质谱质谱基础_仪器_应用（浙江大学PPT课件）.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五,第三章：质谱/质谱,*,第三章：质谱/质谱,3.1 质谱/质谱基础,3.2 质谱/质谱仪器,3.3 质谱/质谱应用,3.1 质谱/质谱基础,根据不同的需要，将各种类型的质量分析器以不同的方式联结起来，提供更为强大的质谱分析功能，解决气相离子的各种问题。,一、基本概念,1、质谱/质谱与色谱/质谱串联技术的比较,串联的概念是一致的。,色谱/质谱：中性混合物的分离分析。,质谱/质谱,：,对纯物质，分别研究分子离子和碎片离子，结构结构信息。,对混合物，分别研究各个不同的分子离子，具有部分分离能力，各个物质的结构信息。,2、质量分析器串联方式,空间上的串联(,tandem in space),将同类型种或不同类型的质量分析器依次联结在一起。,a),同种类型的质量分析器串联,扇形磁场、扇形静电场串联质谱。,四极杆串联质谱。,飞行时间串联质谱。,b),混合型串联质谱,(,hybrid mass spectrometry),扇形磁场、扇形电场和四极杆串联。,扇形磁场、扇形电场和飞行时间质谱串联。,四极杆和飞行时间质谱串联。,离子阱和飞行时间质谱串联。,时间上的串联(,tandem in time),在同一质量分析器上，在不同时间里，依次实现离子的选取、离子的碰撞诱导解离(或碰撞活化解离)、离子的分析，时间上的串联,。,离子阱质谱仪。,离子回旋共振质谱仪。,3、质谱仪内离子分解的方式,亚稳分解(,Metastable,Decomposition,MD),碰撞诱导解离(,Collisional,Induced Dissociation,CID),或碰撞活化解离(,Collisional,Activation Dissociation,CAD),表面诱导解离(,Surface Induced Dissociation,SID),黑体红外辐射解离,(,Blackbody Infra-Red Dissociation,BIRD),光解离(,Photo-Dissociation,PD),a),红外多光子解离(,Infra-Red Multi-Photon Dissociation,IRMPD,),b),紫外光解离(,Ulta,-Violet,Photon Dissociation,UVPD),电子捕获解离(,Electron Capture Dissociation,ECD),二、质谱/质谱中离子的能量分布,质谱中的三种类型离子，对于电磁质谱来说，离子源内产生的离子：,稳定离子 离子寿命大于10,s,分解速率小于10,5,，正常离子峰。,不稳定离子，离子寿命小于 1,s，,分解速率大于10,6,，检测不到。,亚稳离子，离子寿命介于1-10,s,分解速率在10,5,到10,6,之间，亚稳峰。,1、亚稳离子,分解过程中不专与任何其它粒子(包括中性分子、离子、电子或光子,),进行能量交换，分解的驱动主要是沉积在离子上的略高于分解反应临界能的内能，分解速率在10,5,10,6,之间。,主要出现在扇形电磁质谱和飞行时间质谱中。,电磁质谱中亚稳离子的内能和寿命的关系见右图和下图：,A,+,B,+,E,a,10,-6,10,-5,s,A,+,反应坐标,内能,电磁质谱中的亚稳分解一般发生在无场区中进行，,BE,或,EB,型质谱仪中，有第一无场区(,IFFR)、,第二无场区(2,FFR),和第三无场区(3,FFR)，,可采用联动扫描方式分析。,飞行时间质谱亚稳分解发生在飞行管无场区中，通过源后分解技术(,Post Source Delay,PSD),测定。