灌木铁线莲多倍体诱导与鉴定.pdf

第3 8 卷第3 期2023年7 月文章编号：2 0 96-47 49(2 0 2 3)0 3-0 3 3 8-0 7引文格式：刘志杰，郑妍，李明阳，牛伟康，刘冬云.灌木铁线莲多倍体诱导与鉴定J.林业与生态科学，2 0 2 3，3 8（3）：3 3 8 344.LIU Zhijie,ZHENG Yan,LI Mingyang,NIU Weikang,LIU Dongyun.Polyploid induction and identification ofClematis fruticosaJl.Forestry and Ecological Sciences,2023,38(3):338-344.林业与生态科学FORESTRY AND ECOLOGICAL SCIENCESDOI:10.13320/ki.hjfor.2023.0042灌木铁线莲多倍体诱导与鉴定Vol.38 No.3Jul.2 0 2 3刘志杰，郑妍，李明阳，牛伟康，刘冬云（河北农业大学园林与旅游学院，河北保定0 7 10 0 0）摘要：采用秋水仙素棉球处理法和琼脂处理法对灌木铁线莲进行诱变处理，以探究秋水仙素诱导灌木铁线莲多倍体的最佳条件和鉴定方法，成功获得了同源四倍体新种质（2 n=4=32）。研究结果表明，对于灌木铁线莲的秋水仙素诱变处理，棉球处理法要优于琼脂处理法。棉球处理法以0.2%0.3%浓度的秋水仙素下处理48 7 2 h的诱变效果较好，琼脂处理法在0.2%浓度下处理9 6 h的变异率最高，为2 0%。琼脂处理可通过延长处理时间增强诱变效果。秋水仙素处理过的植株生长发育较为缓慢、株高降低，叶面积、叶片气孔变大。在对嵌合体不同倍性细胞含量的分析中，采用图像分析技术对气孔鉴定法进行创新，获得的嵌合率与流式细胞仪的鉴定结果呈极强相关性，推测此方式在多倍体鉴定中具有应用价值。关键词：灌木铁线莲；秋水仙素；四倍体；气孔鉴定；嵌合率中图分类号：S603.6文献标志码：APolyploid induction and identification of Clematis f ruticosaLIU Zhijie,ZHENG Yan,LI Mingyang,NIU Weikang,LIU Dongyun(College of Landscape Architecture and Tourism,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China)Abstract:In order to explore the optimum conditions and identification methods of colchicine-induced polyploidy of Clematis fruticose,colchicine cotton ball treatment and agar treatmentwere used to mutagenize C.fruticosa.A new tetraploid germplasm(2n=4=32)was suc-cessfully obtained.The results showed that the cotton ball treatment was superior to theagar treatment for colchicine mutagenesis of C.fruticosa.The cotton ball treatment with0.2%-0.3%colchicine for 48-72 h had better mutagenic effect.The mutation rate of agartreatment at 0.2%concentration for 96 h was 20%,was the highest,and agar treatmentcould enhance mutagenic effect by prolonging treatment time.The plants treated with colchi-cine grew slowly,plant height decreased,leaf area increased,leaf stomata enlarged.In theanalysis of different