干旱胁迫下油用牡丹‘凤丹’基因组DNA甲基化分析.pdf

收稿日期:2022-03-10基金项目:河南省中原学者项目(212101510003);河南省自然科学基金项目(202300410119);河南省高校科技创新人才支持计划(22HASTIT036)作者简介:樊明月(1995),女,硕士,主要从事牡丹分子生物学研究。E-mail: 通信作者,E-mail:上海农业学报 2023,39(4):10-16http:Acta Agriculturae ShanghaiDOI:10.15955j.issn1000-3924.2023.04.02樊明月,李昱莹,王璨,等.干旱胁迫下油用牡丹凤丹基因组 DNA 甲基化分析J.上海农业学报,2023,39(4):10-16.干旱胁迫下油用牡丹凤丹基因组 DNA 甲基化分析樊明月,李昱莹,王 璨,侯小改,郭丽丽(河南科技大学农学院,洛阳 471023)摘 要:利用甲基化敏感扩增多态性技术探究不同干旱处理下油用牡丹凤丹基因组 DNA 甲基化的水平及其变异模式。结果表明:凤丹4 年生植株的基因组 DNA 甲基化率为 93.24%;随着干旱程度的加强,凤丹基因组 DNA 发生甲基化变化位点的比率呈先上升后下降的趋势;对不同程度干旱处理后的凤丹进行复水,与对照植株相比,复水后的凤丹植株基因组 DNA 总甲基化率均表现为上升。干旱胁迫下凤丹基因组 DNA 甲基化出现 4 种变异模式,表现为 15 种条带类型。轻度干旱诱导凤丹基因组 39.78%的位点发生了甲基化,40.00%的位点发生了去甲基化;重度干旱诱导凤丹基因组 46.00%的位点发生了甲基化,38.60%的位点发生了去甲基化,表明干旱胁迫会诱导凤丹基因组 DNA 甲基化状态发生改变。关键词:油用牡丹凤丹;干旱胁迫;DNA 甲基化;甲基化敏感扩增多态性中图分类号:S685.11 文献标志码:A 文章编号:1000-3924(2023)04-010-07Analysis of genomic DNA methylation of oil tree peony(Paeonia ostii)Fengdanunder drought stressFAN Mingyue,LI Yuying,WANG Can,HOU Xiaogai,GUO Lili(College of Agriculture,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)Abstract:The methylation sensitive amplification polymorphism(MSAP)technique was used to explore thegenome DNA methylation levels and variation patterns of oil tree peony(Paeonia ostii)Fengdan underdifferent drought treatments.The results showed that the genome DNA methylation rate of P.ostii Fengdan4-year-old plants was 93.24%.With the intensification of drought,the proportion of loci where genomic DNAmethylation changed showed a trend of first increasing and then decreasing.After rehydrating the P.ostiiFengdan plants treated with different degrees of drought,compared with the control,the total methylation rateof genomic DNA in P.ostii Fengdan plants increased after rehydration.Under drought stress,there were4 variation patterns of DNA methylation in the genome of P.ostii Fengdan,which were represented by 15 bandtypes.Slight drought induced methylation at 39.78%and demethylation at 40.00%of the loci in the genome ofP.ostii