基于上转换-磁分离免疫荧光法检测蔬菜中的多菌灵.pdf

为了能够快速检测出黄瓜和洋白菜中的多菌灵残留，基于性能良好的上转换纳米材料 NaYF4：Yb，ErSiO2NH2，构建上转换-磁分离免疫荧光法并对样品前处理过程进行优化，建立了对 2 种蔬菜中多菌灵的快速高效检测方法.选取市售黄瓜和洋白菜作为检测样品，经过乙腈提取、盐析、净化、PBS 稀释等处理基本消除基质影响，采用上转换-磁分离免疫荧光法对样品中的多菌灵残留进行检测，并与 HPLC 法进行比对.结果表明：在最佳工作条件下，上转换-磁分离免疫荧光法中，黄瓜和洋白菜样品的前处理时间分别为 10 min 和 8 min，回收率分别为 83.2%86.8%?和 86.3%89.4%，检出限均为 0.5 g/kg.上转换-磁分离免疫荧光法对黄瓜和洋白菜的检测结果与 HPLC 检测结果一致，表明该方法准确性良好，可以实现蔬菜中多菌灵残留的快速灵敏检测.关键词：多菌灵；上转换纳米材料；磁分离；免疫荧光法中图分类号：S481文献标志码：A文章编号：1671-1114（2023）03-0040-06收稿日期：2022-04-17基金项目：国家自然科学基金资助项目（31301487）；天津市科委基金资助项目（18JCQNJC84400）.第一作者：赵凌燕（1997），女，硕士研究生通信作者：宋洋（1983），女，副教授，主要从事食品安全检测方面的研究 E-mail：.多菌灵（carbendazim，CBZ），化学名称 N-（2-苯并咪唑基）-氨基甲酸甲酯，是一种苯丙咪唑类杀菌剂，常用于黄瓜和洋白菜成熟期，可防止由真菌引起的病害.多菌灵降解速度慢，残留量大，可长期存在于环境和食物中，引起人体内分泌紊乱，造成肝脏损伤甚至患癌1-2.国内外对多菌灵在农作物中的最大残留限量做出了明确规定：GB 27632019 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量3规定，多菌灵在黄瓜和洋白菜中的最大残留量分别为 2.0 mg/kg 和 0.5 mg/kg；日本规定多菌灵在黄瓜和洋白菜中的最大残留量分第 43 卷第 3 期2023 年 5 月天 津 师 范 大 学 学 报（自 然 科 学 版）Journal of Tianjin Normal University（Natural Science Edition）Vol.43 No.3May 2023doi：10.19638/j.issn1671-1114.20230307第 43 卷第 3 期别为 3.0 mg/kg 和 0.5 mg/kg4；欧盟规定蔬菜中多菌灵的最大残留量为 0.1 mg/kg，要求相对较高5.近年来，多菌灵污染日益严重，针对食品中的多菌灵残留问题，科研人员建立了一些色谱和快速检测方法.2018 年陈楠等6建立了液相色谱-紫外检测串联柱后衍生荧光法，利用 QuEChERS 技术进行样品前处理，实现了番茄、葡萄等共 8 种蔬果中多菌灵残留的检测，样品检出限为 0.01 mg/kg，检测时间约为 2.5 h；2020 年张玉换等7建立了超高效液相色谱-串联质谱法，利用固相萃取技术进行样品前处理，实现了植物油中多菌灵残留的检测，样品检出限为 0.3 g/kg，检测时间约为 1.5 h；2021 年毛江胜等8建立了气相色谱-质谱联用法，利用减压浓缩法进行样品前处理，实现了梨中多菌灵残留的检测，样品检出限为 0.001 mg/kg，检测时间约为 1 h；2021 年万宇平等9研发了多菌灵胶体金快速检测试纸条，采用匀浆萃取法进行样品前处理，实现了干、鲜烟叶中多菌灵残留的检测，干烟叶的检测限为 2.0 mg/kg，鲜烟叶的检测限为 0.3 mg/kg，检测时间为 15 min.尽管色谱仪器的检测灵敏，但其前处理相对繁琐，耗时较长，而试纸条法虽操作简单但灵敏度又不高.因此，建立灵敏、高效且便捷的多菌灵检测方法具有重要的现实意义.本研究基于上转换-磁分离免疫荧光原理，应用本实验室合成修饰后的光化学性能稳定的上转换纳米材料 NaYF4：Yb，ErSiO2NH2，拟建立黄瓜和洋白菜中多菌灵残留的快速检测方法，并实现实际样品的测定.通过对样品提取、净化方案和稀释倍数等条件的优化和筛选，消除基质影响，用添加回收实验和高效液相色谱比对实验验证该方法的灵敏度和准确性.1材料与方法1.1材料与试剂上转换纳米材料 NaYF4：Yb，ErSiO2NH2，本实验室制备；聚苯乙烯磁性微球，天津市倍思乐色谱技术开发中心；N-丙基乙二胺（PSA），天津博纳艾杰尔公司；多菌灵，加拿大 TRC 公司.1.2仪器与设备980nm 激发器、荧光分光光度计，美国 PerkinElmer公司；高效液相色谱仪，美国 Thermofinnegan 公司.1.3上转换-磁分离免疫荧光检测法的建立以 anti-CBZ-NaYF4 Yb，ErSiO2NH2为信号探针，以 CBZ-OVA-MNPs 为捕获探针，基于多菌灵与捕获探针表面的包被原互相间接竞争结合信号探针表面抗体后，磁分离捕获探针-信号探针的偶联物，用荧光分光光度计测定偶联物中 UCNPs（上转换纳米材料）的荧光强度，通过公式计算多菌灵在不同质量浓度下的荧光强度差，以多菌灵质量浓度的对数值为横坐标，以荧光强度差值（I）为纵坐标，绘制多菌灵标准曲线.用甲醇溶解稀释多菌灵标准品，配制质量浓度分别为 0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 g/L的系列标准溶液，依次加入捕获探针 120 L 和信号探针 200 L 于 5 mL 离心管中，25 反应 1 h，磁分离收集沉淀，PBS 清洗沉淀复合物.用 50 L 的 PBS分散捕获探针-信号探针复合物，在 980 nm 激发光源下测定荧光值并通过公式计算荧光强度差值.I=I0-I1（1）式（1）中：I 为加入不同浓度多菌灵时体系的荧光值（I1）与无多菌灵时体系的荧光值（I0）之差.上转换-磁分离免疫荧光法的最佳工作条件：多菌灵抗原的添加量为 80 L，多菌灵抗体的添加量为100 L，捕获探针的添加量为 120 L，信号探针的添加量为 200 L，缓冲液中甲醇的体积分数为 2.5%，钠离子浓度为 0.03 mol/L，反应体系的 pH 值为 7.4，孵育时间为 60 min.1.4盲样的制备从市场中随机选取黄瓜和洋白菜各 20 件，擦去表面附着物，通过高效液相色谱检测 40 件样品均未检出多菌灵.在 40 件空白样品中随机加入多菌灵，记录下加入多菌灵的样品份数，打乱顺序后重新编号1#40#，用本实验方法和高效液相色谱法同时进行检测，并记录下数据.1.5提取剂的选择适量乙腈可以提高多菌灵的提取率，乙腈浓度过高则会影响体系中抗原抗体的有效结合.配制体积分数分别为 2%、5%、10%的乙腈溶液和 15%的 PBS 缓冲液，进行竞争实验.1.6样品前处理1.6.1黄瓜的提取方法一：依照文献10的前处理方法并加以改进.整根黄瓜去柄，四分法切碎，混匀后搅拌机打碎.称取 2g 搅碎样品置于 15mL 离心管中，加入 4mL 乙腈，涡旋振荡 5 min，加入 1 g 氯化钠，涡旋振荡 3 min，4 500 r/min 离心 3 min，取上清液备用.吸取 2 mL 上清液，旋蒸至近干，甲醇溶液准确定容至 1 mL，0.22 m微膜过滤后保存待测.方法二：依照文献11的前处理方法并加以改进.称取 2g 匀浆于 10mL 离心管中，加入 2mL 乙腈，涡旋振荡1min.加入1g氯化钠和1g无水硫酸镁，涡旋1min，4 000 r/min 离心 4 min，0.22 m 微膜过滤后保存待测.赵凌燕，等：基于上转换-磁分离免疫荧光法检测蔬菜中的多菌灵41天 津 师 范 大 学 学 报（自 然 科 学 版）2023 年 5 月1.6.2洋白菜的提取方法一：依照文献12的前处理方法并加以改进.用对角线分割法将整颗洋白菜分成小块，充分混匀，搅拌机搅碎.称取 2 g 匀浆于 15 mL 离心管中，加入2 mL 去离子水和 2 mL 乙腈混匀，超声提取 15 min，加入 1g 氯化钠，涡旋 2min，4500r/min 离心 5min，取上清液待用.在装有 10 mg PSA 的离心管中加入 1 mL 上清液，涡旋 2 min，8 000 r/min 离心 2 min，0.22 m 微膜过滤后保存备用.方法二：依照文献13的前处理方法并加以改进.