,亚稳,离子分解能量示意图,I,II,B,+,III,E,a,E,i,E,b,A,+,2、内能分布及离子结构对离子分解的影响,基本原理,设有两个离子,A,+,和,B,+,，,它们分解的临界能分别为,E,a,和,E,b,，,它们之间相互转化的临界能为,E,i,，,当,离子内能分别处于,I，II,和,III,区时，离子会以不同的形式存在，在质谱仪也将检测到不同的离子。,I：,稳定的,A,+,离子。,II：A,+,可以异构化为,B,+,，,但在质谱上表,观测,到的,是“同一离子”(质荷比相同)，实际上是,A,+,和,B,+,的混合离子。,III：,过剩内能不太大，发生亚稳分解反应。,IV：A,+,和,B,+,离子的混合物的分解，产生各自的碎片。,详细分析,A,+,为,初始离子，,B,+,为,A,+,的异构体：,(,a)：,E,i,高于,E,a,和,E,b,A1,以下：内能较低时(不高于亚稳离子分解的临界能,E,A,)，,稳定的,A,+,离子。,A1A2:A,+,的亚稳,分解。,A2A3：A,+,分解，产生其碎片离子。,A3,以上：,A,+,可以异构化为,B,+,，,但,B,+,离子在该内能处，离子的态密度很小，反应速率很小，两种异构体是可以区分的。,(,b)：,E,i,低于,E,a,和,E,b,B1,以下：稳定离子，,A,+,或,A,+,和,B,+,的混合离子。,B1B2:A,+,异构化为,B,+,，B,+,亚稳分解。,B2B4:B,+,分解，产生其碎片离子。,B4,以上：,A,+,和,B,+,混合离子分解，产生混合碎片离子，各离子的份额与其内能值有关,。亚稳,分解谱上，,B,+,占优势；,CID,谱上，,A,+,的比例增加，在质谱分解的时间范围内，,A,+,和,B,+,不能建立快速的平衡，因此,MI,和,CID,谱上，有一定的区别。,(,c)：,E,i,远低于,E,a,和,E,b,B1,以下：,A,+,和,B,+,混合物的稳定离子，因两者间 非常容易转化。,B1B4:A,+,和,B,+,混合物的分解。,A,+,和,B,+,无法区分。,(,d)：,E,a,高于,E,i,高于,E,b,小于,E,i,时：稳定的,A,+,离子。,C1C2:A,+,以亚,稳,的速度转化为,B,+,后分解，,得到,B,+,离子的碎片。,C2,以上:,A,+,转化为,B,+,后再分解，得到,B,+,离子的碎片离子。,2,1,C,3、碰撞诱导解离过程中的能量转换,对于内能较小的稳定离子，进行,MS/MS,实验时，需要为该离子提供能量，使其内能超过该离子分解的临界能。,具有一定动能的前体离子与中性气体碰撞，在发生的非弹性碰撞中，离子的部分动能转化为内能。转化而来的内能与离子的动能以及碰撞气体的反应截面有关。,碰撞能量表示方式,高能：千,eV,数量级。磁质谱、飞行时间串联质谱等。,中能：百,eV,数量级。四极杆质谱等。,低能：十,eV,数量级。离子阱质谱等。,此处指实验室坐标下的能量，用离子运动的动能,E,lab,表示。,实际上，决定碰撞能量转换的是质心坐标能量,E,cm,，,二者的关系：,m,g,:,碰撞气体质量,m,p：,离子质量,合适的内能分布产生有价值的,MS/MS,谱,图，需选择合适的,E,cm,：,E,lab,大者，选取小的,m,g,，,如,He,Ne,等。,E,lab,小,者，选取大的,m,g,，,如,N,2,、,Ar,或,Xe,等。,例：在磁质谱中，,m/z200,的,离子经6,keV,的电压加速后与,He,碰撞时，计算,E,cm,;,在四极杆,质谱仪中，,m/z200,离子的动能为100,eV,，,与,Ar,碰撞，计算,E,cm,。,m,g,:,碰撞气体质量,m,p：,离子质量,磁质谱,四极杆,电子轰击：,E,cm,E,lab,因为电子质量非常小，,m,p,相对于,m,g,可以忽略不计。,碰撞能量向内能的转化,碰撞过程遵守能量和动量守衡原理。,离子运动的动能,E,cm,，,碰撞过程中转化为内能,Q,，,但,E,cm,不是全部转化为,Q,，,而是部分转化。