、凝胶回收试剂盒均购自成都擎科梓熙生物技术有限公司质粒提取试剂盒购自公司细菌基因组提取试剂盒、以及 购自天根生化科技（北京）有限公司 和卡那霉素购自公司、购自公司 反转录试剂盒购自 粉末（）购自中国石油化工股份公司茂名分公司 膜片购自海门市扬子医疗器械有限公司引物根据基因序列与序列设计，由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成（见表）表引物序列 序号引物序列（）培养基高氏一号培养基（）：可溶性淀粉（用于蛋白质组学分析时为），值 以为唯一碳源的无机盐培养基（）：，值 每 培养基内加入经紫外灭菌处理的粉末 或膜片（）白浅灰链霉菌总和提取采用细菌基因组试剂盒制备白浅灰链霉菌总由于白浅灰链霉菌是革兰氏阳性菌，且在液体培养基中呈球状，较难破壁，故先将菌体混合石英砂在液氮中研磨，再按照试剂盒提供的操作步骤提取基因组白浅灰链霉菌总利用法提取，并利用凝胶电泳对其纯度和完整性进行检测；同时使用反转录试剂盒进行反转录得到该菌株的总 白浅灰链霉菌 基因扩增及测序以白浅灰链霉菌总为模板，和为扩增引物，扩增基因 反应体系为：基因组 ，四川师范大学学报（自然科学版）第卷（），（），（），（），补足至 扩增条件为：预变性，进入循环；变性；退火；延伸；循环次；延伸 使用纯化回收试剂盒回收目的片段，取 目的，依次加入 ，混匀后 反应，连接产物转化 感受态细胞，取 转化液涂布于含有 卡那霉素的固体培养基中，过夜培养，挑取单菌落接种至含 卡那霉素的液体培养基中，、振荡培养 ，提取质粒进行验证经鉴定为阳性的菌株，送往成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，对测序正确的菌株进行菌种保藏 生物信息学分析将克隆得到的基因序列进行（：）相似性比对分析；蛋白的理化性质使用（：）在线分析；应用 （：）进行蛋白信号肽预测；使用（：？）在线预测蛋白二级结构；使用（：）在线预测蛋白三级结构；运用（：）预测蛋白的跨膜结构；应用中的程序对蛋白进行序列同源性分析，利用软件 比对序列，采用近邻相接法（）构建系统进化树，氨基酸的进化距离使用模型 重组蛋白的诱导表达将测序验证正确的重组质粒转入 （）中，使用含有卡那霉素（）的平板进行筛选，过夜培养，挑取单菌落至含 卡那霉素的液体培养基中，、振荡培养至为 时，加入 ，低温诱导表达 取 菌液超声破碎 次至透明，离心取菌体沉淀，加入 上样缓冲液后取样进行凝胶电泳 重组菌株处理膜片使用以膜片为唯一碳源的无机盐培养基培养上述构建的重组工程菌株，以空载体 （）作为对照组，每组设个重复培养 后，从对照组和实验组的摇瓶中分别回收膜片，用蒸馏水清洗膜片数次，再将膜片放入终质量分数为的溶液中，超声清洗 后置于 环境中过夜，然后依次用无水乙醇、清洗，干燥后用原子力显微镜（，）在 的扫描速度下观察膜片表面形貌 荧光定量以白浅灰链霉菌总为模板，和为引物，采用染料法对基因进行相对荧光定量检测反应体系为：（），（），（），补足至 反应条件：预变性，进入循环；变性；退火；延伸；循环次，保温，重复次数 从 到 进行溶解曲线分析，去除引物二聚体和其他非特异性扩增利用 分析数据，定量方法为法 蛋白的表达量分析分别使用以粉末为唯一碳源的无机盐培养基和高氏一号培养基培养白浅灰链霉菌，每组设个重复，、振荡培养在培养至（指数生长期）和（平台期）时进行取样，取菌液于 、条件下离心，收集全部菌体，以粉末为唯一碳源培养 和 的样品分别标记为、，用高氏一号培养基培养 和 的样品分别标记为、对样品进行蛋白质测序并获得蛋白质组学数据，通过序列比对和信息注释找到蛋白，利用软件制作热图分析其表达量，并比较不同碳源、不同时间组别的表达量（转化后数据）的差异，分别记为 、和 第期张榕麟，等：聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基因的克隆与表达分析 结果 白浅灰链霉菌 基因的克隆以白浅灰链霉菌基因组为模板，利用引物和进行扩增，经纯化后获得长度约为 的片段（见图）：分子量标准（）；：基因的扩增产物图白浅灰链霉菌的基因扩增 基因的生物信息学分析 