光电比色检验基础知识.doc

光电比色分析仪的基本知识概述： 北京普朗公司的现有主要产品都是体外诊断医用设备（IVD产品），在医疗器械分类目录中该类产品的管理类别是6840-类。其注册工作由省级或直辖市药监局管理。是医院、卫生防疫站、血站、妇幼保健站等临床实验室及食品安全、动物检疫及科研实验室对样本进行检验的仪器。 本公司现有主要产品属于光电比色分析仪器。仪器工作时检测到的原始信号是一个光信号，通过分析计算得到最终检验结果。因此光学系统的好坏对仪器的质量起着决定性的作用。下面首先介绍一下光电比色的基本知识。一 光电比色检验的基本知识光电比色检验是指利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量的分析方法。它具有灵敏、快速、简便等特点，是生物化学分析中最常用的分析技术之一。1.1 物质的溶液对光的选择性吸收现象 物质的溶液为什么会有颜色，人看到的不同颜色，是不同波长的光对人眼睛产生的不同视觉效应。不同物质的溶液，只吸收与之对应的某个波长的光子能量，因此每种物质的溶液都有自己特定吸收光谱，即某种物质对某种波长的光有最大吸收（吸收峰），而对其他波长的光几乎不吸收或很少吸收，人看到的溶液颜色只是未被吸收的可见光。因为不同物质的溶液，只吸收不同波长的光，所以人眼会看到不同物质的溶液呈现出不同的颜色。互补光：例如，紫（400430）与绿(500560)；兰(430450)与黄(560590)；青(480500)与红(620700)，互为互补光。如果看到的溶液是兰色，则溶液吸收的一定是黄色光。 紫外光：小于400nm 红外光：大于760nm1.2 比色原理： 由于物质溶液颜色的深浅，是随溶液浓度的改变而改变，浓度越大，颜色越深。所以可以根据溶液颜色的深浅，来判定有色溶液浓度的大小。a) 目视比色：即将待测溶液与已知浓度水平的，相同物质的标准溶液进行颜色比较，根据标准液的已知浓度和颜色深浅，从而判定待测溶液中所含待测物质的多少，达到进行定性分析和定量检验的目的。举例：目视比色法。b) 光电比色法: 显然目视比色法只能大概判定浓度，不能准确定量。为了解决准确定量的问题，科学家创建了光电比色检测法，用光电探测器代替人的眼睛，进行比色检验。 c) 不同物质的吸收光谱曲线：下图是用分光光度计测得的A、B、C三种物质的吸收光谱曲线，可以看到A物质在390nm处有一吸收峰，而C和B在此处无吸收，由于A物质在390处具有高的吸收，因此用390波长的光检测该物质时，会得到很高的灵敏度。d) 工作波长：为了提高仪器检验的灵敏度，应该选择待测物质的吸收峰波长作为检验波长，这样只要待测溶液中含有被测物质，就会对入射光产生明显的吸收（检测信号）。如果浓度变化，则会引起对入射光的吸收（检测信号）产生明显变化。因此在上图中选择560nm波长作为检测波长，就容易测得C物质浓度变化引起的吸光度变化值，并依此计算出浓度值。 很显然如果需要检测A，B的浓度，则应分别选择390nm,470nm作为工作波长。如果待测容器中既有A物质，又有B物质（伴随物），在需要检测A物质时，却选择了410nm作为工作波长，则必定受到B物质的干扰（因此时测得的吸光度值是A和B的总和）。e) 单色光：为了减少其它物质对检测的干扰，检测波长的光谱范围应该越窄越好（但光谱范围越窄，在同一光源的情况下，获得的光能量会越小，信号会越弱）。在检验仪器中，一般利用干涉滤光片（一个滤光片只提供一种波长）或者光栅（可连续选出不同的波长）来获得高纯度的单色光。（为什么要选择物质的吸收峰波长作为工作波长？） f) 常用生化滤光片透射光谱曲线示例： 常用标准生化滤光片的主要波长有：340, 380, 405, 450, 480, 492, 505, 510, 546,578, 620, 630, 700nm 等；中心波长误差为：1-3nm,半波宽度在612nm左右，最高透过率30%60%（可视需要而选定）。1.3 朗伯-比耳定律：如果不把吸光度和浓度建立起量的联系，仅有吸光度则没有任何临床意义。朗伯-比耳定律的创立，解决了吸光度与浓度量的内在联系，该定律是光谱化学分析的理论基础。 朗伯-比耳定律（光的吸收定律）：在一定条件下，当入射光一定时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度成正比。 表达式如下：A=KCL （1）其中：A吸光度；K吸光系数；C溶液浓度； L液层厚度（光在溶液中走过的路径）。C当液层厚度为1cm ，浓度单位为1molL 时，吸光系数K称为摩尔吸光系数，用表示。是物质的特征性常数。该定律的下列形式，为应用朗伯-比耳定律提供了方便： （2） I0 It 其中：Io：入射光信号强度；It ：透射光信号强度。仪器只要分别测得入射光信号和透射光信号，就可利用（2）式计算出待测液的吸光度。 除了溶液的浓度和温度以外，影响朗伯-比耳定律正常应用的主要仪器因素有：1.3.1 仪器信号不稳定产生的误差（随机因素）：Io和It在仪器上一般是分时测定的（双光路可同时检测Io和It），必须确保在测定It时，Io保持不变，这样才能保证计算出的吸光度A的真实可靠，这就对仪器的稳定性提出了很高的要求。 例如：酶标仪装配调试时一般将各路输出的入射光信号（对空AD值）调至27000左右，当待测液的透射AD值=270时：A=log27000/270=2.000（A）； 假如入射光信号由27000降至26900（降低1/270）时，若该待测物不变，透射AD值就会变为269，如果入射光仍按27000计算，则A=log27000/269=2.0016（A）。产生误差=0.0016A。此种情况下，仪器对空检测时就可能出现A=log27000/26900=0.0016（A）。即对空值不是为零，而出现0.0010.002的偏差值。1.3.2 背景干扰（本底噪声） 背景干扰信号是指除工作波长光源以外的因素引起检测器产生的输出信号（关掉工作光源后得到的输出信号，是杂光和电路噪声的共同影响，用Ib表示）。杂光干扰是指检测器接收到的工作波长以外的光引起的干扰。 在（2）式中，Io是入射光信号和背景信号的共同作用，It是透射信号和背景信号的共同作用。因入射光信号Io比较强，Ib比较弱有时可以忽略。而透射信号It可能很弱，甚至可能与Ib处于同一个数量级。可以看出Ib将对大吸光度（小透射信号）的检测产生明显影响，因此在（2）式的实际应用中，都在检测信号中将Ib扣除（仪器都设计了背景检测功能），扣除背景干扰的计算公式如下： （3） 所以仪器的工作稳定性和防干扰能力应给以充分关注（结构设计消除杂光、电路设计减少电磁、噪声干扰及软件设计）。 例如：0=7.5V,It=0.012V,Ib=0.007V, 不扣除Ib时：A=logI0/It=log7.5/0.012=2.796(A)； 扣除Ib时：A=logI0/It=log7.493/0.005=3.175(A)； 引起的吸光度偏差=0.379（A） 对光学检测系统的基本要求是： a） 确保检测光的能量（样本前、后）尽量被探测器全部接收； b） 确保非检测光（杂光）的能量尽量不被探测器接收。1.3.3空白吸光度干扰：空白吸光度(Ab)的定义：除待测物以外所有伴随物（含比色容器，溶剂，干扰物质等）产生的吸光度。为了克服伴随物对检验结果的干扰，应注意将空白吸光度从检测值中减掉即：待测物的实际吸光度值等于原始吸光度值减去空白吸光度值。空白吸光度(Ab)的引起的误差主要体现在小吸光度（小浓度含量）检测时举例如下：线性一点定标计算公式为：Cu=Au/As*Cs （其中：Cu:样本浓度，Au：样本吸光度；Cs:标准浓度， As:标准吸光度）如果As=1.3，Cs=100, Au=0.2；Ab=0.1;（Ab:试剂空白吸光度）不减去Ab时：Cu=Au/As*100=0.2/1.3*100=15.4； 减去Ab时：Cu=（Au-Ab）/（As-Ab）*100=0.1/1.2*100=8.333。两者计算出的样本结果几乎差一倍。1.3.4样本空白吸光度干扰：样本中除了待测物以外，还存在一些其他物质-样本基质，样本基质对检测光产生的吸光度叫样本空白吸光度，会对检测结果产生影响。为了消除样本中的干扰物质对检验的影响，可以在待测物与试剂反应之前，先检测一次，得到待测液的初始吸光度。待测物与试剂反应结束后，再检测一次，得到最终吸光度。最终吸光度减掉初始吸光度，得到待测物反应后的实际吸光度，这样就可以克服样本基质产生的干扰。生化仪检测时采用终点两点法是克服样本空白干扰的常用方法。1.3.5 为什么要进行双波长检测：当被检溶液混浊或存在较多的干扰物质时，测定时会出现光散射和非特异性光吸收，从而影响测定结果的准确性，此时可用双波长测定，以提高测定结果的准确性，即在临床检验时除了用吸收峰波长（主波长）对待测液检测外，再用一个偏离吸收峰波长的辅助波长检测一次，用两次检测值之差作为本次检测的结果（A=A主-A辅）。这种方法可排除每个待测样本中干扰物质的实际影响。辅助波长的确定原则应符合以下两点：a）待测物对辅助波长吸收很小，b) 干扰物质对辅助波长和主波长有基本相同的吸收。双波长测定在酶标仪检测中用得比较多（因其不易检测样本空白），同时还用来减少孔间差异的影响。 待测物吸收光谱 干扰物质吸收光谱 主波长 副波长双波长检测的作用： 双波长(di-wavelength)测定优点是消除噪音干扰;减少杂散光影响;减少样品本身光吸收的干扰。从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音，所以双波长检测应是同时进行的，同一时刻两种波长检测产生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰（但目前酶标仪无法实现）。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。1.3.6 扣除试剂空白的计算公式：A样=A原始-A空白 - = （4） 式中：Io-蒸馏水的透射信号值；I样-待测样品的透射信号值；I空-试剂空白透 射信号值； （4）式成立的前提是： Io在检测试剂和检测样品时保持不变。1.3.7待测溶液浓度的计算：根据比色原理，首先配制已知浓度的系列标准溶液，并在相同的条件下，分别测出标准溶液的吸光度（此即检验项目的定标过程）和待测溶液的吸光度，然后应用朗伯-比耳定律，即可计算出待测溶液的浓度。a) 如果在一定范围内溶液的浓度与其吸光度呈线性关系：利用公式（1），可推导出计算公式（3）： 因为标准品和样本是相同物质，并且在相同条件下检测，所以由： As=K.Cs.L Au=K.Cu.L 有： (3) 扣除试剂空白吸光度时的计算公式：式中：Cu:样本浓度，Au:样本吸光度；Cs:标准品浓度，As:标准品吸光度；Ab：空白吸光度b) 如果溶液的浓度与其吸光度呈非线性关系时，可先配制系列浓度的标准液，并分别测出对应的值（非线性多点定标），画出浓度-吸光度的标准曲线(或求出标准方程)。当测得待测液的A值后，即可在标准曲线上查出（或计算出）对应的浓度值。仪器是根据浓度与其吸光度呈现的不同相关关系，采用不同数学模式进行拟合计算的。常用的拟合计算方法包括：直线法、点对点法、线性回归法、半对数回归法、全对数回归法、比值回归法、比值半对数回归法logit-log法、二次方、三次方曲线、三次样条函数、4参数方程法等多种拟合方式。（以上计算方法均已经应用在各有关产品上，用时可借鉴。）检验定标的标准曲线有两种：1） 不同浓度值与对应吸光度的标准曲线：可直观分析浓度值与对应吸光度的相关关系；2） 回归标准曲线（实为直线）：可直观分析实测点与回归直线的偏倚情况（r），适于临床检验时使用。但对研发试剂的厂家回归标准曲线不太适用，厂家更需要浓度值与对应吸光度的标准曲线。1.3.8光电比色仪器的基本结构组成：光电探测器比色皿光源、吸热玻璃单色器滤光片输出显示器电信号处理系统 后分光 如果把单色器放在比色皿的后面，称为后分光。无论是前分光，还是后分光，光电探测器接收到的光信号，都是待测物的吸收波长（工作波长）信号。 6. IVD产品的常用技术指标1）工作波长：波长范围：仪器允许选用的工作波长范围（酶标仪：一般为400800nm，生化仪：300800nm），波长范围主要决定于仪器光学系统的材料如：吸热玻璃、蓝光玻璃、光纤、光电池。中心波长误差：仪器的实测中心波长与标称波长的误差（1nm-2nm-3nm）。单色光半宽度：中心波长辐射强度的50% 对应的波长范围(12nm-10nm-8nm-6nm)。 Imax50%Imax 波长 1 0 2 半宽度=21 ；中心波长：0 =（12）/22）吸光度范围：仪器可靠输出的吸光度最小值到最大值的范围，该范围主要决定于仪器的设计水平，临床常用范围在0.000-2.000A之间，（仪器可达0.000-4.000A）；3）正确度（trueness）：仪器大量测量的均值与被测量真值的接近程度（是系统因素影响的结果，不正确度用%数表示）。4）准确度（accuracy）/精确度：仪器一次测量的结果值或有限次测量的均值，与被测量真值的接近程度，是系统因素和随机因素的综合影响，不准确度可用偏倚表示。（ 有人把准确度称为精确度或简称为精度，因容易与精密度混淆，现在已经不提倡）。5）精密度(precision)：在规定条件下，对同一待测物进行多次重复检测时，得到的单个（独立）测量结果之间的接近程度，是随机因素影响的结果（不精密度一般用变异系数CV表示）。6） 重复性(repeability)：在相同条件下（时间、方法、操作者、仪器、实验室等），获得的精密度；（适用于仪器检定）7）重现性(reproducibility)：在不同条件（见上）下获得的精密度（适用于室间质评）。8）灵敏度：在比色分析仪中，是指被测物浓度变化引起的仪器检测信号（吸光度）的变化值的大小。灵敏度低时，低值的检测准确度差。灵敏度太高时，检测范围会变小。9）检出限：是指仪器能正确检测出的分析物的最小浓度量值 。10）特异性：指的是分析方法只确定分析物，而对其它相关的物质不起作用的能力。11）分辨率：指仪器输出数据的精度水平，一般为0. 001A。12） 线性范围：指检测信号与分析物浓度之间呈线性（斜率为常数）关系的范围。线性误差在比色分析仪中，指对同一待测物的不同浓度溶液分别进行检测，测得的各单位浓度吸光度值相对于预期值（一般为平均值）的误差，一般用%数表示。13）干扰：除了分析物以外，其它伴随成分的影响或某一组分对测量准确度的影响。14）回收率：指把已知量分析物质加入到真实样本中，分析方法能正确地测量出分析物质的能力。7. 几个临床检验用语1真阳性：待测样本实际为阳性，检验结果也是阳性时，称真阳性。2假阳性：待测样本实际为阴性，检验结果却为阳性，称假阳性。3真、假阴性：类同1、2。4. 杯空白（板空白）：空比色容器（反应杯、比色皿、酶标板）本身产生的吸光度。5. 水空白：比色容器内加入蒸馏水后，测得的吸光度。6. 试剂空白：比色容器内加入试剂后，测得的吸光度。7 动态反应曲线：启动仪器对待测物的检测后，将在整个检测过程中得到的数据，按照时间顺序用点描绘出的曲线（如酶动力学曲线、血沉动态曲线）。8 正常参考范围：根据临床实际检验统计出的正常（健康）人的待测物浓度范围。9参考值判断：将待测样本的实际检验结果与正常参考值相比较，作出正常或异常的判断，如：过高（）、过低()。10. 医学决定水平：它是通过综合分析参考值与病理值的分布范围，即医生的临床经验制定的，作为临床按照不同病情给于不同处理的指标阈值（例如：待诊值、确诊值、危急值等）。能使实验诊断更好的发挥指导作用。例如：血清葡萄糖（mmol/L）的医学决定水平值有：2（低血糖危急值），6.5（可疑），10.0（高血糖）；22.2（高糖危急值）。美国临床正常参考范围是：3.3-5.3，我国目前是：3.1-6.1。不同国家，不同地域，不同人种的医学决定水平值也有差异。校准品和质控品的标称值一般应选在医学决定水平附近。11. 标准品：传统的标准液用纯水配制，同血清相比，成份非常简单。此时在将样品同标准品相比较时，引入了基质效应。标准品的标定值由称量法和容量法计算确定，决不可将用仪器实测值替代修正，标示值与检测系统无关。12. 校准品校准品大多来源为人样品的混合物，如混合血清。本身内含被检分析物，定值时刻添加某些分析物，增加含量。校准品中被检分析物的含量无法由称量法和容量法确定，只能依赖于分析方法。校准品的校准值取决于分析方法和检测系统，所以标示值具有专一性。13 质控品质控品的来源同校准品大致相同，厂商可能会根据自己的要求添加了很多物质，此时有些物质的添加量常常达到病理状态的高浓度，在应用于某一项目时，对这个项目来说基质效应将更大。质控品定值范围是由厂商联合几家使用同样检测系统的临床用户，经多次测定得出的均值。如果将该质控品应用于另一个检测系统，由于方法学的不同，可能得出同厂商给出值有较大差异的值，此时不能认为该检测系统的准确度不佳（标示值也具有专一性）。14 检测系统：检测系统包括测定原理、仪器、试剂、校准品，质控品、操作程序、质控程序、操作者等。有人把测定原理、仪器、试剂、校准品称为四要素，四要素中任何一个不同，都可以认为是不同的检测系统，所以每一个检测项目组成一个检测系统。15 SOP文件SOP是标准操作程序(Standard Operation Procedure) 的英文首字母缩写。SOP是对一个过程的描述，不是一个结果的描述。同时，SOP又不是制度，也不是表单。 SOP是一种标准的作业（操作）程序。所谓标准，即不是随便写出来的操作程序，而一定是经过不断实践总结出来的在当前条件下可以实现的最优化的操作程序设计。就是尽可能地将相关操作步骤进行细化，量化和优化，细化，量化和优化的度就是在正常条件下大家都能理解又不会产生歧义9