气相色谱分析法基本知识_27页.docx

第1章气相色谱分析法目标：深化对气相色谱分析基本理论的理解，熟悉气相色谱测定方法应用，掌握气相色谱仪的基本操作技能和日常维护，掌握分离条件的确定和定量方法，学会实验数据的处理方法。1.1气相色谱分析概述1.1.1气相色谱分析气相色谱法（GC）是从1952年后迅速发展起来的一种分离分析方法。它实际上是一种物理分离的方法：基于不同物质物化性质的差异，在固定相（色谱柱）和流动相（载气）构成的两相体系中具有不同的分配系数（或吸附性能），当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起迁移，并在两相间进行反复多次的分配（吸附脱附或溶解析出），使得那些分配系数只有微小差别的物质，在迁移速度上产生了很大的差别，经过一段时间后，各组分之间达到了彼此的分离。被分离的物质依次通过检测装置，给出每个物质的信息，一般是一个色谱峰。通过出峰的时间和峰面积，可以对被分离物质进行定性和定量分析。气相色谱法最早是用于分离分析石油产品，目前已广泛用于石油化学、化工、有机合成、医药、生物化学、食品分析和环境监测等领域。在药物分析中，气相色谱法已成为有关物质检查、原料药和制剂的含量测定、中草药成分分析、药物的纯化、制备的一种重要手段。随着科技的日新月异，气相色谱在许多方面都取得了良好的发展：气相色谱与其他仪器联用技术的快速发展使其应用进一步扩展，现在气-质联用等已经得到了广泛的应用。自动化程度进一步提高，特别是EPC（电子程序压力流量控制系统）技术已作为基本配置在许多厂家的气相色谱仪上安装（如HP6890，Varian 3800，PE Auto XL，CE Mega 8000 等），从而为色谱条件的再现、优化和自动化提供了更可靠更完善的支持。仪器的微型化以及与应用结合更紧密的专用色谱仪，如天然气分析仪等也是气相色谱重要发展方向之一。色谱仪器上的许多功能进一步得到开发和改进，如大体积进样技术，液体样品的进样量可达500 L。与功能日益强大的工作站相配合，色谱采样速率显著提高，最高已达到200 Hz，这为快速色谱分析提供了保证。色谱工作站功能不断增大，通信方式紧跟时代步伐，已实现网络化，从技术上讲，现在实现气相色谱仪的远程操作（样品已置于自动进样器中）是没有问题的。新的选择性检测器得到应用，如AED、O-FID、SCD、PFPD 等。新的高选择性固定液不断得到应用，如手性固定液等。耐高温毛细管色谱柱扩展了气相色谱的应用范围。GCGC技术是近两年出现并飞速发展的气相色谱新技术，样品在第一根色谱柱上按沸点进行分离，通过一个调制聚焦器，每一时间段的色谱流出物经聚焦后进入第二根细内径快速色谱柱上按极性进行二次分离，得到的色谱图经处理后应为三维图。据报道，使用这一技术分析航空煤油检出了上万个组分。1.1.2气相色谱分析的分类就其操作形式而言，气相色谱法属于柱色谱法。气相色谱法有多种类型，从不同的角度出发，有不同的分类方法。按固定相的物态，分为气-固色谱法（GSC）及气-液色谱法（GLC）两类。用液体做固定相时，必须将液体均匀地涂布在多孔的化学惰性固体上。这时的固定相中的液体叫固定液，它通常为高沸点有机物，多孔的化学惰性固体叫担体或载体。按柱的粗细和填充情况，分为填充柱色谱法及毛细管柱色谱法两种。按分离机制，可分为吸附及分配色谱法两类。气-液色谱法属于分配色谱法。在气-固色谱法中，固定相常用吸附剂，因此多属于吸附色谱法。当固体固定相为分子筛时，分离是靠分子大小差异及吸附两种作用。1.1.3 气相色谱分析的特点气相色谱法具有分离效能高、选择性好（分离制备高纯物质，纯度可达99%；可分离性能相近物质和多组分混合物）、灵敏度高（可检测出10-13g10-11 g 的物质）、样品用量少（进样量可在1 mg 以下）、分析速度快（几秒至几十分钟）及应用广泛（易挥发的有机物和无机物）等优点。受样品蒸气压限制是其弱点，对于挥发性较差的液体、固体，需采用制备衍生物或裂解等方法，增加挥发性。据统计，能用气相色谱法直接分析的有机物约占全部有机物的20%。1.2 原理1.2.1 方法原理气相色谱的分离原理有气-固吸附色谱和气-液分配色谱之分，物质在固定相和流动相（气相）之间发生的吸附、脱附或溶解、挥发的过程叫分配过程。在一定温度下组分在两相间分配达到平衡时，组分在固定相与在气相中浓度之比，称为分配系数。不同物质在两相间的分配系数不同，分配系数小的组分，每次分配后在气相中的浓度较大，当分配次数足够多时，只要各组分的分配系数不同，混合的组分就可分离，依次离开色谱柱。相邻两组分之间分离的程度，既取决于组分在两相间的分配系数，又取决于组分在两相间的扩散作用和传质阻力，前者与色谱过程的热力学因素有关，后者与色谱过程的动力学因素有关。气相色谱的两大理论塔板理论和速率理论分别从热力学和动力学的角度阐述了色谱分离效能及其影响因素。塔板理论是在对色谱过程进行多项假设的前提下提出的，由塔板理论计算出的反映分离效能的理论塔板数n 或理论塔板高度H，可用于评价实际分离效果。由塔板理论导出的公式如下。式中，VR 是组分的保留体积；tR 是组分的保留时间；W1/2 是半峰宽，W 是峰底宽（经过色谱峰的拐点所作三角形的底边宽。在相同的操作条件下，用同一样品测定色谱柱的n 或H 值，n 值越大（H 值越小），柱效越高。速率理论是在对色谱过程动力学因素进行研究的基础上提出的，它充分考虑了溶质在两相间的扩散和传质过程，更接近溶质在两相间的实际分配过程，提出了Van Deemter 方程。式中，H 是理论塔板高度；A 是涡流扩散项，与填充物的平均粒径大小和填充不规则因子有关，而与载气性质、线速度和组分性质无关，可以通过使用较细粒度和颗粒均匀的填料，并尽量填充均匀来减小涡流扩散，提高柱效；B/u 是分子纵向扩散项，与组分的性质、载气的流速、性质、温度、压力等有关，为减小B项可以采用分子量大的载气和增加其线速度；CGu是气相传质阻力项，它与填充物粒度平方成正比，与组分在载气中的扩散系数成反比；CLu是液相传质阻力项，可采用低固定液配比和低黏度的固定液来降低；u 是载气线速度，单位为cms-1。1.2.2仪器结构与原理气相色谱仪是实现气相色谱过程的仪器，目前市场上GC仪器型号繁多，但总的说来，仪器的基本结构是相似的，主要由载气系统、进样系统、分离系统（色谱柱）、检测系统以及数据处理系统构成，其方块流程图如图1.1所示。图1.1气相色谱仪方块流程图1.载气系统载气系统包括气源、气体净化器、气路控制系统。载气是气相色谱过程的流动相，原则上说只要没有腐蚀性，且不干扰样品分析的气体都可以作载气。常用的有H2、He、N2、Ar 等。在实际应用中载气的选择主要是根据检测器的特性来决定，同时考虑色谱柱的分离效能和分析时间，例如氢火焰离子化检测器中，氢气是必用的燃气，用氮气作载气。载气的纯度、流速对色谱柱的分离效能、检测器的灵敏度均有很大影响，气路控制系统的作用就是将载气及辅助气进行稳压、稳流及净化，以满足气相色谱分析的要求。操作气相色谱仪如何选用不同气体纯度的气源做载气和辅助气体？原则上讲，选择气体纯度时，主要取决于分析对象、色谱柱中填充物以及检测器。建议在满足分析要求的前提下，尽可能选用纯度较高的气体。这样不但会提高（保持）仪器的高灵敏度，而且会延长色谱柱和整台仪器（气路控制部件，气体过滤器）的寿命。实践证明，作为中高档仪器，长期使用较低纯度的气体气源，一旦要求分析低浓度的样品时，要想恢复仪器的高灵敏度有时十分困难。对于低档仪器，作常量或半微量分析，选用高纯度的气体，不但增加了运行成本，有时还增加了气路的复杂性，更容易出现漏气或其他的问题而影响仪器的正常操作。另外，为了某些特殊的分析目的要求特意在载气中加入某些“不纯物”，如分析极性化合物时添加适量的水蒸气，操作火焰光度检测器时，为了提高分析硫化物的灵敏度，而添加微量硫。操作氦离子化检测器要氖的含量必须在510-6252.510-5，否则会在分析氢、氮和氩气时产生负峰或“W”形峰等。2.进样系统进样系统包括进样器和汽化室，它的功能是引入试样，并使试样瞬间汽化。气体样品可以用六通阀进样，进样量由定量管控制，可以按需要更换，进样量的重复性可达0.5%。液体样品可用微量注射器进样，重复性比较差，在使用时，注意进样量与所选用的注射器相匹配，最好是在注射器最大容量下使用。工业流程色谱分析和大批量样品的常规分析上常用自动进样器，重复性很好。在毛细管柱气相色谱中，由于毛细管柱样品容量很小，一般采用分流进样器，进样量比较多，样品汽化后只有一小部分被载气带入色谱柱，大部分被放空。汽化室的作用是把液体样品瞬间加热变成蒸汽，然后由载气带入色谱柱。3.分离系统分离系统主要由色谱柱组成，是气相色谱仪的心脏，它的功能是使试样在柱内运行的同时得到分离。色谱柱基本有两类：填充柱和毛细管柱。填充柱是将固定相填充在金属或玻璃管中（常用内径4 mm）。毛细管柱是用熔融二氧化硅拉制的空心管，也叫弹性石英毛细管。柱内径通常为0.1mm0.5mm，柱长30m50m，绕成直径20cm左右的环状。用这样的毛细管作分离柱的气相色谱称为毛细管气相色谱或开管柱气相色谱，其分离效率比填充柱要高得多。可分为开管毛细管柱、填充毛细管柱等。填充毛细管柱是在毛细管中填充固定相而成，也可先在较粗的厚壁玻璃管中装入松散的载体或吸附剂，然后拉制成毛细管。如果装入的是载体，使用前在载体上涂渍固定液成为填充毛细管柱气-液色谱。如果装入的是吸附剂，就是填充毛细管柱气-固色谱。这种毛细管柱近年已不多用。开管毛细管柱又分以下四种：壁涂毛细管柱。在内径为0.1mm0.3mm的中空石英毛细管的内壁涂渍固定液，这是目前使用最多的毛细管柱。载体涂层毛细管柱。先在毛细管内壁附着一层硅藻土载体，然后再在载体上涂渍固定液。小内径毛细管柱。内径小于0.1mm的毛细管柱，主要用于快速分析。大内径毛细管柱。内径在0.3mm0.5mm的毛细管，往往在其内壁涂渍5m8m的厚液膜。4.检测器检测器的功能是对柱后已被分离的组分的信息转变为便于记录的电信号，然后对各组分的组成和含量进行鉴定和测量，是色谱仪的眼睛。原则上，被测组分和载气在性质上的任何差异都可以作为设计检测器的依据，但在实际中常用的检测器只有几种，它们结构简单，使用方便，具有通用性或选择性。检测器的选择要依据分析对象和目的来确定。下面列出几种常见的气相色谱检测器。1）热导检测器热导检测器（TCD）属于浓度型检测器，即检测器的响应值与组分在载气中的浓度成正比。它的基本原理是基于不同物质具有不同的热导系数，几乎对所有的物质都有响应，是目前应用最广泛的通用型检测器。由于在检测过程中样品不被破坏，因此可用于制备和其他联用鉴定技术。2）氢火焰离子化检测器氢火焰离子化检测器（FID）利用有机物在氢火焰的作用下化学电离而形成离子流，借测定离子流强度进行检测。该检测器灵敏度高、线性范围宽、操作条件不苛刻、噪声小、死体积小，是有机化合物检测常用的检测器。但是检测时样品被破坏，一般只能检测那些在氢火焰中燃烧产生大量碳正离子的有机化合物。3）电子捕获检测器电子捕获检测器（ECD）是利用电负性物质捕获电子的能力，通过测定电子流进行检测的。ECD具有灵敏度高、选择性好的特点。它是一种专属型检测器，是目前分析痕量电负性有机化合物最有效的检测器，元素的电负性越强，检测器灵敏度越高，对含卤素、硫、氧、羰基、氨基等的化合物有很高的响应。电子捕获检测器已广泛应用于有机氯和有机磷农药残留量、金属配合物、金属有机多卤或多硫化合物等的分析测定。它可用氮气或氩气作载气，最常用的是高纯氮。4）火焰光度检测器火焰光度检测器（FPD）对含硫和含磷的化合物有比较高的灵敏度和选择性。其检测原理是，当含磷和含硫物质在富氢火焰中燃烧时，分别发射具有特征的光谱，透过干涉滤光片，用光电倍增管测量特征光的强度。5）质谱检测器质谱检测器（MSD）是一种质量型、通用型检测器，其原理与质谱相同。它不仅能给出一般GC检测器所能获得的色谱图（总离子流色谱图或重建离子流色谱图），而且能够给出每个色谱峰所对应的质谱图。通过计算机对标准谱库的自动检索，可提供化合物分析结构的信息，故是GC定性分析的有效工具。常被称为色谱-质谱联用（GC-MS）分析，是将色谱的高分离能力与MS的结构鉴定能力结合在一起。GC-MS联用优点如下：气相色谱作为进样系统，将待测样品进行分离后直接导入质谱进行检测，既满足了质谱分析对样品单一性的要求，又省去了样品制备、转移的烦琐过程，不仅避免了样品受污染，对于质谱进样量还能有效控制，也减少了质谱仪器的污染，极大地提高了对混合物的分离、定性、定量分析效率。质谱作为检测器，检测的是离子质量，获得化合物的质谱图，解决了气相色谱定性的局限性，既是一种通用型检测器，又是有选择性的检测器。因为质谱法的多种电离方式可使各种样品分子得到有效的电离，所有离子经质量分析器分离后均可以被检测，有广泛适用性。而且质谱的多种扫描方式和质量分析计算，可以有选择地只检测所需要的目标化合物的特征离子。MSD实际上是一种专用于GC的小型MS仪器，一般配置电子轰击（EI）和化学电离（CI）源，也有直接MS进样功能。其检测灵敏度和线性范围与FID接近，采用选择离子检测（SIM）时灵敏度更高。5.数据处理系统数据处理系统目前多采用配备操作软件包的工作站，用计算机控制，既可以对色谱数据进行自动处理，又可对色谱系统的参数进行自动控制。1.3色谱的定性定量分析色谱法是非常有效的分离和分析方法，同时还能将分离后的各种成分直接进行定性和定量分析。1.3.1定性分析色谱定性分析的任务是确定色谱图上每一个峰所代表的物质。由于能用于色谱分析的物质很多，不同组分在同一固定相上色谱峰出现时间可能相同，仅凭色谱峰对未知物定性有一定困难。对于一个未知样品，首先要了解它的来源、性质、分析目的，在此基础上，对样品可有初步估计，再结合已知纯物质或有关的色谱定性参考数据，用一定的方法进行定性鉴定。1.利用保留时间定性在一定的色谱系统和操作条件下，各种组分都有确定的保留时间，可以通过比较已知纯物质和未知组分的保留时间定性。如待测组分的保留值与在相同色谱条件下测得的已知纯物质的保留时间相同，则可以初步认为它们是属同一种物质。为了提高定性分析的可靠性，还可以进一步改变色谱条件（分离柱、流动相、柱温等）或在样品中添加标准物质，如果被测物的保留时间仍然与已知物质相同，则可以认为它们为同一物质。利用纯物质对照定性，首先要对试样的组分有初步了解，预先准备用于对照的已知纯物质（标准对照品）。该方法简便，是气相色谱定性中最常用的定性方法。2.柱前或柱后化学反应定性在色谱柱后装T形分流器，将分离后的组分导入官能团试剂反应管，利用官能团的特征反应定性。也可在进样前将被分离化合物与某些特殊反应试剂反应生成新的衍生物，于是，该化合物在色谱图上的出峰位置的大小就会发生变化甚至不被检测。由此得到被测化合物的结构信息。3.保留指数法对于气相色谱，可采用这种方法。保留指数法，又称为Kovats指数，与其他保留数据相比，是一种重现性较好的定性参数。保留指数是将正构烷烃作为标准物，把一个组分的保留行为换算成相当于含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述，这个相对指数称为保留指数，定义式如下。IX为待测组分的保留指数，z与z+n为正构烷烃对的碳数。规定正己烷、正庚烷及正辛烷等的保留指数为600、700、800，其他类推。在有关文献给定的操作条件下，将选定的标准和待测组分混合后进行色谱实验（要求被测组分的保留值在两个相邻的正构烷烃的保留值之间）。由式（1-4）计算则待测组分X的保留指数IX，再与文献值对照，即可定性。保留指数随温度的变化率还可用来判断化合物的类型，因为不同类型化合物的保留指数随温度的变化率不同。4.联用技术将色谱与质谱、红外光谱、核磁共振谱等具有定性能力的分析方法联用，复杂的混合物先经气相色谱分离成单一组分后，再利用质谱仪、红外光谱仪或核磁共振谱仪进行定性。未知物经色谱分离后，质谱可以很快地给出未知组分的相对分子质量和电离碎片，提供是否含有某些元素或基团的信息。红外光谱也可很快得到未知组分所含各类基团的信息。对结构鉴定提供可靠的论据。1.3.2 定量分析在一定的色谱操作条件下，流入检测器的待测组分i 的含量mi（质量或浓度）与检测器的响应信号（峰面积Ai 或峰高hi）成正比。 mi=fiAAi （1-5）或mi=fihhi （1-6）式中，fiA，fih是绝对校正因子。要准确进行定量分析，必须准确地测量响应信号，确定出定量校正因子。式（1-5）和式（1-6）是色谱定量分析的理论依据。1峰面积的测量（1）峰高乘半峰宽法：对于对称色谱峰，可用式（1-7）近似地计算出峰面积A=1.065hWh/2 （1-7）在相对计算时，系数1.065 可约去。色谱峰的峰高h 是其峰顶与基线之间的距离。（2）峰高乘平均峰宽法：对于不对称峰的测量，在峰高0.15和0.85处分别测出峰宽W0.15和W0.85，由式（1-8）近似计算峰面积此法测量时比较麻烦，但计算结果较准确。峰面积的大小不易受操作条件如柱温、流动相的流速、进样速度等的影响，因此更适合做定量分析的参数。（3）自动积分法：具有微处理机（工作站、数据站等），能自动测量色谱峰面积，对不同形状的色谱峰可以采用相应的计算程序自动计算，得出准确的结果，并由打印机打出保留时间和A 或h 等数据。2.定量校正因子（1）绝对校正因子：单位峰面积或峰高对应的组分i 的质量或浓度，即fiA=mi/Ai （1-9）和 fih=mi/hi （1-10）fiA，fih与检测器性能、组分和流动相性质及操作条件有关，不易准确测量。在定量分析中常用相对校正因子。（2）相对校正因子：组分i 与标准物质的绝对校正因子之比，即FisA=fiA/fsA= Asmi/Aims （1-11）Fish=fih/fsh = hsmi/hims （1-12）式中，FisA、Fish分别为组分i以峰面积和峰高为定量参数时的相对校正因子，fsA、fsh分别为基准组分s以峰面积和峰高为定量参数时的绝对校正因子，其余符号的含义同前。相对校正因子只与检测器类型有关，与色谱条件无关。由于绝对因子很少使用，因此，一般文献上提到的校正因子就是相对校正因子。需要注意的是，相对校正因子是一个无因次量，但它的数值与采用的计量单位有关。3.定量方法色谱法常采用归一化法、内标法、外标法进行定量分析。由于峰面积定量比峰高准确，所以常采用峰面积来进行定量分析。为表述方便，以下将相对校正因子简写为f。1）归一化法它是将试样中所有组分的含量之和按100%计算，以它们相应的色谱峰面积为定量参数。如果试样中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上都有响应信号，都能出现色谱峰，可用此法计算各待测组分X的含量。其计算公式如下。归一化法简便，准确，进样量多少不影响定量的准确性，操作条件的变动对结果的影响也较小，尤其适用多组分的同时测定。但若试样中有的组分不能出峰，则不能采用此法。2） 外标法直接比较法：将未知样品中某一物质的峰面积与该物质的标准品的峰面积直接比较进行定量。通常要求标准品的浓度与被测组分浓度接近，以减小定量误差。标准曲线法：取待测试样的纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液，分别取一定体积，进样分析。从色谱图上测出峰面积，以峰面积对含量作图即为标准曲线。然后在相同的色谱操作条件，分析待测试样，从色谱图上测出试样的峰面积（或峰高），由上述标准曲线查出待测组分的含量。外标法是最常用的定量方法。其优点是操作简便，不需要测定校正因子，计算简单。结果的准确性主要取决于进样的重现性和色谱操作条件的稳定性。3） 内标法内标法是在未知样品中加入已知浓度的标准物质（内标物），然后比较内标物和被测组分的峰面积，从而确定被测组分的浓度。由于内标物和被测组分处在同一基体中，因此可以消除基体带来的干扰。而且当仪器参数和洗脱条件发生非人为的变化时，内标物和样品组分都会受到同样的影响，这样消除了系统误差。当对样品的情况不了解，样品的基体很复杂或不需要测定样品中所有组分时，采用这种方法比较合适。内标物必须满足如下的条件：内标物与被测组分的物理化学性质要相似（如沸点、极性、化学结构等）；内标物应能完全溶解于被测样品（或溶剂）中，且不与被测样品起化学反应；内标物的出峰位置应该与被分析物质的出峰位置相近，且又能完全分离，目的是为了避免GC的不稳定性所造成的灵敏度的差异；选择合适的内标物加入量，使得内标物和被分析物质二者峰面积的匹配性大于75%，以免由于它们处在不同响应值区域而导致的灵敏度偏差。具体作法是准确称取m（g）试样i，加入ms（g）内标物s，根据试样和内标物的质量比及相应的峰面积之比，由式（1-14）计算待测组分的含量由于内标法中以内标物为基准，所以fs=1。内标法的优点是定量准确。因为该法是用待测组分和内标物的峰面积的相对值进行计算，所以不要求严格控制进样量和操作条件，试样中含有不出峰的组分时也能使用，但每次分析都要准确称取或量取试样和内标物的量，比较费时。为了减少称量和测定校正因子可采用内标标准曲线法简化内标法。在一定实验条件下，待测组分的含量mi与Ai/As 成正比例。先用待测组分的纯品配置一系列已知浓度的标准溶液，加入相同量的内标物；再将同样量的内标物加入到同体积的待测样品溶液中，分别进样，测出Ai/As，作Ai/Asm 或Ai/AsC 图，由Ai/As 即可从标准曲线上查得待测组分的含量。1.4 实验技术1.4.1 色谱柱的清洗玻璃柱的清洗可选择酸洗液浸泡、冲洗。铜柱可用10%的HCl 溶液浸泡、冲洗。对于不锈钢柱可以5%10%NaOH 热水溶液浸泡、冲洗，除去壁管上的油污。然后用自来水洗至中性，最后用蒸馏水冲洗几次，在120 的烘箱中烘干后备用。对于已经用过的柱子，可选用能溶解固定液的溶剂来洗涤。1.4.2 担体处理及固定液涂渍担体主要是起承载固定液的作用，在实际使用中往往有不同程度的催化活性，当分离极性物质时，对组分有明显的吸附作用，其结果是造成色谱峰严重不对称，故而在使用前需经酸洗、碱洗和硅烷化，有时需要作釉化处理。市售担体有些已经处理，过筛后即可使用，涂渍前将担体放在105 烘箱中烘4 h6 h，除去吸附在担体表面的水蒸气等。在气相色谱分析中固定液的选择是样品组分之间分离成败的关键。根据“相似相溶”的原则，选择与样品相匹配的固定液。固定液选好后，根据担体的液担比计算出固定液的用量。涂渍时，称取适量的固定液于烧杯中，加入适当的易挥发有机溶剂使其溶解，通常溶剂的体积是担体体积的1.5 倍，可以在水浴上加热以加速溶解。溶解后，加入担体，用玻璃棒轻轻搅拌，防止担体破碎。在蒸发溶剂时，可根据溶剂的挥发性采用自然挥发、红外灯烤等方法，使溶剂慢慢挥发，并轻轻搅动，使固定液在担体表面上形成一层薄而均匀的液膜。待有机溶剂恢复完毕，移至红外干燥箱，烘干20 min30 min，即可准备装柱。1.4.3 色谱柱的填充和老化色谱柱填料制备完毕后，过筛，以除去涂渍过程中产生的细粉，再装柱。装填一般采用减压装柱法。将柱管的一端用玻璃棉或其他的透气性好的材料隔层后与真空泵系统相连，另一端通过漏斗加入固定相。在装填固定相时，边抽气边用小木棒轻轻敲打柱管的各个部位，使固定相装填紧密而均匀，直至装满。然后将柱管两端的填料展平后塞入玻璃棉备用。为了彻底清除固定相中残余的溶剂和易挥发物质，使固定液液膜变得更均匀，能牢固地分布在担体表面上，对填充的色谱柱必须进行老化。老化的方法是把柱子入口端（填充时接漏斗端）与汽化室出口相接，另一端放空，通入载气（N2），流速为1520 mLmin-1，先在低柱温下加热1 h2 h，然后慢慢将柱温升至固定液最高使用温度之下2030 为止。老化时间一般为8 h12 h。然后接入检测器，观察记录的基线，平直的基线说明老化处理完毕。1.4.4 色谱仪的日常维护气路的清洗：色谱仪工作一段时间后，在色谱柱与检测器之间的管路可能被污染，最好卸下来用乙醇浸泡冲洗几次，干燥后再接上。空气压缩机出口至色谱仪空气入口之间，经常会出现冷凝水，应将入口端卸开，再打开空气压缩机吹干。为清洗汽化室，可先卸掉色谱柱，在加热和通载气的情况下，由进样口注入乙醇或丙酮反复清洗，继续加热通载气使汽化室干燥。热导池检测器的清洗：拆下色谱柱，换上一段干净的短管，通入载气，将柱箱及检测器升温到200250 ，从进样口注入2 mL 乙醇或丙酮，重复几次，继续通载气至干燥。如果没清洗干净，可小心卸下检测器，用有机溶剂浸泡、冲洗。切勿将热丝冲断或使其变形，与池体短路。氢火焰检测器的清洗：发现离子室发黑、生锈、绝缘能力降低而发生漏电时，可卸下收集极、极化极和喷嘴，用乙醇浸泡擦洗，然后用吹风机吹干。再将陶瓷绝缘体用乙醇浸泡、冲洗、吹干。1.5 实验1.5.1 气相色谱的内标法定量分析1目的与要求（1） 熟悉相对校正因子定义以及求取方法。（2） 掌握内标法定量公式及其应用。（3） 熟悉氢火焰监测器的特点和使用方法。2实验原理气相色谱法是以气体（此气体称为载气）为流动相的柱色谱分离技术。其原理是利用被分离分析的物质（组分）在色谱柱中的气相（载气）和固定（液）相之间分配系数的差异，在两相作相对运动时，在两相间作反复多次（103105次）的分配，使得原来的微小差别变大，从而使各组分达到分离的目的。根据色谱图进行组分的定量时，所用定量方法主要有归一化法、内标法和外标法3 种。当试样组分不能全部从色谱柱流出，或有些组分在检测器上没有信号时，就不能使用归一化法，这时可用内标法。内标法是气相色谱所常用的一种比较准确的定量方法。当样品中的所有组分因各种原因不能全部流出色谱柱，或检测器不能对各组分都有响应，或只需测定样品中某几个组分时，可采用内标法定量。内标法的基本过程是:准确称取质量为Wm的样品，加入质量为Ws的内标物，用溶剂配成一定浓度的溶液，进行气相色谱分析，然后根据被测物和内标物的质量及其在色谱图上的峰面积比，求出被测组分的含量，计算公式如下。式中，Pi是组分i的百分含量；Ai，As分别是被测组分和内标物的峰面积；fi、fs分别是被测组分和内标物的重量校正因子二者之比（ fi/ fs）可由标准样品按照上述方法进行测试并计算得。内标法必须有合适的内标物，基本条件是：它在样品中不存在、无化学反应、稳定、纯度高、性质尽量与被测组分接近，能与样品互溶、色谱峰能完全分离并比较接近被测组分的色谱峰、物质特有的校正因子应为已知的或者可测定。内标物的量也应与被测组分的量相当，以提高定量分析的准确度。内标法不需要被测样品中的所有的组分从色谱柱完全流出或被检测器检测出，不像归一化法存在使用上的限制。由于内标物和被测组分处在同一基体中，因此可以消除基体带来的干扰。而且当仪器参数和洗脱条件发生非人为的变化时，内标物和样品组分都会受到同样影响，这样消除了系统误差。但对内标选择的条件比较苛刻，多了一个内标物增加了分离的要求。内标法缺点是每次测定都要用分析天平准确称取内标物和样品，所以较费时。3仪器与试剂仪器: 安捷伦6890N 气相色谱仪，氢火焰离子化检测器。色谱柱：HP-5M5I 毛细管柱（30m0.25mm0.25mm）。试剂：氢气、氮气、压缩空气；三氯甲烷（分析纯）；二氯苯、二甲苯标样；内标物分别为氯苯、甲苯；含上述成分未知样品、。4实验内容与步骤1） 准备与开机（1） 打开主机箱门，在进样口和检测器间安装HP-5M5I 毛细管柱。（2） 打开氮气、空气和氢气开关。（3） 打开计算机电源开关，打开GC 电源开关。（4） 双击桌面上的Instrument Online 图标进入工作站系统。2） 样品分析与采集数据（1） 在Method nd Runcontrol 界面上依次选择File Load Method，选择分析方法文件。也可以选择Method Edit Method 进行参数修改。进样口：温度 270，分流比10:1。色谱柱：HP-5MSI 毛细管柱（30m0.25mm0.25mm），柱内流量为1.5mLmin-1。柱温：检测器：温度 270 ，氢气流量为30 mLmin-1，空气为300 mLmin-1。（2）手动进样：在Method nd Runcontrol界面上选择 RuncontrolSample Information，依提示输入保存路径、文件名称、样品名称、操作者等信息，进样时同时按GC 面板上的Start 键，即开始样品分析与数据采集。（3） 样品分析：用微量注射器分别移取上述标样、样品各0.5L 进样分析，各重复3 次。3） 报告输出（1）在Instrument Offline主界面上依次选择ViewData Analysis，进入界面。（2） 选择所要处理的数据文件。（3） 选择所要选用的报告格式，输出报告。4） 关机（1） 待气化室及检测器稳定降到150 以下、柱温降到接近室温，方可关机。（2） 在Instrument Online 主界面上退出色谱工作站。（3） 依次关闭GC 电源，计算机电源。（4） 关闭气源和总电源。5数据处理（1） 确定样品中测定组分的色谱峰位置。（2） 计算校正系数i f / s f 。（3） 计算样品中测定的各组分的含量及数据的偏差。6注意事项（1） 必须先通入载气，再开电源，实验结束时应先关掉电源，再关载气。（2） 本气相色谱仪检测器采用启动点火装置，在点火后要检查氢火焰是否已经点燃，若未能成功点燃，须在Edit MethodDetector 下点击Reignite 进行重新点火。（3） 在进样之前，必须修改文件的路径，否则会冲毁上次的分析结果。（4） 确保每次移取样品的体积相同；进样要用手护住注射器的金属针部分，迅速、垂直向下，确保样品在气化室中瞬间气化，以免将其扭曲甚至折断。（5） 切忌将大量氢气排入室内。（6） 注意气瓶温度不要超过40，在2 m 以内不得有明火。使用完毕，立即关闭氢气钢瓶的气阀。7思考题（1） 你认为实验中所选取的内标物是否合适？为什么？（2） 比较气相色谱法中归一法、内标法、外标法3 种定量方法的优缺点。（3） 氢火焰检测器的原理及其应用范围。1.5.2 程序升温毛细管柱色谱法分析中药小茴挥发油中的反式茴香醚1实验目的（1） 了解程序升温在气相色谱分析中的重要作用。（2） 学会程序升温的操作方法。（3） 了解毛细管柱的功能、操作方法与应用。2实验原理程序升温是气相色谱分析中一项常用而且十分重要的技术，对于每一个待分析的组分来说，都对应着一个最佳的柱温，但是当分析样品比较复杂，沸程很宽的时候，若使用同一柱温进行分离，其分离效果很差，因为低沸点的组分由于柱温太高，很早流出色谱柱，色谱峰重叠在一起不易分开，而高沸点的组分则因为柱温太低，很晚流出色谱柱，甚至不流出色谱柱。其结果是各组分的色谱峰疏密不均，有时还出现“怪峰”。给分析工作带来困难，因此，对于宽沸程多组分的混合物样品，必须采用程序升温来代替等温操作，程序升温的方式可分为线性升温和非线性升温，根据分析任务的具体情况，通过实验选择适宜的升温方式，就可以得到比较理想的分离效果。毛细管柱的柱效要比填充柱高很多，这是由于单位柱长液相体积小，气相体积大（开管柱），在一定温度下容量比降低，从而使得理论塔板数增加，因此在分离难分离物质对（如a =1.03）时，必须采用毛细管柱色谱。由于它的分离效率高，因而对所涂渍的固定液性质要求不像填充柱那样苛刻，避免了精选固定液的麻烦，只需几根极性不同的毛细管柱即可解决大多数较复杂样品的分析。3仪器与试剂仪器：气相色谱仪，带氢火焰离子化检测器和程序升温装置；色谱柱，HP-5MSI 毛细管柱（30 m0.25 mm0.25 mm）。试剂：氢气、压缩空气、氮气、小茴、反式茴香醚标样。4实验内容及步骤（1） 制备小茴挥发油的方法是先称取50g 小茴中药材，按常规方法进行水蒸气蒸馏，用正己烷作溶剂进行萃取，收取有机相，在真空条件下旋蒸除去正己烷溶剂，剩余少量有机相萃取物作为分析样品。（2） 通氮气，调节流速约为30 mLmin-1。（3） 设置柱温升温程序：初始温度为50；50（10 min）70（5min），升温速率为2min-1，再升至150（2 min），升温速率为5min-1。最终升至温度200（10 min），升温速率为2min-1，进样口温度为250。（4） 通氮气和空气，氮气与空气的流量比为50 mLmin-1 : 500 mLmin-1。（5） 点火，检查氢火焰是否点燃。（6） 打开色谱数据处理机，输入测量参数，开始走基线，检查基线是否平直。（7） 注入0.6 L 小茴挥发油样品。（8） 注入0.2 L 反式茴香醚标样。（9） 设置柱温200 ，在等温条件下重复上述操作。（10） 实验结束后关闭电源、氮气、空气，待柱温降至室温后关闭载气。5数据处理（1） 计算反式茴香醚的绝对校正因子，计算小茴挥发油中反式茴香醚含量。（2） 以反式茴香醚为指定组分，计算所用色谱柱的有效理论塔板数（假定第一个色谱峰的保留时间为tM）。（3）用面积（或峰高）归一化法，计算反式茴香醚的含量，并比较两种计算结果。（4） 计算反式茴香醚的分离度。（5） 比较等温和程序升温分析结果并加以讨论。6注意事项（1） 氢火焰离子化检测器在点火时，可先通入稍大于工作流的氢气，以利于点火，氢火焰点燃后再调至规定的流速。（2） 为了便于测量，调节适当的峰宽参数。（3） 在进行旋蒸除溶剂时，要控制适当的蒸发速度。7思考题（1） 简述氢火焰检测器和热导检测器各自的特点和适用范围。（2） 升温程序设计的依据是什么？终止温度由什么因素决定？（3） 简要讨论毛细管柱色谱法与填充柱色谱法的特点和应用范围。 北京北分兴宇仪器有限公司