编码蛋白的核苷酸序列及氨基酸序列分析白浅灰链霉菌的基因通过扩增后，对其进行胶回收、克隆并测序，经测序后发现该基因长度为 （索引号：），通过软件分析获得该基因编码蛋白质共具有个氨基酸，且具有一个脂肪酸脱饱和功能域，该功能域长度为，起始位点为第，终止位点为第 编码蛋白的理化性质分析理化性质分析显示基因编码蛋白共有个氨基酸，分子式为，分子量为，等电点（，）为，不稳定系数为，是一种不稳定的蛋白质，脂肪疏水系数为，亲水性平均系数（）为，属于亲水性蛋白 编码蛋白的二级和三级结构预测预测得到编码蛋白的二级结构（见图），其中螺旋（）、折叠（）、无规则卷曲（）所占比例分别为、因此，蛋白主要由无规则卷曲组成，其次为螺旋，再次为折叠图 编码蛋白二级结构预测 利用 同源构建模型预测蛋白的三维结构模型（见图），该蛋白三级结构中仅有部分螺旋和少量的折叠，大部分由无规则卷曲组成，整体结构比较疏松，与蛋白质二级结构预测基本一致 四川师范大学学报（自然科学版）第卷图 编码蛋白三级结构预测 编码蛋白信号肽及跨膜结构分析 分析发现编码蛋白不存在信号肽序列（见图），属于非分泌蛋白图 编码蛋白信号肽分析 软件预测编码蛋白含有个跨膜结构域（见图），分别为氨基酸第 位（跨膜方向由内向外）、氨基酸第 位（跨膜方向由内向外）、氨基酸第 位（跨膜方向由外向内）、氨基酸第 位（跨膜方向由内向外）、氨基酸第 位（跨膜方向由外向内），表明编码蛋白属于跨膜蛋白图 编码蛋白跨膜结构分析 编码蛋白的系统进化分析系统进化分析结果表明：经克隆获得的编码氨基酸序列与 、以及的编码氨基酸序列亲缘关系最近（见图），这一结果与编码蛋白的物种分类系统的结果较为一致图 编码蛋白的系统进化树 第期张榕麟，等：聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基因的克隆与表达分析 原核载体构建及表达分析从转入重组质粒的 中提取含有基因的重组质粒（见图）并进行验证，片段大小与目的基因大小相同（见图），证明含有基因的原核表达载体构建成功：分子量标准（）；：重组质粒图重组质粒琼脂糖凝胶电泳 ：分子量标准（）；：重组质粒验证图重组质粒验证 经终浓度为 诱导的含有基因的原核表达载体在 （）中成功表达（见图），分子量约，与预期的目标蛋白大小一致（），表明在 诱导下，基因在大肠杆菌中能够进行过表达：蛋白；：空载体转化菌诱导表达产物；：重组质粒转化菌诱导表达产物图 编码蛋白的原核表达 重组菌株对膜片的处理作用 图像显示重组工程菌株处理 后膜片局部降解，膜片上形成了明显的沟槽、凹陷和轻度侵蚀，粗糙程度高（见图），而对照组膜片相对更加平滑，虽有凹陷，但粗糙程度低（见图），表明重组工程菌株能够降解，通过与膜片表面的物理接触改变了聚合物表面的完整性，进一步表明基因可能在聚乙烯降解过程中发挥重要作用图 膜片表面形貌的测试 四川师范大学学报（自然科学版）第卷 荧光定量分析利用法提取白浅灰链霉菌总，反转录为进行荧光定量，分析白浅灰链霉菌在以粉末为唯一碳源的无机盐培养基中和在高氏一号培养基中基因的表达水平，每组设个重复结果表明，在以粉末为唯一碳源的培养基中基因的表达量约为在高氏一号培养基中的倍（见图），证明了基因可能在白浅灰链霉菌降解聚乙烯的过程中具有重要的作用 蛋白的表达量分析蛋白质表达量热图显示白浅灰链霉菌的蛋白在和中的表达量显著高于和（见图），通过表达量 转化后的数据进行差异显著性分析，白浅灰链霉菌在以为唯一碳源培养 和 时，蛋白的表达量比在高氏一号培养基中分别上调了 和 倍（图），表明蛋白可能参与了与降解相关的代谢途径，证明了基因可能在白浅灰链霉菌降解聚乙烯的过程中具有重要的作用：高氏一号培养基中基因表达量；：以粉末为唯一碳源的无机盐培养基中基因表达量图 基因表达量的荧光定量分析 ：不同培养条件下蛋白表达量，横坐标表示个重复，纵坐标表示不同培养条件，深色表示上调，浅色表示下调；：蛋白表达量 转化后差异显著性分析，其中横坐标表示不同培养条件间的对比，纵坐标表示 值图白浅灰链霉菌的蛋白差异表达分析 讨论自世纪以来，随着塑料产品不断大规模生产，塑料废弃物由于处理不当，长期大量积累造成“白色污染”，严重危害生态环境的健康发展目前，已有许多研究报道了微生物降解的潜力，分离出若干能利用为唯一碳源生长的菌株然而，大多微生物存在降解率低以及降解需要预处理等问题，且降解速率受结晶度、氧化程度和分子量大小等多种因素的影响白浅灰链霉菌是一种好氧和高 