过表达CTRP6通过调控Nrf2_HO-1通路在减轻糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用.pdf

【】./.论著基础过表达 通过调控/通路在减轻糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用沈倩妮王苏刘恒娟李亚男龚平基金项目:国家自然科学基金资助项目()作者单位:武汉大学人民医院麻醉科(沈倩妮、王苏、刘恒娟、李亚男、龚平)武汉大学口腔医院麻醉科/口腔基础医学省部共建国家重点实验室/培育基地和口腔生物医学教育部重点实验室(龚平)通信作者:龚平:.【摘 要】目的 探讨过表达/肿瘤坏死因子相关蛋白()通过调控核因子 相关因子/血红素加氧酶(/)通路在减轻糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用 方法 于 年 月 年 月在武汉大学人民医院进行实验选取清洁级雄性/小鼠 只采用随机数字表法分为假手术组()、脑缺血再灌注组()、脑缺血再灌注 过表达组()各 只 组、组连续 腹腔注射 /建立小鼠糖尿病模型 组在糖尿病模型建立 周后脑室注射腺相关病毒()周后 组采用线栓法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型 组仅行手术操作不作任何处理 再灌注 后 检测脑梗死面积 检测、/、/蛋白水平 法检测 可见光法检测 法检测 法检测、水平比色法检测、活性原位凋亡荧光素检测细胞凋亡情况 结果与 组比较 组、均降低(均 .)/、/、阳性细胞升高(均.)与 组比较 组、均升高(均 .)脑梗死面积、/、/、阳性细胞均降低(均 .)结论 通过调控氧化应激、炎性反应、细胞凋亡进而减轻糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤【关键词】糖尿病脑缺血再灌注损伤/肿瘤坏死因子相关蛋白核因子 相关因子/血红素加氧酶通路作用机制小鼠【中图分类号】【文献标识码】/.:.:()【】To explore the role of overexpression of C1q/tumor necrosis factor related protein6(CTRP6)in alleviating cerebral ischemiareperfusion injury in diabetes mice by regulating nuclear factor E2 related factor 2/heme oxygenase1(Nrf2/HO1)pathway.The experiment was conducted at the Peoples Hospital of Wuhan University from September 2021 to June 2022.Eighteen clean grade male C57BL/6 mice were selected and randomly divided intosham surgery group(Sham),cerebral ischemiareperfusion group(IR),and cerebral ischemiareperfusion+CTRP6 overexpression group(IR+CTRP6)using a random number table method,with 6 mice in each group.In IR group and IR+CTRP6group,STZ 50 mg/kg was intraperitoneally injected for 5 consecutive days to establish the mouse model of diabetes.In IR+CTRP6 group,adenoassociated virus(AAV)CTRP6 was injected into the ventricles of the brain three weeks after the establishment of the diabetes model.After another three weeks,the two groups used the suture method to prepare the mousemodel of cerebral ischemia reperfusion injury.Sham group was only operated without any treatment.After 24 hours of reperfusion,the area of cerebral infarction was measured by TTC.Western blot detection of