单次碰撞的转化效率与离子的碰撞截面、气体的碰撞截面有关。,E,Q,E,E,0,E,0,r,M,1,+,M,2,+,+M,3,动位移,反应坐标,内,能,例：正丁基苯分子离子断裂反应碰撞能转化为内能的效率,左：化学电离正丁基苯方法产生正丁基苯分子离子，采用不同电荷交换能力的化学电离试剂，生成的,M,+,具有相对确定的内能值。,内能越高，,I,91/92,越大，越易生成,m/z91。m/z91,离子的生成是键断裂反应，“疏松型”过渡态，高内能时有利于该反应。,m/z92,离子的生成是六元环重排反应，“紧密型”过渡态，低内能时有利。,右：正丁基苯分子离子在不同,E,lab,和,E,cm,条件下,CID,谱图。与左图相似。,当,I,91/92,=1.4,时，右图,E,cm,=3.7eV，,左图 内能,=3.2,eV。,即,E,cm,=3.7eV,内能,=3.2,eV。,此时，,E,cm,转化为内能的效率为 3.2/3.7=86%。,内能,同理：,当,I,91/92,=2.7,时，右图,E,cm,=9eV，,左图 内能,=4.6,eV。,即,E,cm,=9eV,内能,=4.6,eV。,此时，,E,cm,转化为内能的效率为 4.6/9=50%。,在高的碰撞能,E,cm,下，离子从碰撞中转化而来的内能较高，碰撞能转化为内能的效率下降。,能量转化的影响因素,CID,实验时，需要得到较合适前体离子的内能分布，从而获得信息丰富的谱图。,影响因素：,E,cm,越大，转化的内能越高。,碰撞气体压力，提高压力，有利于前体离子内能的积累。,原因：当提高碰撞气压力时，碰撞机率增加。,前体,离子多次碰撞，每一次均获得一定量内能，积累出分解所需的内能。,前体,离子分解的离子进一步与碰撞气碰撞，子离子获得分解所需的内能，,继续分解。,M,p,+,M,p,+*,M,p,+*,产物,M,p,+,M,f1,+,M,f2,+,N,N,N,N,碰撞气压力下，碎片离子的产率与靶气密度、碰撞截面和碰撞室的长度对入射离子强度和出口离子强度的关系式：,I,f,:,产物离子强度,I,p,：,进入碰撞室前体离子强度，即在没有碰撞气时主束离子的强度,n,D,:,碰撞气的数密度,：碰撞截面,L,：,碰撞室长度。,由此公式可以计算碰撞截面，与结构密切相关的一个参数。,CID,谱反映的是稳定离子的结构，碰撞过程中，离子从碰撞能中获得能量，使其激发到较高的振动能级上，达到其导异构化或分解所需要的能量，两者是一个竞争的反应。但只要异构化临界能不是太小，则前体离子直接分解的速度一般大于异构化的速率，因此前体离子会主要以直接分解的反应途径分解，同时可能伴有异构化离子的分解。所以，在大多数情况下，对于不同的离子,A,+,和,B,+,，,具有不同的,CID,谱，这为利用,MS/MS,研究离子结构奠定了基础。,值得指出的是，具有相同的,CID,谱的离子不一定具有相同的结构，如在异构化临界能很低时，初始的前体离子与其异构化离子在,CID,谱上是不能区分的，这种情况虽然不是很普遍，但应给予注意。相反，具有相同结构的离子，一定有相同的,CID,谱。,与亚稳分解相比，,CID,谱中离子的反应通道更多，分子离子的,CID,谱与其常规的,EI,谱很相似，主要是由于碰撞可以获得更多的内能，使前体离子分解。,亚稳谱研究的离子，其内能分布在一个很窄的范围，只有少量的反应通道，分解的产物离子种类少。,若两个离子结构相同，则其,MI,和,CID,谱均应相同，若两个离子结构不同，其,CID,谱很可能不同，但其,MI,谱不一定不同。因为,MI,谱中研究的是内能相对较高的离子，在分解之前，很可能会发生异构化，其谱图是一个包含异构化离子在内的离子分解的混合谱图。,CID,相对于,MI,而言，选取的是内能低的离子，大部分保持其初始结构，有很好的可区别性。