称取 1 g 匀浆于装有 0.4 g 无水硫酸钠和 0.1 g 无水乙酸钠的 10 mL 离心管中，加入 1 mL 醋酸/乙腈，振荡2 min，5 000 r/min 离心 3 min，取上清液于棕色瓶中，-20 保存备用.1.7稀释倍数的优化实验蔬菜样品中复杂的组分（蛋白质、糖类、色素等）会干扰残留农药的检测结果，样品稀释可以降低溶液中的基质浓度，进而降低样品的基质效应.选取黄瓜、洋白菜 2 种样品，用有机试剂提取目标物，分别用PBS 稀释 5、10 和 20 倍.1.8添加回收实验选取经过高效液相色谱检测不含多菌灵的黄瓜、洋白菜样品进行加标回收实验.在样品中分别添加高、中、低 3 个水平的多菌灵标品，使其含量分别为0.5、2.0、5.0 g/kg，按照 1.6 节中的方法获得样品提取液，消除基质影响，用本实验方法进行添加回收结果测定，每个含量水平重复 3 组.分别根据公式（2）和（3）计算加标样品的平均回收率和变异系数（CV）：回收率（%）=加标样品测定值加标量 100（2）CV（%）=标准偏差平均值 100（3）1.9比对实验1.9.1仪器条件Waters e2695 高效液相色谱仪主要由四通道在线真空泵、自动进样系统、2489 紫外可见光检测器和 C18柱（250 mm 4.6 mm，5 m）构成.检测波长为 300 nm，柱温为室温，流动相为甲醇和水的混合液（体积比为1 1），流速为 1.0 mL/min，进样量 20 L.1.9.2提取及净化将黄瓜和洋白菜样品按照 GB 27632014 附录 A规定取样，样品提取和净化参照中国国家标准方法GB 23200.172016.真空抽滤获得滤液后，加入 4 g氯化钠，振荡 5 min，静置 30 min，将上层有机相转移到圆底烧瓶中，调节旋转蒸发器，在 45 下浓缩有机相至近干.残渣溶解在 2 mL 乙腈中，0.22 m 微膜过滤.2结果与分析2.1标准曲线的绘制利用已建立的上转换-磁分离免疫荧光分析法检测不同质量浓度的多菌灵标品.未添加多菌灵时，体系荧光强度为 I0，添加不同质量浓度的多菌灵对应不同的荧光强度为 I1.以多菌灵质量浓度的对数为横坐标，荧光强度差值为纵坐标，绘制多菌灵荧光免疫分析方法标准曲线，如图 1 所示.标准曲线的线性方程为y=250.81x+407.35，相关系数为 0.998，表明在 0.251.2 g/L 范围内，多菌灵质量浓度的对数值与荧光强度差值呈现良好线性关系，线性回归显著，符合实际应用要求.根据标准曲线得出该方法的检测限为（0.075 0.003）g/L，灵敏度为（1.18 0.03）g/L.2.2乙腈耐受优化结果根据多菌灵的溶解性质，选择乙腈作为提取剂.配制体积分数分别为 2%、5%、10%、15%的乙腈溶液，测量不同乙腈体积分数下反应体系的 IC50值和 I0/IC50值，结果如图 2 所示.由图 2 可以看出，IC50值随着乙腈体积分数的增加先下降后上升；I0/IC50值则先上升后下降，在乙腈体积分数为 10%时达到最大，因此检测体系中添加乙腈的体积分数不应超过 10%.2.3稀释倍数的优化结果选取黄瓜、洋白菜2 种样品的提取液，用乙腈提取多菌灵，用 PBS 分别稀释 5、10 和 20 倍备用.以多菌灵的质量浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标绘制标准抑制曲线，结果如图 3 所示.由图 3 可以看出，当黄瓜和洋白菜样品均被稀释 10 倍时，标准抑制曲线与所建立方法的标准曲线相似，说明黄瓜和洋白菜样品被稀释 10 倍时可以基本消除基质干扰.图 1多菌灵荧光免疫分析法标准曲线Fig.1Standard curve of CBZ by immunofluorescence1 0008006004002000-1.5I=I0-I1LogCBZ/（ng mL-1）2.0-1.0-0.500.51.01.5y=250.81x+407.35R2=0.99842第 43 卷第 3 期2.4添加回收实验结果在黄瓜和洋白菜 2 种样品中分别添加 0.5、2.0、5.0 g/kg 的多菌灵标品，样品分别用 2 种方法进行前处理，经 PBS 稀释后用于样品测定.根据回收率公式和变异系数公式计算加标样品的回收率及变异系数，结果如表 1 所示.