Nrf2,HO1,NQO1,pNF B/NF B.PIKK/IKK protein levels.WST1 method for detecting SOD,visible light method for detecting CAT,TBA method for疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .detecting MDA,ELISA method for detecting IL1,TNF,MCP1 level;Colorimetric detection of Caspase3 and Caspase9 activity;In situ apoptosis fluorescence assay was used to detect cell apoptosis.Compared with the Sham group,the IR group showed a decrease in Nrf2,HO1,NQO1,SOD,CAT(P0.01),pNF B/NF B、pIKK/IKK、MDA、IL1?、TNF、MCP1,Caspase3,Caspase9,and TUNEL positive cells increased(P0.01).Compared with the IR group,theIR+CTRP6 group showed an increase in Nrf2,HO1,NQO1,SOD,CAT(P0.01),cerebral infarction area,pNFB/NFB,pIKK/IKK、MDA、IL1,TNF,MCP1,Caspase3,Caspase9,and TUNEL positive cells all decreased(P0.01).?CTRP6 alleviates cerebral ischemiareperfusion injury in diabetes mice by regulating oxidative stress,inflammatory response and apoptosis.【】Diabetes;Cerebral ischemia reperfusion injury;C1q/tumor necrosis factor related protein6;Nuclear factor E2 related factor 2/heme oxygenase1 pathway;Mechanism;Mice 脑缺血再灌注损伤()作为目前缺血性脑卒中的主要防治焦点其发病机制复杂多样 而伴有糖尿病的患者由于其抗氧化、抗炎能力降低导致血管脆性增加更易诱发脑损伤 因此积极寻找新的治疗方案以减轻糖尿病患者 带来的负担具有重要意义/肿瘤坏死因子相关蛋白(/)作为 家族的成员与多种疾病的发生进展密切相关 研究证实 可防止多柔比星引起的心脏损伤并激活蛋白激酶 (/)通路 然而 是否可以通过调控核因子 相关因子/血红素加氧酶(/)通路进而改善糖尿病小鼠 目前尚未见相关报道本研究旨在探讨 调控的/通路在糖尿病小鼠 中的作用以期为改善糖尿病患者 的预后提供新思路报道如下 材料与方法.材料()实验动物及分组:清洁级健康雄性/小鼠 只 周龄体质量()购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司饲养于武汉大学动物试验中心 环境给予 /光/暗条件(灯亮时间为:)湿度()温度()常规喂养颗粒饲料 随机数字表法分为假手术组()、脑缺血再灌注组()、脑缺血再灌注 过表达组()各 只()主要试剂:、购自美国 公司腺相关病毒()购自上海 公司、抗体购自英国 公司、试剂盒购自南京建成公司、试剂盒购自美国赛默飞公司 试剂盒购自美国 公司 试剂盒购自上海生工生物公司 凋亡荧光试剂盒购自美国 公司.实验方法 年 月 年 月于武汉大学人民医院进行实验 小鼠糖尿病模型建立:小鼠腹腔注射 /连续 而后检测其空腹血糖空腹血糖大于./时认为糖尿病模型制备成功 参照文献 组小鼠予 后 周接受 脑室注射再过 周后参照文献建立大脑中动脉阻断()模型 麻醉小鼠后于颈部正中切口分离左颈总动脉和颈外动脉结扎颈总动脉近心端及颈外动脉夹闭颈总动脉远心端在靠近颈总动脉结扎处插入线栓至稍感阻力后停止固定线栓并缝合 线栓置入 后拔出并恢复灌注.观测指标与方法.小鼠脑梗死面积检测:后 处死小鼠收集大脑组织并沿冠状位切片(厚度约 )切片用 在 水浴箱中孵育 福尔马林固定过夜 次日扫描并用 软件进行分析.检测、通路相关蛋白:在含有蛋白酶抑制剂颗粒的 裂解缓冲液中加入脑组织 的 电泳凝胶上分离并转移到 膜上 随后室温下 脱脂牛奶 阻断 并加入、抗体()下孵育过夜 次日用相应的含 的二抗和增强化学发光剂再次孵育 对印迹条带进行量化.