ploidy cell contents of chimeras,image analysis technology was used toinnovate the stomatal identification method.There was a strong correlation between the chi-merism rate obtained and the results of flow cytometry,which suggested that this method收稿日期：2 0 2 2-0 7-0 3基金项目：河北省科技厅资助项目（12 2 0 2 56）。第一作者：刘志杰（1997-），男，河北唐山人，硕士研究生，研究方向为园林植物育种。通信作者：刘冬云（197 1-），女，河北石家庄人，副教授，硕士生导师，研究方向为地被植物资源收集及育种。第3 期had application value in polyploid identification.Keywords:Clematis fruticosa;colchicine;tetraploid;stomata identification;embedding rate铁线莲属（Clematis）隶属于毛科（Ranuncu-laceae)，冠有“攀缘植物皇后”的美称。尽管我国铁线莲属植物资源约占世界铁线莲植株总数的一半，但具有自我知识产权的品种寒寒无几2 。灌木铁线莲（Clematisfruticosa）广泛分布于我国北方地区,兼具耐寒性和耐旱性，对其种子萌发、幼苗生长及抗旱性等的相关研究表明灌木铁线莲能够较好的适应半干旱地区3-4。但由于对河北省野生铁线莲开发尚浅，未见其在园林景观方面的应用。秋水仙素诱导多倍体的方法被广泛应用于作物育种，多倍体植物一般表现出体量增大、抗逆性增强、生长旺盛等特点，其对环境的适应性更强，同时在遗传育种中更具可塑性5。秋水仙素已在林果、蔬菜、中草药等领域得到广泛应用，并在园林花卉领域培育出如金丝杜鹃（Portulaca sp.）、紫茉莉（M i r a b i l i s s p.）、金莲花（Tropacolum sp.）等多倍体植株，观赏价值显著提高6-7 。董娟利用秋水仙素诱导大叶铁线莲（Clematisheracleifolia）顶芽的方式得到四倍体植株，证明了铁线莲顶芽诱导的可行性8 。因此，可以通过秋水仙素诱导的方式培育灌木铁线莲多倍体，以提高其观赏价值和园林适用性，这对建设节水型园林具有重要意义。本试验利用秋水仙素棉球处理和琼脂处理的方法对野外采集的灌木铁线莲进行多倍体诱导，并对变异植株进行鉴定和筛选，以期得到灌木铁线莲多倍体植株和更加高效的多倍体诱导与鉴定方式，为铁线莲属植物新品种的创制提供参考和基础材料。1材料与方法1.1材料灌木铁线莲种子于2 0 2 0 年10 月采摘于张家口涿鹿县鲍家口村（E115227.53，N40 0 52 0.59），选取成熟度90%以上的铁线莲种子在室温下保存。于2 0 2 0 年11月进行播种，诱变处理前于河北农业大学教学温室进行常规管理。1.2方法1.2.1秋水仙素棉球处理与琼脂处理待幼苗顶芽开始生长时进行诱变试验，时间为当日8：0 0，每个处理50 株植物。棉球法参考赵建华的方法，补充溶液时间为每日8：0 0、13：0 0、18：0 0，处理时间为刘志杰，等.灌木铁线莲多倍体诱导与鉴定结果与分析2.1不同秋水仙素处理对灌木铁线莲形态指标的影响不同秋水仙素处理下灌木铁线莲的形态指标，见表1、图1。33924、48、7 2 h，秋水仙素溶液浓度为0.1%、0.2%、0.3%;琼脂处理参考李灵娇的方法，配制的秋水仙素琼脂溶胶浓度为0.2%，处理时间为2 4、48、7 2、96h9-10,1.2.2形态学鉴定幼苗生长50 d后，在每个处理组中各随机挑选10 株，记录叶片数量，测量株高1。为保证植株的生长量和数据的可靠性，统一选取植株生长的第4片叶片作为样本进行指标的测量，用相机扫描后导入电脑，测量叶长、叶宽和叶面积。1.2.3染色体计数鉴定采用茎尖低渗压片法对变异株进行初步鉴定，每个处理取2 0 株植物，记录视野内染色体数量加倍的情况，用LeicaDM4000显微镜观测茎尖细胞染色体数量并记录12 1.2.4流式细胞仪鉴定选取染色体计数鉴定成功的50 株植物成熟叶片进行DNA含量的测定。所用仪器为LSRFortessa型流式细胞仪（美国BD公司）。用流式细胞仪CellQuestPro软件采集并处理数据。1.2.5气孔鉴定法与图像分析技术的结合应用通过染色体计数和流式细胞仪的鉴定后，采用指甲油涂抹撕取法，观察变异株的气孔大小，以达到间接证明变异植株与对照组植株染色体倍性差别的目的13-14。在LeicaDM4000显微镜10 X20倍镜下观察气孔大小、记录气孔数量。在气孔鉴定的基础上，对植株气孔的图像信息进行软件分析，以气孔长度和气孔宽度的增大量都超过二倍体的5%为标准，记作增大气孔，计算增大气孔的嵌合率（以下称气孔嵌合率）15。气孔嵌合率=增大气孔数量/气孔总数。1.3数据统计与分析使用SPSS、W PS、D i g i m i z e r 图像分析软件对试验结果进行统计分析和图表的绘制。2340处理方式TreatmentConcentration棉球0(CK)0.10.10.10.20.20.20.30.30.3琼脂0(CK)0.20.20.20.2注：同列不同小写字母表示同一处理方式内不同秋水仙素浓度处理间存在的显著差异（P0.05。下同。出现叶片畸形的情况。棉球处理法中,在0.2%浓度中处理48、7 2 h以及在0.3%浓度中处理2 4h植株的株高与对照组相比分别降低了3.0 7%、2.13%、3.54%，差异不显著；其他处理与对照组相比降低了9.45%36.14%不等，差异显著。在0.2%浓度中处理2 4h时，叶长最高，与对照组相比升高了14.6 5%，差异显著；其次是在0.1%、0.2%浓度中处理48 h，植株（a）四倍体叶片(b）二倍体叶片(c）四倍体(d)二倍体图1清灌木铁线莲四倍体与二倍体形态特征对比Figure 1 Comparison of morphological characteristics oftetraploid and diploid of Clematis f ruticosa由图1、表1可知，秋水仙素处理的植物与对照组植株形态特征差异明显，主要表现为叶片宽大，植林业与生态科学表1不同秋水仙素处理下灌木铁线莲的形态指标Table 1 Morphological indexes of Clematis f ruticosa under different colchicine treatments浓度/%第3 8 卷时间/h株高/cmTimeHeight12.701.18a2410.981.00cd4811.500.96b7211.11 0.64c2411.260.65bc4812.311.60a7212.431.13a2412.251.89ab489.551.31de728.111.20e一9.951.16a249.170.95ab488.330.74b727.75 1.25b965.621.78c株矮化、节间距缩短，叶片颜色略深，同时部分植株的叶长与对照组相比分别升高了0.0 0%、3.18%，差异不显著。在0.2%浓度中处理7 2 h以及在0.3%浓度中处理2 4h，植株的叶长与对照组相比分别降低了4.0 3%、7.6 4%，差异不显著，其他处理的叶长与对照组相比降低了8.9 2%2 3.9 9%不等,差异显著。在0.1%浓度中处理7 2 h以及在0.2%浓度中处理2 4、48、7 2 h时的叶宽与对照组相比分别升高了2 3.15%、17.13%、3 9.3 5%、31.94%，差异显著；其他各处理与对照组相比差异不显著。在0.1%浓度中处理7 2 h以及在0.2%浓度中处理48、7 2 h的叶面积与对照组相比分别增加了17.92%、3 6.2 0%、3 8.53%，差异显著。在0.3%浓度中处理48、7 2 h时的叶面积与对照组相比分别降低了19.53%、2 4.0 1%，差异显著。植物生长受到了抑制，植物株高、叶面积2 项指标明显降低。叶长/cmLeaf length4.710.24bc4.170.19de4.710.19bc4.290.33d5.400.32a4.860.30b4.520.32c4.350.35cd3.580.18f3.910.26ef2.690.17c2.710.17c3.160.45a2.960.23b2.660.48c叶宽/cmLeaf width2.160.51cd2.25 0.12cd2.310.17cd2.660.62b2.530.22b3.010.74a2.850.40ab2.190.20cd2.440.24c2.020.22d1.550.23b1.560.13b1.990.40a1.950.52a1.560.20b叶面积/cmLeaf area5.580.35c5.680.35c5.680.32c6.580.86b6.510.85bc7.600.23a7.730.92a5.990.71bc4.490.73d4.240.60d2.210.37c2.820.81ab3.080.42a2.460.41bc2.360.48bc第3 期琼脂处理法中，随着溶液浓度的增高，植物的株高呈现逐渐下降的趋势，处理2 4h的株高与对照组相比降低7.8 4%，差异不显著；其他各处理依次降低16.2 8%43.52%，差异显著。