从添加回收的结果可以看出，黄瓜的 2种前处理方法中，方法一得到的添加回收率为 89.7%91.6%，检出限为 5 g/kg，前处理时间为 40 min；方法二的添加回收率为 83.2%86.8%，检出限为 5 g/kg，前处理时间为 10 min.尽管方法一的添加回收率更高，但为了缩短检测时间，提高效率，本研究选择方法二作为黄瓜样品的前处理方法.洋白菜样品也采用 2 种前处理方法，方法一得到的添加回收率为 91.9%98.6%，检出限为 5 g/kg，前处理时间为 30 min；方法二的添加回收率为 86.3%89.4%，检出限为 5 g/kg，前处理时间为 8 min.尽管方法一的添加回收率更高，但方法二检测时间更短，检测效率更高，故选择方法二作为洋白菜样品的前处理方法.优化后的前处理方法在可以提取出蔬菜中多菌灵的同时缩短了前处理时间，且 PBS 简单稀释后样品中的基质影响基本消除，在不影响方法灵敏度的同时节约了上转换-磁分离免疫荧光法检测蔬菜中多菌灵的整体时间，本方法整体检测时间约为 30min，相较于仪器方法更加快速简便.本方法的检出限为 0.5 g/kg，满足国家对于多菌灵残留限量标准的要求.相较于陈启镌等14建立的液相色谱法检测多菌灵，本方法检测时间更短，操作更简便且节约成本；相较于万宇平等9、占绣萍等15研制的胶体金试纸条检测多菌灵，本方法的检出限更低，灵敏度更高.2.5比对实验结果为了验证优化后本方法的准确性，采用上转换-磁分离免疫荧光法和高效液相色谱法同时测定黄瓜和洋白菜盲样中多菌灵的浓度.空白样品加标的液相色谱检测结果如图 4（a）所示，HPLC 方法与本方法的相关性如图 4（b）所示.多菌灵的相关方程为 y=0.9361x-0.062 6，R2=0.998 5，表明 2 种方法具有很好的一致性，上转换-磁分离免疫荧光法准确可靠，可用于真实样品中多菌灵的检测.2.6实际样品检测用本方法对制备好的盲样进行检测，结果如表 2所示.（a）黄瓜1 4001 2001 00080060040020000.01荧光强度多菌灵质量浓度/（g L-1）1000.1110PBS5 倍稀释10 倍稀释15 倍稀释1 4001 2001 00080060040020000.01荧光强度多菌灵质量浓度/（g L-1）1000.1110PBS5 倍稀释10 倍稀释15 倍稀释图 3样品稀释倍数的优化Fig.3Optimization of dilution ratio of samples表 1添加样品中多菌灵的回收率和变异系数Tab.1Recovery rates and CV of carbendazim in samples样品添加浓度/（g kg-1）方法一方法二平均回收率变异系数平均回收率 变异系数黄瓜0.589.76.983.26.12.090.43.784.93.45.091.62.686.81.9洋白菜0.591.95.986.34.82.098.64.389.43.95.094.83.287.12.7图 2提取剂的优化Fig.2 Optimization of extractant16141210862IC50/（g L-1）乙腈体积分数/%51015600550500450400350300250I0/IC50IC50I0/IC50（b）洋白菜赵凌燕，等：基于上转换-磁分离免疫荧光法检测蔬菜中的多菌灵%43天 津 师 范 大 学 学 报（自 然 科 学 版）2023 年 5 月注：x、y 分别为上转换-磁分离免疫荧光法和 HPLC 法测得多菌灵的质量浓度.表 2实际样品中多菌灵的检测Tab.2Determination of carbendazim in real samples样品样品编号多菌灵质量浓度/（g L-1）本方法HPLC黄瓜1#5#6#85.686.17#8#9#46.145.710#76.378.211#14#15#66.365.216#20#洋白菜21#24#25#46.148.726#28#29#66.566.930#36#37#85.484.338#40#（a）多菌灵液相色谱图0.0250.0200.0150.0100.00500响应强度t/min82413567由表 2 可以看出，采用本研究建立的方法，20 件黄瓜盲样中检测出 4 件阳性样品，其余为阴性样品；20 件洋白菜盲样中检测出 3 件阳性样品，其余为阴性样品.采用高效液相色谱法与本实验方法所得结果进行比对，二者所检测出的阳性样品件数一致，且多菌灵的质量浓度相近，这表明本实验建立的上转换-磁分离免疫荧光测定法准确性良好，可应用于蔬菜中多菌灵残留的快速检测.3结论本研究基于上转换-磁分离免疫荧光原理，优化了样品前处理方法，建立了蔬菜中多菌灵残留的快速检测方法.选取黄瓜和洋白菜 2 种蔬菜作为检测样品.黄瓜经乙腈一倍提取，加氯化钠和无水硫酸镁涡旋、离心，PBS 稀释 10 倍消除基质影响.洋白菜加入无水硫酸钠和醋酸钠，经醋酸/乙腈提取、离心、PBS 溶液稀释 10 倍，消除基质影响.2 种蔬菜样品的前处理时间均不超过 10 min，整体检测时间约 30 min.通过添加回收实验和高效液相色谱比对实验证明上转换-磁分离免疫荧光法准确可靠.黄瓜和洋白菜样品的检出限均为 0.5 g/kg，远低于蔬菜中 MRL 的国家标准.本研究建立的上转换-磁分离免疫荧光检测法与以往方法相比检出限更低，检测时间短，样品处理简便，稳定性高，可实现黄瓜和洋白菜中多菌灵的精准定量定性分析，大大缩短了检测时间，提高了检测效率.参考文献：1尚菲.双碳点比率荧光法检测果蔬残留多菌灵J.分析试验室，2021，40（6）：664-669.SHANG F.Detection of carbendazim residues in fruits and vegetablesby dual-carbon dots 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544第 43 卷第 3 期5徐信燡，施春雷.多菌灵的毒性及风险评估研究进展J.南方农业，2019，13（34）：40-44.XU X Y，SHI C L.Research progress on toxicity and risk assessment ofcarbendazimJ.SouthChinaAgriculture，2019，13（34）：40-44（in Chi-nese）.6陈楠，马世柱，姚德祥，等.基于 QuEChERS 前处理的液相色谱-紫外检测串联柱后衍生荧光法测定蔬菜水果中 13 种农药残留J.现代农业科技，2018（13）：116-117.CHEN N，MA S Z，YAO D X，et al.Determination of 13 pesticide re-sidues in vegetables and fruits by liquid chromatography UV detectiontandempostcolumnderivatizationfluorescencemethodbasedonQuECh-ERSpretreatmentJ.Modern Agricultural Science and Technology，2018（13）：116-117（in Chinese）.7张玉换，胡静，赵月钧.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定食用植物油中多菌灵残留J.浙江农业科学，2020，61（7）：1421-1423.ZHANG Y H，HU J，ZHAO Y J.Determination of mercarzole in ediblevegetableoilbysolidphaseextractionultrahighperformanceliquidchro-matographytandem mass spectrometryJ.Journal of Zhejiang Agricul-tural Sciences，2020，61（7）：1421-1423（in Chinese）.8毛江胜，陈子雷，李慧冬，等.4 种农药在梨中的残留及消解动态J.农药，2021，60（9）：668-673.MAO J S，CHEN Z L，LI H D，et al.Residue and digestion dynamicsof four 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