氧化应激及炎性因子检测:取脑组织用预冷的 漂洗去除血液滤纸吸干称重按比例配置组织匀浆液离心后取上清置于冰上待测 法检测 可见光法检测 法检测 法检测、水平严格按试剂盒说明书操作.活 性 及 染 色 检 测:使 用、活性检测试剂盒对 活性进行检测操作步骤严格按说明书进行 根据说明书采用 原位凋亡荧光素检测试剂盒进行染色在荧光显微镜下观察并通过 软件分疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .析 阳性细胞数.统计学方法 采用 软件分析处理数据符合正态分布的计量资料以 表示 组比较采用独立样本 检验多组比较采用单因素方差分析两两比较采用 检验 .为差异有统计学意义 结 果.各组小鼠 后脑梗死面积及相关信号通路表达比较与 组比较 组/通路及其下游 蛋白表达降低/与/水平升高(.)与 组比较 组脑梗死面积减少/通路及其下游 蛋白表达升高/与/降低(.)见表.各组小鼠 后氧化应激及炎性因子表达比较 与 组比较 组、活性降低 含量、表达水平升高(.)与 组比较 组、活性升高含量、表达水平降低(.)见表.各组小鼠 后凋亡因子及细胞凋亡表达比较 与 组比较 组、活性升高 阳性细胞数增多(.)与 组比较 组、活性降低阳性细胞数减少(.)见表 讨 论 大量证据表明氧化应激是诱发缺血性脑卒中的表 各组小鼠凋亡因子及细胞凋亡比较().组 别 活性 活性 阳性细胞 组.组.组.值.值.注:与 组比较.与 组比较.重要机制之一再灌注后氧自由基增多会对细胞造成直接损害而机体内氧化和抗氧化系统的失衡又可导致多种信号通路的激活 糖尿病患者中过多的活性氧()可进一步诱发脂质过氧化、蛋白质变性和 损伤等同时 还可引发后续的瀑布样炎性反应 以上研究表明 的产生和炎性介质的累积可触发神经损伤 研究证实 参与了心脑血管代谢疾病的发生进展亦与胰岛素抵抗和糖尿病密切关联 另有研究认为 能对急性刺激做出反应并在营养过剩的情况下发挥作用通过诱发“生理性炎性反应”以限制脂肪组织扩张 本研究发现再灌注后小鼠脑梗死面积增大当补充 后小鼠梗死面积降低 因此进一步探讨 在 中的具体机制及其与氧化应激和炎性反应的关系对预防 有重要价值/通路作为机体内源性的保护机制被认为是对抗氧化应激的主要细胞防御手段 本研究发现在糖尿病后/通路及其下游的表 各组小鼠脑梗死面积与、通路相关蛋白表达比较().组 别梗死面积()/组.组.组./值.值.注:与 组比较.与 组比较.表 各组小鼠氧化应激及炎性因子水平比较().组 别(/)(/)(/)(/)(/)(/)组.组.组.值.值.注:与 组比较.与 组比较.疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .表达下降而调控炎性介质的 通路及其下游 的磷酸化升高表明再灌注损伤会导致脑组织中氧化应激和炎性反应的升高 新近研究发现 和 之间存在分子串扰现象在一定程度上可使细胞更精细地调节其对应激的反应而 与 的失衡则会导致多种疾病的发生 当过表达 后/通路及其下游分子表达增加机体抗氧化能力增强 通路及其下游 的磷酸化降低机体促炎水平减弱 在糖尿病状态下炎性因子作为与缺血性脑卒中密切相关的机制之一可激活小胶质细胞并招募白细胞分泌细胞因子形成促炎微环境进一步加剧糖尿病小鼠脑损伤 本研究结果发现再灌注后小鼠、活性降低 含量升高而、的表达增多 过表达 后氧化应激和炎性因子的积累明显降低证实 通过抑制氧化应激和炎性因子的表达在糖尿病 中发挥保护作用 凋亡作为决定卒中结局的关键因素其可在脑缺血发生数分钟后启动并在整个卒中过程中持续存在抑制神经元的凋亡可有效减轻糖尿病小鼠脑缺血再灌注损伤 研究显示 可减轻 诱导的唾液腺细胞凋亡以及 损伤诱导的 细胞死亡 研究发现 可通过激活 信号通路保护心脏免受阿霉素()诱导的心肌凋亡 与 在其他细胞类型中的抗凋亡作用相一致本研究结果发现 后 与 活性升高同时 阳性细胞增多补充 可降低 的活性减少凋亡细胞数量 综上所述在糖尿病 期间/通路抑制 通路激活进而导致氧化应激、炎性因子、细胞凋亡增加而过表达 可显著减轻脑损伤利益冲突:所有作者声明无利益冲突作者贡献声明 沈倩妮、王苏:实施研究过程论文撰写刘恒娟:资料搜集整理李亚男:分析数据龚平:课题设计论文审核参考文献 .:.:./.:.:./.:.:./.():.:./.():.:./.():.:./.:.:./.:.:./.尹晓新冯海松杨涛等.脂联素介导/信号通路对大鼠脑缺血损伤后的影响.疑难病杂志():.:./.():.:./.:.():.:./.():.:./.邵会敏曹新营刘志亮等.紫云英苷对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化及/通路的影响.疑难病杂志():.:./.():.:./.:.:././.:.:././.():.:././.():.:./.(收稿日期:)疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .