DB62∕T 4485-2021 葡萄抗寒性评价规范(甘肃省).pdf

ICS65.020.20CCSB15DB62DB62/T44852021葡萄抗寒性评价规范2021-12-30发布实施2022-02-01甘肃省市场监督管理局发布DB62/T44852021刖本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由甘肃省农业农村厅提出并监督实施。本文件由甘肃省果树果品标准化技术委员会归口。本文件起草单位：甘肃农业大学、甘肃夏博岚葡萄种植有限公司、武威市林业科学研究院、甘肃武威国家农业科技园区管委会、甘肃莫高实业发展股份有限公司、甘肃紫轩酒业有限公司。本文件主要起草人：毛娟、马宗桓、陈胜、牟德生、高静涛、陈佰鸿、赵彦红、郭锐。本文件为首次发布。各单位或个人在执行本文件过程中如发现需要修改和补充之处，请随时将意见和建议反馈至葡萄抗寒性评价规范地方标准编写组（地址：甘肃省兰州市安宁区营门村1号，邮编：7370,联系人：毛娟，E-mail：，联系方式：13659425539)，以供今后修订时参考。IDB62/T44852021葡萄抗寒性评价规范1范围本文件规定了葡萄抗寒性评价方法、评价指标及分级标准。本文件适用于甘肃省河西走廊葡萄产区及其他同类葡萄产区。2规 范 性 引 用 文 件本文件没有规范性引用文件。3术 语 和 定 义F列术语和定义适用于本文件。3.1抗 寒 性植物对低温胁迫的抵抗和忍耐能力。3 . 2低温半致死温度在该温度时，植物达到半致死状态，当温度继续低于该温度时，植物所受的伤害将不可恢复甚至死亡。3.3自由水与细胞组分之间吸附力较弱，可以自由移动的水。3.4束缚水与细胞组分紧密结合而不能自由移动的水。4样 品 采 集 与 处 理4 . 1枝 条 采 集葡萄落叶后，采集发育成熟、无病虫害为害、粗度基本一致的1年生枝。将枝条剪成20cm的枝段，并用石蜡封闭其两端。采用流水冲洗枝条表面灰尘和附着物，再用蒸馏水冲洗35次。用滤纸吸干表面水分，装入塑料自封袋中，置于0C4C冰箱中保存备用。4 . 2材 料 处 理采用_40C低温对枝条进行低温处理，设0C-15C-18C-21C-24C-27C-30C-33C共8个梯度，升温和降温幅度为4.0C/h5.0C/h,达到设定温度保持12h温度回升至室温(25C),从冰箱取出并室温静置2h再进行电导率测定。每个处理重复3次，每次重复随机抽取810个枝段。DB62/T448520215抗寒相关指标测定5.1相对电导率测定3mm薄片，并混合均勾，准确称取0.50g放入10mL刻度离心管中，每个处理重复3次。力P8mL去离子水，抽气40min后摇勾，用电导仪测定其初始电导值R1,再将试管置于水浴锅中，沸水浴lh(封口），于室温下静置8h测其终电导值R2,按公式1)计算电解质渗出率（)。将低温处理后枝条，去除表皮，避开芽眼，剪成2R1yIX100%式中:相对电导率，用百分比表示R1初始电导值；R2终电导值。y5.2Logistic方程及半致死温度测定用SPSS统计软件对不同处理温度与相对电导率之间的关系进行非线性回归分析，用Logistic方程拟合，按公式2)计算。Ky=l+ae-式中:处理温度；相对电导率饱和值，用百分比表示；方程参数。为了确定ab的值，将logistic方程转换为ln(k-y)/y=nabx=ln(k-y)/y,则原方程转变为，可在实际测定值中选择2点，求得aMI将logistic方程求二阶导数，d2y/d2x=kabe_bx(abebxb)/(l+则abe_bx-b=0,x=lna/b,此时x值为曲线的拐点，即为低温半致死温度(LT50)。Kabbxy=lnabx)3,当d2y/d2x=0时,ae5 . 3丙二醛MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸TBA)法测定MDA含量。取低温处理后枝条，去除表皮，避开芽眼，剪碎，混匀备用。在冰浴研钵中加入低温处理并剪碎的枝段0.2g1.0g石英砂和10%三氯乙酸TCA)2mL,研磨成匀浆，再力D3mL10%的TCA同转入离心管中，在40rpm下离心10mm,取上清液2mL(对照加2mL蒸馏水），加入2mL0.6%TBA摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸10mm(自试管中溶液出现小气泡幵始计时），取出试管以冷水浴迅速将试管内溶液冷却，在3000rpm下离心10定上清液在450nm532nm和6nm波长的光度值（对照为2mL0.6%TBA溶液加2mL蒸馏水），依据公式3)计算MDA的含量jimol/g)。MDA(umol/g)=6.45x(A532-A600)-0.56xA450 xV1/(V2xFW)，使用分光光度计分别测丄mm(3)式中:提取液总体，单位为毫升mL);-样品鲜重，单位为克g),VIFW2DB62/T44852021测定用提取液体积，单位为毫升（mL)。V25.4游离脯氨酸含量测定5.4.1标准曲线的绘制在分析天平上精确称取25.0mg脯氨酸，倒入小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250mL容量取6个50mL容量瓶，分别盛入脯瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准溶液中每毫升含脯氨酸100氨酸原液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL和3.0mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/mL、2ug/mL、3ug/mL、4ug/mL、5ug/mL和6Pg/mL。再取6支试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30mm。