Fengdan;Severe drought induced methylation at 46.00%and demethylation at 38.60%of the loci inthe genome of P.ostii Fengdan,indicating that drought stress could induce changes in the methylation status ofP.ostii Fengdan genomic DNA.Key words:Paeonia ostii Fengdan;Drought stress;DNA methylation;Methylation sensitive amplificationpolymorphism全球变暖所导致的干旱等气候问题对植物造成了严重影响1,降水量不足以及降水模式改变使干旱成为非生物胁迫中最具破坏性及最能影响作物产量的重要因素2-5,极大限制了植物的正常生长发育6-8。干旱对植物的影响贯穿植物生长发育的各个阶段,不仅影响植物的生长形态,还可引起植物体内生理生化发生变化9-11。已有研究证明,干旱胁迫可诱导植物基因组 DNA 甲基化状态发生改变12-13。上 海 农 业 学 报DNA 甲基化是植物自身应对干旱胁迫重要的途径之一,可通过改变植物基因表达水平,引起不同生理反应,从而适应干旱14-15。DNA 甲基化作为表观遗传学的重要研究内容,其在调控基因表达、维持基因组稳定性等方面具有重要作用16-17。随着对 DNA 甲基化的研究日益精进和分子研究技术手段的不断发展,DNA 甲基化检测的方法和手段日新月异。其中,甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术是利用限制性内切酶 HpaII 和 MspI 对基因组 DNA 进行特异性酶切,酶切后获得不同的 DNA切割片段,以此来揭示植物基因组 DNA 的甲基化状态18。该方法中的限制性内切酶 HpaII 和 MspI 可识别相同的 5-CCGG 序列19,基于其对胞嘧啶的敏感程度不同,HpaII 选择性酶切一条链被甲基化的位点,而 MspI 选择性酶切双链内侧被甲基化的位点,HpaII 和 MspI 均可切割无甲基化位点20-21。牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)作为中国传统名花,在我国有着悠久的人工栽培应用历史22,其观赏价值和药用价值被广泛肯定23。油用牡丹凤丹(P.ostii Fengdan)作为新兴的油用作物,籽油品质高,且其生态适应性强24-25,于 2011 年被国家卫生部批准为新资源食品26-28。随着国家对新型油料作物的大力扶持和油用牡丹产业链的不断完善,人们对油用牡丹的关注度越来越高,不断深入研究挖掘其潜在价值。本试验研究不同干旱处理下凤丹基因组 DNA 的甲基化差异及其变异模式,分析干旱胁迫对凤丹基因组 DNA 甲基化带来的影响,以期为其在培植繁育等方面的研究提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料试验材料为河南省洛阳市国际牡丹园内 4 年生油用牡丹凤丹。挑选长势良好且生长情况一致的 4年生凤丹,移栽于规格为 20 cm 16 cm 13 cm 的花盆中,所有植株的光照条件一致。1.2 试验方法1.2.1 试验设计试验设对照组(按 80%的日蒸腾量 57.4 mL 浇水)、轻度干旱处理组(按 40%的日蒸腾量 28.7 mL 浇水)及轻度干旱复水处理组、重度干旱处理组(干旱过程中不浇水)及重度干旱复水处理组。不同处理组植株均在干旱处理 14 d 后出现表型;对出现表型的轻度干旱复水处理组和重度干旱复水处理组植株进行复水处理,对其正常浇水即为复水,复水处理 3 d 后,轻度干旱处理组植株恢复至正常状态的表型,复水处理 5 d 后,重度干旱处理组植株恢复至正常状态的表型。随机选取同一处理组不同植株上的完整叶片,混合放在锡箔纸上,包裹、标记,放入液氮中低温冷冻保存、待用。1.2.2 甲基化敏感多态性分析(1)采用改良的 CTAB 法提取处理后的凤丹叶片基因组 DNA29。(2)采用付胜杰等30建立的 MSAP 反应体系及程序对凤丹基因组 DNA 进行酶切、连接、预扩增和选择性扩增。选择 EcoRIMspI 和 EcoRIHpaII 作为双酶切组合,对凤丹基因组 DNA 进行双酶切,MSAP分析所用接头和预扩增引物序列见表 1。