处理时间为48、72h时，植株的叶长和叶宽显著高于对照组，其他各处理的叶宽与对照组相比差异不显著。处理时间Table 2Variation rate of shrub Clematis fruticosa under different treatments处理方式浓度/%TreatmentConcentration棉球0.10.10.10.20.20.20.30.30.3总计琼脂总计由表2 可知，秋水仙素浓度和处理时间均与变异率呈正相关，处理时间相同时，变异率随着浓度的升高有明显的增加。棉球处理法中，在0.3%浓度中处理7 2 h获得7株变异植株，变异率最高，为3 5.0%，植株生长情况较差；其次是在0.2%浓度中处理7 2 h和在0.3%浓度中处理48 h，变异率都为3 0.0%；其他处理的变异率都不超过2 0.0%。在处理浓度为0.2%，处理时间为2 47 2 h时，棉球处理获得四倍体植株11株，琼脂处理获得四倍体植株7 株，棉球处理的变异率比琼脂处理高57.1%。棉球处理共获得变异植株3 1株，占鉴定植株总数的17.2%。琼脂处理法中，在0.2%浓度中处理9 6 h获得4株变异植株，变异率为2 0.0%；其次是在0.2%浓度中处理7 2 h,变异率为15.0%。琼脂处理共获得变异植株11株，占鉴定植株总数的13.8%。刘志杰，等.灌木铁线莲多倍体诱导与鉴定染色体计数鉴定不同处理下灌木铁线莲的情况，见表2、图2。表2 不同处理下灌木铁线莲的变异率时间/h数量/株TimeNumber2420482072202420482072202420482072201800.2240.2480.2720.296341为2 4、48 h时，植株的叶面积与对照组相比分别增大了2 7.6 0%、3 9.3 7%，差异显著。处理时间为7 2、96h时，植株的叶面积与对照组相比分别增大了11.31%、6.7 9%,差异显著。2.2二倍体株数/株Diploid number19201819161416141314920182018201720168069四倍体株数/株Tetraploid number10214646731223411（a）二倍体植株染色体（b）四倍体植株染色体图2 细胞染色体计数Figure 2Cell chromosome count变异率/%Rate of variation5.00.010.05.020.030.020.030.035.017.210.010.015.020.013.810P278.0342由图2 可知，对照组植株染色体数量皆为16条，确定为二倍体植株（2 n=2=16），获得的变异植株的细胞染色体数目几乎都为3 2 条，极少数细胞的染色体数目多于或少于3 2 条，确定为四倍体植株（2 n=4=32）。在试验过程中发现，灌木铁线莲茎尖染色体计数方法的最佳取材时间为每日8:2 0、最40上3020100由图3 可知，利用流式细胞仪对灌木铁线莲叶片细胞进行细胞核DNA含量的测定，对照组植株表现出较为集中的峰型，其荧光强度吸收主峰值在50k位置处，变异植株荧光强度吸收主峰值大概为100k，为对照组的2 倍，可以确定为四倍体细胞。倍性Ploidy二倍体四倍体林业与生态科学佳解离时长为12 min，最佳染色时长为50 min（其他条件与试验计划相同），在此试验条件下，细胞分散较为均匀，染色体条数清晰可辨。2.3流式细胞仪鉴定流式细胞仪鉴定结果，见图3。40上302010050100相对荧光强度/kRelativefluorescence intensity（a）二倍体鉴定图像Figure 3 Results detected by flow cytometry表3 叶片气孔大小和数量比较Table 3Comparison of leaf stomatal size and number气孔长度/mLength of stoma40.901.02b55.840.87a第3 8 卷P114.1150200图3 流式细胞仪检测结果本次试验共检测了50 株经由染色体计数鉴定成功的植物，所测量植株均含有四倍体细胞。2.4气孔大小及密度对比鉴定2.4.1叶片气孔大小及密度对比及密度对比结果，见表3、图4。气孔宽度/mWidth of stoma27.051.10b35.351.51a250050Relativefluorescenceintensity（b）四倍体鉴定图像叶片气孔大小气孔密度/(个mm-)Number of stoma51.332.7a41.331.7b100相对荧光强度/k150200250（a）二倍体气孔图像（b）四倍体气孔图像图4叶片气孔大小比较Figure 4 Comparison of leaf stomatal size第3 期由表3、图4可知，对获得的变异植株进行气孔大小和数量的测量，以达到间接证明多倍体产生的目的。变异植株的气孔大小发生显著变化，气孔长度为55.8 4m，相较于对照组增大了3 6.53%；气孔宽度为3 5.3 5m，与对照组相比增大了30.68%。相同大小的视野内，四倍体植株气孔数量为41.3 3 个/mm，与二倍体植株相比减少19.48%。四倍体植株的各项气孔指标均与二倍体植株差异显著。2.4.2气孔嵌合率与嵌合率对比分析气孔嵌合率与嵌合率对比结果，见图5。1.21.00.8%/率号湖0.6F0.4F0.20.00气孔嵌合率；一线性（气孔嵌合率）；-线性（嵌合率）图5嵌合体的气孔嵌合率和嵌合率散点图比较Figure 5 Comparision fo stomatal chimerism rate andscatter plot of stomatal chmerism rate由图5可知，对嵌合体植株的气孔嵌合率和四倍体细胞嵌合率进行分析，二者拟合曲线相似，用距离一皮尔逊相关性分析对其相似性进行计算，可知2组数据的相关系数为0.9 0 7,呈极强相关性。试验结果表明，通过气孔嵌合率的分析来确定四倍体植株细胞嵌合率的方式具有一定的准确性。（相关系数：0.8 1.0 极强相关；0.6 0.8 强相关；0.40.6中等程度相关；0.2 0.4弱相关；0.0 0.2 极弱相关或无相关）。3讨论与结论3.1 讨论秋水仙素作为一种高效稳定的诱变剂，已广泛应用于各类植物的多倍体育种工作中，它通过作用于植物分裂中期的细胞，使细胞染色体加倍，从而获得多倍体植株16 。然而某一区间内植株分裂中期的细胞仅占细胞总数的1.7%左右，因此产生大量嵌合体植株，又因为多倍体细胞合成DNA的量更多，分裂速度远低于正常细胞，多倍体细胞在生长过程中往往处于弱势地位10 1。因此，获得纯合多倍体，多倍体细胞比例更高的植株具研究意义。3.1.1选择合适的材料和方式是诱变成功的重要刘志杰，等.灌木铁线莲多倍体诱导与鉴定y=0.077 3x-0.070 9R=0.9238AJ=0.0872x0.219 2R=0.823124343因素在被子植物中，处理幼苗顶芽是一种有效的方式，如罗思宝获得泸定百合多倍体、陆永林获得三叶橡胶多倍体、韩耀祖获得唐菖蒲多倍体都是通过处理植株顶芽分生组织的方式17-2 0 。本试验参考董娟对大叶铁线莲的研究，在琼脂处理的同时进行了棉球处理的研究，相同处理条件下对比发现，琼脂处理获得变异株5株，棉球处理获得变异株11株8 ；琼脂处理获得的变异株的嵌合率皆低于50%，而棉球处理获得了若干嵌合率在7 0%以上的植株，可见琼脂处理的诱变效应要弱于棉球处理。初步分析可知，一是由于棉球处理用量更加灵活、秋水仙素含量更高；二是灌木铁线莲幼苗顶芽对秋水仙素的敏感性较弱。对植物形态指标的观察可发现，相同处理条件下，琼脂处理对植物的损伤要小于棉球处理。由于琼脂处理中,琼脂球是一次性成型，无法在处理过程中补加秋水仙素，因此可通过增加处理时间来提高诱变率，在9 6 h之内秋水仙素都能68植物Plant公嵌合率；1012发挥作用。3.1.2变异植株嵌合率的测定方法当前对多倍体细胞嵌合率的测定几乎都依靠流式细胞仪，而因技术要求和经济成本较高，此方式不适用于大量的鉴定工作，大大限制了鉴定效率2 1。传统的鉴定方法包括形态学鉴定、气孔鉴定和染色体鉴定等，这些方法仅能在一定程度上证明多倍体细胞的产生，无法确定植株嵌合率，使筛选工作具有一定的不确定性。在多倍体鉴定工作中，气孔鉴定是根据多倍体气孔膨大的特点，从而验证多倍体细胞的产生，本试验在气孔鉴定过程中发现部分植株的气孔大小存在显著差异，进行合理推测可知，此类植株为嵌合体植株2-2 3 。对这类植株的各类气孔占比进行分析后发现，膨大气孔所占比例与多倍体细胞嵌合率呈极强相关性，证明此方式可为多倍体细胞嵌合率的测定提供有力参考。该鉴定方式不仅能够对多倍体细胞嵌合率进行分析，还具有简捷、经济的特点，在多倍体鉴定工作中具有重大实践价值。当前在多倍体的研究中尚未出现通过气孔计算嵌合率的方法，推测原因主要有2 点：一是此方式需要对大量气孔图像信息进行处理，工作效率和准确度得不到保证；二是仅根据气孔鉴定的方式确定变异率，无法保证鉴定准确度，缺乏说服力。而如今，图像信息技术发展迅速，可轻松使用各类图像软件进行批量化处理，提高工作效率。在育种工作中，此方法可作为多倍体细胞嵌合率测定的有力参考，帮助研究者在筛选工作中快速准确的定位更有选育价值的嵌合体植株。3443.2结论本试验利用秋水仙素对灌木铁线莲进行诱变处理，通过植株形态的变化及染色体计数鉴定、流式细胞仪鉴定等方式对变异植株进行筛选，得出较为适宜灌木铁线莲多倍体诱变的处理时间、浓度组合，并对多倍体鉴定的方式进行了新的尝试，得到以下结论：(1)通过对灌木铁线莲多倍体诱导方式和鉴定方法进行研究，成功获得了同源四倍体新种质（2 n4=32），筛选出了较为适宜的处理组合。对于棉球处理法，经染色体计数鉴定可知，秋水仙素的浓度为0.2%0.3%、处理时间为48 7 2 h时，多倍体变异率都高于2 0%，诱变效果较好，且最高达3 5%，秋水仙素浓度为0.1%的各处理下的变异率均低于10%，诱变率较低；对于琼脂处理法，秋水仙素的浓度为0.2%、处理时间为9 6 h时变异率最高，为20%。经过鉴定，确定获得的四倍体植株染色体条数为3 2 条（2 n4=32），流式细胞仪的鉴定结果也表明四倍体植株的核DNA含量增加了1倍。与二倍体植株相比，四倍体植株的气孔长度增大了36.53%，宽度增大了3 0.6 8，气孔密度减少了19.48，四倍体植株的气孔明显增大。在后续观察中发现，四倍体植株表现出生长发育较为缓慢、株高降低，叶面积、叶片气孔变大等典型多倍体形态特征。(2)秋水仙素棉球处理法具有秋水仙素用量可控、诱变效果强的特点,在试验过程中操作也更加简便，经过处理的植株表现出明显的“巨大化”特点，植物的观赏价值有了一定的提高。相同秋水仙素浓度下，棉球处理的综合诱变率比琼脂处理高57.14%。琼脂处理可通过延长处理时间增强诱变效果，但秋水仙素用量不可控制，植株死亡、诱变效果欠佳的情况较多。综合考虑可知，棉球处理法更适合灌木铁线莲的多倍体诱导。（3)研究发现，通过图像信息技术与气孔鉴定相结合的方式来确定增大气孔的嵌合率，可以在一定程度上反映植株多倍体细胞的嵌合率，通过该方式与流式细胞仪鉴定获得的数据曲线拟合度达0.907,呈极强相关性，证明该方式具有一定的准确性，因其所需设备条件和操作难度低，具有较强的实践应用价值。综上所述，秋水仙素棉球处理法和琼脂处理法都能诱导并产生灌木铁线莲多倍体植株，针对诱变结果的分析可知，棉球处理法要更适合灌木铁线莲的多倍体育种。试验获得的多倍体植株株高降低，叶面积，叶片气孔变大，表现出明显的“巨大化”的多倍体特征，具有一定的研究价值。利用图像分析与叶片气孔鉴定结合的方式对多倍体植株嵌合率进行林业与生态科学分析，证明了该种方式具有一定的准确性，为多倍体嵌合率的鉴定提供了一种新思路。参考文献：1王文采，李良千.铁线莲属一新分类系统J.植物分类学报，2005,43(5):431-488.2 章银柯，江燕.我国铁线莲属植物研究现状及其园林应用J.北方园艺，2 0 0 7（3）：12 2-12 4.3于浩然，李青丰，贾玉山，等.四种灌木植物种子休眠和萌发特性的研究J.北方园艺，2 0 18（2 2）：8 8-9 3.4刘雁南，王林和，张力君，等.灌木铁线莲对水分胁迫的生理响应J.北方园艺,2 0 14（17)：7 1-7 4.5王炜，陈琛，葛玉彬，等.高丹草多倍体的诱导与鉴定J.西北农业学报，2 0 2 1,3 0(9)：13 94-140 1.6张广楠，郭春倩，张祥林，等.“乐都紫皮大蒜”多倍体的诱导与鉴定J.分子植物育种，2 0 2 1，19（17）：57 6 8-57 7 4.7 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