冷却后各试管准确加入4mL甲苯，震荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液，用移液器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色，根据吸光值和脯氨酸浓度拟合出回归方程，并绘制标准曲线，计算2mL测定液中脯氨酸的含量（jig/mL)。ug。5.4.2游离脯氨酸的测定与计算加入低温处理并剪碎的枝段0.5g，分别置于大试管中，然后向各试管中分别加入5mL3%横基水杨酸溶液，在沸水洛中提取10mm(提取过程中要经常摇动），冷却后过滤至干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2mL提取液于另一干净的具塞试管中，加入2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30mm，溶液即成红色。冷却后加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，取上层液至10mL离心管中，3(0111111下离心5111111。用移液器轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色皿中，以甲苯为空白对照，测定520nm波长的吸光值。根据回归方程计算出2mL测定液中脯氨酸的含量（Ug/mL)，根据公式（4)计算样品中脯氨酸含量的百分数。2.5X单位鲜重样品的脯氨酸含量（)=x100%样品重X106式中:游离脯氨酸的含量，单位为微克每毫升（Ug/mL)X5.5可溶性糖含量测定5.5.1标准曲线的制作1%蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80C下烘至恒重，精确称取1.0g。加少量蒸馏水溶解，转入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1%蔗糖标准液lmL加入lOOmL容量瓶中，加水至刻度。取20mL刻度试管II支，从010分别编号，按照表1加入溶液和水。表1可溶性糖标准曲线试剂M管号试剂01、23、45、67、89、10100陴/L蔗糖溶液/mL00.20.40.60.81.0水/mL2.01.812.61.41.21.0鹿糖量/g0204060801003DB62/T44852021然后按顺序向试管中加入0.5mL蔥酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中1mm，取出后自然冷却至室温，以空白做参比，在630nm下测其吸光值，以吸光值为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。5.5 . 2可溶性糖的提取加入低温处理并剪碎的枝段0.2g，分别放入3支刻度试管中，加入蒸馏水10mL，封口后沸水浴30min,取出冷却，过滤并转入25mL容量瓶中，用蒸馆水多次冲洗残渣后定容至刻度。吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中，加入蒸馏水1.5mL,之后的操作步骤与标准曲线制作相同，测定吸光值，计算可溶性糖含量，可溶性糖含量按照式（5)计算。从回归方程求得糖的量x提取液量x稀释倍数吸取样品液的体积可溶性糖含量()=x100%(5)样品干重X1065 . 6枝条水分含量测定5.6.1总含水量测定取称量瓶3个（3次重复），依次编号后准确称其重量，迅速称取低温处理并剪碎混匀的枝条薄片约1.0g置于称量瓶中，称量此时称量瓶的重量，再将称量瓶放进烘箱，106下烘20mm，然后在85下烘干至称量瓶重量不再发生变化。取出冷却至室温后测定称量瓶重量，按式（6)计算枝条中水分含量。植物总含水量()=(mlm2)/(mlm0)x100%式中：mO称量瓶重量；未烘干枝条及称量瓶重量;m2烘干后枝条及称量瓶重量。ml5.6 . 2自由水的测定另取3个称量瓶（3次重复），编号后准确称重，迅速称取剪碎混匀的枝条薄片约1.0g置于称量瓶中（提前记录称量瓶重量），记录称量瓶和样品的重量，然后在称量瓶中加入质量分数为65%分析纯蔗糖溶液5mL，准确称量此时称童瓶的重量。将称量瓶在室温下放置6h，期间进行遮光并轻轻晃动。用阿贝折射仪分别测定原来的糖液浓度和浸泡过样品后的蔗糖浓度，按照公式（7)、公式（8)计算出枝条中自由水和束缚水的含量。轵ds度-浸枝后糖液的浓度輪泞重X-,2杈后的糖液浓度自由水含量（)=x100%汶条鲜重束缚水含量（)=组织总含水量-自由水含量在测定枝条不同含水量时，为了提高测量的精确度，在剪碎和称重时应迅速，称童瓶笔子必须密封。6综 合 评 价根据测得的半致死温度，丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖和水分含量，利用隶属函数法进行综合性分析。抗寒性综合评价隶属函数按照公式（9)、公式（10)计算。4DB62/T44852021Xij-Xjmin(9)Uij=XjmaxXjmin式中:1种类j指标的抗寒隶属函数值;1种类j指标的测定值；所有种类j指标的最小值；-所有种类j指标的最大值；-某个品种；-某指标。UijXiJXjmmXjmaxXij-XjminUij=1-(10)XjmaxXjmin公式（9)、公式（10)分别表示正相关和负相关。7抗寒性对每个样本半致死温度，丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖、自由水及束缚水等指标的隶属度求平均值，根据平均隶属度，对照表2获得不同样本的抗寒性。表2葡萄抗寒性分级各指标平均隶属度分级类型高抗寒（HR)0.701.00抗寒（R)II0.600.69中抗寒（MR)III0.400.59低抗寒(LR)V0.300.39不抗寒S)V0.000.295