表 1 MSAP 分析的接头序列和引物序列Table 1 Adapter sequences and primer sequences for MSAP analysis引物和接头接头预扩增引物E c o R I?a d a p t e r IE c o R I?a d a p t e r I IH p a I I?Ms p I?a d a p t e r IH p a I I?Ms p I?a d a p t e r I IE?0 0H p a I I/Ms p I?0 0核苷酸序列（5?3 ）C T C G T A G A C T G C G T A C CA A T T G G T A C G C A G T C T AG A C G A T G A G T C C T G A GT A C T C A G G A C T C A TG A C T G C G T A C C A A T T CG A T G A G T C C T G A G C G G (3)为方便酶切体系的配制,需将 DNA 样品质量浓度保持一致(400 ngL),酶切体系共20 L,包含1 L 基因组 DNA、1 L EcoRI、1 L HpaIIMspI、2 L 10 EcoRI Buffer、2 L HpaIIMspI Buffer,用无菌双蒸水补齐。(4)酶切后应立即进行连接反应,连接反应体系共 20 L,包含 2 L 10 T4 连接酶 Buffer、1 L T411樊明月等:干旱胁迫下油用牡丹凤丹基因组 DNA 甲基化分析连接酶、0.4 L HpaII-MspI 接头、0.4 L EcoRI 接头、10 L 酶切产物,用无菌双蒸水补齐,连接产物需16 过夜;过夜连接后的产物于 65 温育 10 min 后终止反应。(5)以连接产物作为模板进行预扩增,预扩增反应体系共 20 L,包含 10 L 连接产物、预扩增引物各 0.5 L、0.2 L Taq DNA 聚合酶、0.4 L dNTPs、2 L PCR Buffer,用无菌双蒸水补齐。(6)预扩增完成后,用稀释 40 倍的预扩增产物作为模板进行选择性扩增,MSAP 选择性扩增反应体系共 20 L,包含 2 L 预扩增产物、特异性扩增引物各 1 L、10 L Taq DNAMix,用无菌双蒸水补齐。(7)配制浓度为 6%(体积比)的变性聚丙烯酰胺凝胶,将选择性扩增获得的 PCR 产物上样于聚丙烯酰胺凝胶中进行垂直电泳,电压 220 V,电泳时间 140 min。电泳结束后对凝胶进行银染,观察条带。1.2.3 数据分析染色显影后,观察统计每个 PAGE 胶图版的条带,在同一位点处有清晰条带显示记为“1”,无条带显示处记为“0”。通过 Quantity One 软件读取 MSAP 条带信息并转化成表型数据 01 矩阵,统计结果制成Excel 表格。2 结果与分析2.1 干旱胁迫对凤丹牡丹表型变化的影响在干旱胁迫下,凤丹植株的叶片形态变化显著,叶片长势明显变差,具体表现为:轻度干旱时,植株叶片开始下垂,并出现萎蔫和发黄;重度干旱时,叶片出现严重的干枯卷曲,叶片数量减少,枝条下垂。对不同程度干旱处理后的植株进行复水处理,轻度干旱复水的植株仍能恢复其生命活力,外观上基本恢复正常,叶片皱缩和萎蔫消失,叶片舒展,但与对照植株相比,仍表现出叶片发黄、叶片数量减少的现象;重度干旱的植株复水后也仍具有生命力,但与对照植株相比,叶片发黄且较为皱缩,枝条下垂(图 1)。对照轻度干旱重度干旱轻度干旱复水重度干旱复水图 1 干旱胁迫对凤丹表型变化的影响Fig.1 Effects of drought stress on phenotypic changes of P.ostii Fengdan2.2 不同干旱胁迫下凤丹牡丹总甲基化状态使用 EcoRIMspI 和 EcoRIHpaII 组合对样品 DNA 酶切后,检测出 4 种甲基化类型(图 2),分别为 I 型(超甲基化):H、M 均无带,DNA 双链外部甲基化或双链内外部都甲基化,记为(0,0);II 型(全甲基化):H无带、M 有带,DNA 双链内部甲基化,记为(0,1);III 型(半甲基化):H 有带、M 无带,DNA 单链外部甲基化,记为(1,0);IV 型(非甲基化):H、M 均有带,即 DNA 双链的 CCGG 位点无甲基化发生,记为(1,1)。I)超甲基化:H、M 均无带;II)全甲基化:H 无带、M 有带;III)半甲基化:H 有带、M 无带;IV)非甲基化:H、M 均有带。图 2 选择性扩增凝胶电泳图谱Fig.2 Selectively amplification gel electrophoresis21上 海 农 业 学 报以 30 对选择性引物进行扩增,通过观察比对筛选出多态性丰富、重复性较好的 26 对引物组合,使用MSAP 检测分析不同处理下凤丹牡丹基因组 DNA 甲基化状态(表 2)。结果显示,26 对选择性引物共扩增出932 个 CCGG 位点。对照植株半甲基化位点(III 型)有115 个,半甲基化率为12.34%;全甲基化位点(II 型)86 个,全甲基化率为 80.90%。在不同程度干旱处理组中,轻度干旱和重度干旱的凤丹牡丹半甲基化位点分别为103 个和101 个,半甲基化率分别为11.05%和10.84%;全甲基化位点分别为140 个和174 个,全甲基化率均为85.09%。轻度干旱诱导凤丹牡丹基因组 DNA 的半甲基化率下降了1.2%;重度干旱诱导其半甲基化率下降了 1.5%;轻度干旱和重度干旱胁迫下,凤丹牡丹的全甲基化率均表现为上升趋势,升幅为 4.2%。干旱复水处理组的凤丹牡丹基因组 DNA 半甲基化位点数和全甲基化位点数均发生改变。统计结果显示:轻度干旱复水后,凤丹牡丹的半甲基化位点有 119 个,半甲基化率为 12.8%,全甲基化位点有161 个,全甲基化率为83.4%,与对照相比,半甲基化率和全甲基化率均呈现上升趋势;与轻度干旱处理组相比,半甲基化率升高了 1.7%,全甲基化率降低了 1.7%。重度干旱复水后,凤丹牡丹的半甲基化位点有 68 个,半甲基化率为 9.7%,全甲基化位点有 174 个,全甲基化率为 85.0%,与对照相比,半甲基化率降低了 2.6%,全甲基化率升高了 4.1%;与重度干旱处理组相比,半甲基化率降低了 1.1%,全甲基化率降低了 0.1%。表 2 不同干旱条件下凤丹基因组 DNA 甲基化水平Table 2 Genomic DNA methylation levels of P.ostii Fengdanunder different drought stress处理对照轻度干旱轻度干旱复水重度干旱重度干旱复水条带类型数量（I、I I、I I I、I V）6 6 8、8 6、1 1 5、6 36 5 3、1 4 0、1 0 3、3 66 1 6、1 6 1、1 1 9、3 66 1 9、1 7 4、1 0 1、3 86 5 3、1 7 4、6 8、3 6总甲基化位点（I I I I I I）8 6 98 9 68 9 68 9 48 9 5全甲基化位点（I I I）7 5 47 9 37 7 77 9 38 2 7总甲基化率/%9 3.2 49 6.1 49 6.1 49 5.9 39 6.0 3全甲基化率/%8 0.9 08 5.0 98 3.3 78 5.0 98 8.7 3半甲基化率/%1 2.3 41 1.0 51 2.7 71 0.8 47.3 0 注:总甲基化率=(I+II+III)(I+II+III+IV)100%;全甲基化率=(I+II)(I+II+III+IV)100%;半甲基化率=III(I+II+III+IV)100%。2.3 干旱诱导的凤丹牡丹甲基化变化和去甲基化变化分析不同程度干旱处理后下凤丹牡丹基因组 DNA 甲基化的变异模式,发现 26 对选择性引物在不同处理的样本中扩增产生了 4 种变异模式,共 15 种条带类型(表 3 和表 4)。表 3 轻度干旱处理下凤丹基因组 DNA 甲基化模式的变化Table 3 Changes in genomic DNA methylation patterns of P.ostii Fengdan under slight drought treatment模式无变化去甲基化甲基化特殊模式类型A 1A 2A 3B 1B 2B 3B 4B 5C 1C 2C 3C 4C 5D 1D 2带型对照H p a I I110100001111010Ms p I101010001110101轻度干旱H p a I I110111101000001Ms p I101111010100010位点数1 61 83 4551 14 31 1 92 432 08 25 51 11 4甲基化变化情况非甲基化非甲基化半甲基化半甲基化全甲基化全甲基化半甲基化非甲基化全甲基化非甲基化超甲基化非甲基化超甲基化半甲基化超甲基化全甲基化非甲基化半甲基化非甲基化全甲基化非甲基化超甲基化半甲基化超甲基化全甲基化超甲基化半甲基化全甲基化全甲基化半甲基化百分比/%1 4.7 83 9.7 84 0.0 05.4 3 模式 A:对照和干旱处理组有相同的甲基化 CCGG 位点,甲基化位点无变化,该模式包含 3 种条带类型 A1、A2、A3,在轻度干旱处理组中占14.78%,在重度干旱处理组中占11.69%。模式 B:与对照相比,处31樊明月等:干旱胁迫下油用牡丹凤丹基因组 DNA 甲基化分析理组 DNA 甲基化水平下降,为去甲基化,该模式包含 5 种条带类型,B1B3 为对照中的甲基化位点变成非甲基化位点;B4 表示与对照相比,超甲基化位点变为半甲基化位点,在重度干旱处理组中该变化高于轻度干旱处理组;B5 表示超甲基化位点变为全甲基化位点。