,4、光解离中的能量转换,AB,+,AB,+*,AB,+,+h,荧光发射,AB,+,AB,+*,A,+,+B,直接解离,AB,+,AB,+*,AB,+*,A,+,+B,预解离,h,h,h,紫外光解离,使用紫外光如193,nm,解离，能量较高，可以将处于电子基态的离子跃迁到各激发态上。然后进行解离，这是一种高内能的解离过程。其结果与高能碰撞有相似之处。,激发后的离子分解经历以下主要过程：,光解离：,无须碰撞气。,解离效率相对较高。,相对高能量，丰富的碎片离子。,产生多次裂解，不利。,光解离：,无须碰撞气。,解离效率相对较高。,专一裂解性。,产生多次裂解，不利。,红外多光子解离,AB,+,AB,+*,A,+,+B,直接解离,nh,用红外光(如10.6,m),照射离子，离子吸收多个红外光子的,能量，使内能提高。由于所用的红外光子的能量在振动能级的水平，吸收的光子的能量主要使离子的振动能级激发，达到或超过离子分解的临界能，从而产生碎片离子。这是一种低能的过程。其结果与某些低能碰撞有相似之处。,激发后的离子分解经历以下主要过程：,多光子吸收过程,3.2 质谱/质谱仪器,一、,BE,或,EB,型,电磁场,双聚焦质,谱仪,三个无场区,I，II，III(1FFR,2FFR,3FFR)。,狭,缝，主狭缝。,亚稳分解发生在三个无场区。,反几何型,正几何型,1、,亚稳离子分析,常归扫描质谱的亚稳离子峰,在常规的质谱分析谱图上，有时会在非整数质量数处出现峰较宽，强度不大的峰，这些峰为亚稳峰，其来源为某些分解速度为10,5,10,6,的离子，在离开离子源于无场区内分解所产生，其质量数不出现“真实”的,m/z,位置，而在质谱图上出现“表观”,m/z,位置。,在常规的质谱图能够观察到亚稳峰的仪器：,单聚焦质谱仪：亚稳分解发生在磁场前面的无场区,正置双聚焦,EB,质谱仪：亚稳分解发生磁场前面的无场区，即第二无场区。,稳定离子,M,+,和稳定的碎片离子(离子源中产生的),M,1,+,遵守的基本方程：,其中：,m,:M,+,的质量,V,:,加速电压,v,:,离子运动速度,B,:,磁场强度,r,:,离子动行半径,该方程对于稳定的,M,1,+,离子也适用，只需将,m,换成,m,1,即可，公式如下。,三种不同类型的离子:稳定离子(,M,+,),、,不稳定离子(,M,+,),和亚,稳,离子(,M,+,*,)：,稳定离子,M,+,不分解，检测到,M,+,。,不稳定离子,M,+,M,1,+,+M,2,离子源内分解，产生,M,1,+,，,检测到,M,1,+,。,亚稳离子,M,+,*,M,1,+,+M,2,无场区内分解，产生,M,1,+*,，,检测到“表观质量”。,亚稳离子,M,+,*,在场区飞行时发生分解，产生,M,1,+*,和,M,2,。M,1,+*,和,M,2,具有与,M,+,相同的运动速度，但,M,1,+*,的动能仅为,m,1,v,2,/2。,M,+,*,经加速电压加速后所得能量,z,eV,亚稳分解的,M,1,+*,离子的加速电场能为,m,1,/,mzeV,。,m,1,+,m,2,=,m,由,M,1,+*,和,M,2,来分配,M,+*,的能量，即,m,1,/,mzeV,+,m,2,/,meV,=,z,eV,。,亚稳,M,1,+*,：,若要,M,1,+*,通过磁场，其在磁场中也需做半径为,r,的圆周运动，此时,M,1,+*,也应符合电磁场质谱的基本方程：,正常,M,1,+,：,此式表明，在磁场前无场区,M,+,*,分解所产生的,M,1,+*,，,将在质量数为,m,1,2,/,m,的位置出现质谱图中，该数值为“表观质量”，该离子的“真实质量”为,m,1,，,表观质量比真实质量小。,亚,稳,离子分解反应时，部分内能转换成动能，亚稳离子的峰具有不同程度的扩散，导致峰变宽、变弱，其质心位置不易准确判定。,例：邻硝基甲苯和对硝基甲苯准分子离子的亚稳分解,59,60,59.5,83,82,82.6,亚稳实验证实邻硝基甲苯和对硝基甲苯的准分子离子峰失去硝基和亚硝基的机理是不一致的。