含量（质量分数）的革兰氏阳性菌，能够利用作为唯一碳源，降解薄膜第天薄膜表面出现皱褶和凹痕，第天出现明显可见的破损，第天出现孔洞，对分子量为 和 的粉末降解 的降解率分别为 、本研究成功地从白浅灰链霉菌基因组克隆了第期张榕麟，等：聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基因的克隆与表达分析 基因，其长度为 ，编码个氨基酸，脂肪酸脱饱和功能域长度为，与 和 的基因大小相似对蛋白进行理化性质分析、信号肽、蛋白质二级和三级结构预测，结果表明，蛋白是一种分子量为 、具有个跨膜结构域（见图）且无信号肽（见图）的不稳定型亲水蛋白；二级结构预测结果可知其主要由无规则卷曲和螺旋组成（见图）系统进化分析结果表明，蛋白氨基酸序列与 、以 及 的编码氨基酸序列亲缘关系最近，其中与 的编码氨基酸序列相似性为（见图）大肠杆菌外源蛋白表达系统是生产外源蛋白的最优选系统本研究成功构建了基因的原核表达载体（见图），通过凝胶电泳在大肠杆菌中过量诱导表达得到分子量大小与预测一致的蛋白（）（见图），与的蛋白（）分子量相近但等将 的基因在大肠杆菌中表达，经诱导得到分子量为 等发现从 中克隆得到的基因在大肠杆菌中经不同浓度的柴油诱导表达，其分子量为 可见不同菌株来源的蛋白分子量大小存在一定差异，可能与编码基因的大小或组成不同有关来自、的烷烃羟化酶基因在大肠杆菌中表达，的堆肥降解结果表明重组工程菌株均对低分子量粉末具有降解作用，而空载体菌株无降解作用，证实了对低分子量的降解能力本研究中 的降解实验同样发现重组工程菌株能够降解，观察膜片表面形成明显的沟槽、凹陷（见图）通过荧光定量分析发现，白浅灰链霉菌在以粉末为唯一碳源的培养基中基因的表达量约为在高氏一号培养基中的倍（见图），这与等发现 的基因在以长链正构烷烃作为唯一碳源时转录水平提高 倍且通过证实了显著诱导表达，以及杨稢等通过荧光定量证明 降解石油与基因的上调表达相关具有一致性通过蛋白质组学数据分析发现白浅灰链霉菌在以为唯一碳源培养 和 时蛋白的表达量比在高氏一号培养基中分别上调了 和 倍（见图），这与刘环分析 蛋白质组数据发现烷烃羟化酶在有烷烃诱导时表达量上调倍的结果具有一致性也有研究发现参与聚苯乙烯塑料降解的第一步，可以催化聚苯乙烯羟基化由此可以推测不仅是聚乙烯降解过程中的关键酶基因，也可能在其他塑料降解过程中起着重要作用本研究从白浅灰链霉菌基因组克隆得到了基因，并对其进行了生物信息学分析，为进一步探讨该基因的表达提供理论依据此外，构建含有基因的原核表达载体并在大肠杆菌内成功表达，且重组工程菌株具有降解的能力荧光定量分析基因在降解过程中的表达情况，蛋白质组分析蛋白在降解过程中的表达情况，证明了基因可能在白浅灰链霉菌降解过程中起重要的作用为进一步研究蛋白在聚乙烯降解过程中的功能以及深入探索白浅灰链霉菌降解聚乙烯的机制提供理论支撑致谢四川师范大学“大学生创新性实验计划”项目（）和四川师范大学开放实验项目（）对本文给予了资助，谨致谢意 四川师范大学学报（自然科学版）第卷参考文献 ，（）：，：，：，（）：，：（），（）：刘沙沙，付建平，郭楚玲，等微塑料的环境行为及其生态毒性研究进展农业环境科学学报，（）：，（）：?，：，：?，：，（）：王佳蕾，霍毅欣，杨宇聚乙烯塑料的微生物降解微生物学通报，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：何红，刘沛，罗贝旭，等一株降解淀粉填充聚乙烯放线菌的筛选以及诱变选育四川师范大学学报（自然科学版），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，：，：第期张榕麟，等：聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基因的克隆与表达分析 ，?，：，（）：，（）：，（）：杨稢，宋东辉一株不动杆菌降解石油烃的特性及关键烷烃降解基因分析微生物学通报，（）：刘环铜绿假单胞菌降解烷烃的分子机制研究上海：上海交通大学，：，（，）：（），（），：；（编辑刘刚）