该模式在轻度干旱处理组中占 39.78%,在重度干旱处理组中占 46.00%。模式 C 为甲基化模式,包含 5 种条带类型 C1、C2、C3、C4、C5,其中 C1C3为对照中的非甲基化位点变成了甲基化位点;C4 为半甲基化位点变为超甲基化位点;C5 为全甲基化位点变成了超甲基化位点。该模式在轻度干旱处理组中占 40.00%,在重度干旱处理组中占 38.60%。模式 D为特殊模式,在此类别下,对照与处理组之间的甲基化变异水平不是单纯的升高或降低。表 4 重度干旱处理下凤丹基因组 DNA 甲基化模式的变化Table 4 Changes in genomic DNA methylation patterns of Paeonia ostii Fengdan under severe drought treatment模式无变化去甲基化甲基化特殊模式类型A 1A 2A 3B 1B 2B 3B 4B 5C 1C 2C 3C 4C 5D 1D 2带型对照H p a I I110100001111010Ms p I101010001110101重度干旱H p a I I110111101000001Ms p I101111010100010位点数1 81 23 07485 91 5 81 143 38 16 91 63甲基化变化情况非甲基化非甲基化半甲基化半甲基化全甲基化全甲基化半甲基化非甲基化全甲基化非甲基化超甲基化非甲基化超甲基化半甲基化超甲基化全甲基化非甲基化半甲基化非甲基化全甲基化非甲基化超甲基化半甲基化超甲基化全甲基化超甲基化半甲基化全甲基化全甲基化半甲基化百分比/%1 1.6 94 6.0 03 8.6 03.7 03 结论与讨论凤丹牡丹在遭受干旱胁迫后,其生长发育受到显著影响。在不同干旱处理下,凤丹牡丹的表型发生改变,叶片会出现失水皱缩,对其进行复水处理后,可恢复活力,表明面对干旱胁迫时凤丹牡丹总体趋向于休眠以应对外界的危害。大部分高等植物基因组 DNA 甲基化水平在 30%50%31-35,本研究表明,凤丹牡丹基因组 DNA 甲基化水平明显高于其他植物。干旱胁迫下的凤丹牡丹基因组 DNA 半甲基化率随着干旱程度的增加呈现逐渐下降的趋势,全甲基化率呈现增加的趋势;在进行干旱复水后,轻度干旱复水处理组的半甲基化程度和对照基本相同,出现该现象的原因可能是原来某些非甲基化位点发生了甲基化使半甲基化水平略微增加;而重度干旱复水处理组与对照相比,半甲基化水平显著降低,表明重度干旱对其影响较大,可能导致牡丹基因组 DNA 产生了一些不可逆转的变化。在长期进化中,植物形成了自身的抗旱机制36。DNA 甲基化在植物抵抗非生物胁迫的过程中发挥着至关重要的作用,使植物得以在逆境中生存37。DNA 甲基化作为一种潜在的可遗传的表观遗传现象,在防御外源 DNA 入侵和阻遏转座子在基因组移动以及调控高等植物基因表达方面具有双重作用38-39。许多研究表明,DNA 甲基化参与了植物对抗非生物胁迫的过程,且已证明 DNA 甲基化是植物参与适应干旱胁迫的调节系统中的重要一环。植物通过调节基因组的甲基化水平,适应外界的非生物胁迫,以保证植物自身能够适应外界环境而正常生长40。本试验对干旱胁迫下凤丹牡丹基因组 DNA 甲基化水平变化进行了探究,旨在揭示油用牡丹抗逆能力与其 DNA 甲基化程度之间的关系。凤丹牡丹作为多年生木本植物,其基因组庞大而复杂,甲基化水平与植物自身基因组复杂程度紧密相关34,41,凤丹牡丹基因组的高甲基化率可能与其自身基因组包含大量转座子及其他重复序列有关。面对干旱胁迫,凤丹牡丹改变自身甲基化水平,其基因组甲基化率上调;在解除胁迫后,凤丹基因组总甲基化率仍高于对照,表明 DNA 甲基化参与了其对抗干旱胁迫41上 海 农 业 学 报的过程。植物基因组 DNA 的甲基化和去甲基化往往还影响着其基因转录的激活和抑制42-45,即影响基因的表达,探究参与干旱胁迫调控 DNA 甲基化的基因,挖掘其功能,将成为改良油用牡丹抗性及品质后续工作的重要思路。参 考 文 献 1 刘宪锋,傅伯杰.干旱对作物产量影响研究进展与展望J.地理学报,2021,76(11):2632-2646.2 TOKER C,CANCI H,YILDIRIM T.Evaluation of perennial wild Cicer species for drought resistanceJ Genetic Resources and Crop 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