,离子动能谱,(,Ion Kinetic Energy Spectrum,IKES),和质量分析离子动能谱,(,Mass Analyzed Ion Kinetic Energy Spectrum,MIKES),前者在正置几何型,EB,上实现，后者在反置几何型,BE,上实现，均将磁场设为回定值，扫描静电场，分别得到碎片离子找前体离子和前体离子找碎片离子的功能。后者还可以将磁场前面加一个碰撞室，对前体离子加以碰撞，实现所谓的,CID-MIKES，,对于研究离子结构非常有用。,反几何型,正几何型,a)IKES：,正置几何质谱,对于稳定的离子,M,+,其,通过静电分析器的条件为：,静电场必须与加速电压保持一定的关系，才能使得从离子源中出来的稳定离子通过静电场。只要保持了这种关系，所有稳定的离子所获得的动能会使得其通过静电场，此时的静电场只起到一个离子能量的聚焦作用，不能起到分离子的作用。在常规的扫描中，加速电压固定，静电场也随之固定。,不含,m,第一无场区亚稳分解：,对于稳定的,m,+,其动能为,mv,2,/2=,eV,，,恰好能够通过静电场。,而对于,M,+*,其动能亦为,mv,2,/2=,eV,，,但在第一无场区分解后，,M,1,+,所具有的动能为,m,1,v,2,/2,=m,1,/,meV,小于,M,+*,的动能,该离子不能够通过静电场，所以检测不到该离子。其它的亚稳离子与该离子相同。,E,1,能够使第一无场区发生的亚稳分解，碎片离子和前体离子之间满足,m,1,/,m,=,E,1,的所有离子都能通过静电场，如果将检测器置于静电场后面，则检测到的是,一组,离子。,向下扫描静电场，可使具有不同,m,1,/,m,值的亚稳分解一组离子依次通过静电场，得到,IKES。,也可以将磁场设定某一固定值，只允许某组特定动量的离子通过，则在电场扫描时，分析的离子不仅满足,m,1,/,m,=,E,1,而且还要满足,m,1,2,/,m,=,表观质量。这样使得分析结果更清楚。,加速,电压,时间,第1无场区,离子源,静电场,动,能,M,+,M,f,+,电场电压,E,，,正常离子,M,+,通过。,电场电压,E,1,，,降低电场强度可使,M,1,+,通过。,E,1,=,m,1,/,mE,。,b)MIKES：,反置几何质谱,第2无场区亚稳分解：,第2无场区碰撞诱导分解：,前面讨论的结论仍然有效：,令磁场只允许通过,M,+*,该离子在第2无场区中发生亚稳分解，扫描静电场，使亚稳分解产生的离子,M,1,+,M,2,+,M,3,+,等依次通过静电场，得到,MIKES。,在第2无场区中安装碰撞室，可利用磁场选择各种稳定离子,M,+,或亚稳离子,M,+*,，,碰撞室内充入氦气或氩气，通过碰撞，可使,M,+,分解成多种碎片离子，再结电场扫描得到,CID-MIKES。,最简单的,MS/MS。,加速,电压,时间,第1无场区,离子源,静电场,动,能,M,+,M,+,M,1,+,第2无场区,磁场,静电场,磁场,碰,撞,室,电场电压,E,1,，,降低电场强度可使,M,1,+,通过。,E,1,=,m,1,/,mE,。,电场电压,E,，,正常离子,M,+,通过。,双,电荷离子的,MIKES，,略,n,-,十六碳烷,M,+,的,MIKES,有关公式的推导：,M,+*,M,1,+,+M,2,动能,p,动量,稳定离子,M,+,和亚稳离子,M,+*,:,eV,(2,m,),1/2,离子源中产生的稳定离子,M,1,+,:,eV,(2,m,1,),1/2,亚稳分解得到的,M,1,+,:,m,1,/,meV,为使亚稳分解的,M,1,+,通过静电场，静电场场强应下降到,E,1,E,1,=,m,1,/,mE,基本公式,m,1,=,mE,1,/E,由此公式得到碎片离子质量。,常用联动扫描质谱检测亚稳离子,M,+*,M,1,+,+M,2,动能,p,动量,稳定离子,M,+,和亚稳离子,M,+*,:,eV,(2,m,),1/2,=,(2,m,eV,),1/2,亚稳分解得到的,M,1,+,:,m,1,/,m,eV,(2,m,1,),1/2,=,(2,m,1,2,/,m,eV,),1/2,若能够使稳定离子,M,+,通过静电场所需的电场强度设为,E,，,则为了使亚稳分解的,M,1,+,能够通过静电场，静电场强度应下降到,E,1,，,且：,a)B/E,联动扫描,亚稳分解发生在第一无场区，,EB,和,BE,型质谱仪均适用，得到前体离子找碎片离子质谱。,设在第一无场区内发生如下亚稳分解反应，而且仪器的加速电压,V,保持不变，,则各种离子的有关物理量如下：,能够使稳定离子,M,+,通过磁场所需的磁场强度设为,B,，,则为了使亚稳分解的,M,1,+,能够通过磁场，磁场强度应变到,B,1,，,且：,(,1)和(2)比较得：,(3)式表明，磁场强度,B,与静电场强度,E,之比，对母离子和子离子均为常数。,B,/,E,联动扫描的实现方式：在加速电压为,V,，,静电场电压为,E,，,扫描磁场强度,B,，,找到,M,+,后，保持加速电压不变，并使静电场电压与加速电压脱离固定关系。锁定,B,/,E,关系，然后将磁场和静电场均降为最小值，令,B,/,E,为常数联合向高场方向扫描，从而得到母离子的各种碎片离子峰。子离子的质量可从以下两式求出：,B,/,E,联动扫描的优点是第一无场区由前体离子找碎片离子的最佳亚稳测定方法。扫描过程中，离子源状态下变，质量范围宽，亚稳峰形窄，分辨本领高。,目前的仪器，厂商都备有,B/E,联动扫描的操作软件，计算系统与主机联机操作，可得到,B/E,联动扫措谱。,此方法的特点是先找到,M,+,，,称主束离子，然后利用固定的,B,/,E,的,关系找到其不同的子离子,M,1,+,，,这种方式是典型的“母”(主束离子,M,+,),找“子”(碎片离子,M,1,+,),联合扫描方式。,正如,IKES,一样，联动扫描可能得到的不是纯粹的“子离子”。因为即使是不同的亚稳分解，但如果其碎片离子,M,1,+,和前体离子,M,+,的,m,1,/,m,比值相同，则在联动扫描过程中，不同质量数的,M,1,+,离子均能通过电场和磁场，从而得到是混合离子峰。但一般情况下，纯化合物中，同时发生具有,m,1,/,m,相同比值的亚稳分解反应的可能性不大，因此该方法是一个可靠地进行“母”和“子”关系证明的有效手段。,同时被扫描，得到相同的峰，从峰的位置不能区分二反应，但实际上峰形可能不同，见亚稳离子的峰形。,a)B,2,/E,联动扫描,亚稳分解发生在第一无场区，,EB,和,BE,型质谱仪均适用，得到由碎片离子找前体离子的质谱峰。,设在第一无场区内发生如下亚稳分解反应，而且仪器的加速电压,V,保持不变，,则正常扫描时，各种离子的有关物理量如下：,M,+*,M,1,+,+M,2,动能,p,动量,稳定离子,M,+,和亚稳离子,M,+*,:,eV,(2,m,),1/2,=,(2,m,eV,),1/2,离子源中产生的稳定离子,M,1,+,：,eV,(2,m,1,),1/2,=,(2,m,1,eV,),1/2,正常扫描条件下，若仪器处在,M,1,+,通过静电场各磁场状态，得到,M,1,+,的主束离子。,现假设主束离子,M,1,+,是由,M,+*,在第一无场区经亚稳分解而产生，为了使该,M,+*,通过静电场和磁场，需要提高静电场的强度和磁场的强度。,对于静电场，需提高到,E,1,：,现假设主束离子,M,1,+,是由,M,+*,在第一无场区经亚稳分解而产生，为了使该,M,+*,通过静电场和磁场，需要提高静电场的强度和磁场的强度。,对于静电场，需提高到,E,1,：,联立(1)和(2)得：,对于磁场，需要提高到，,(3)式表明，亚稳断裂碎片离子,M,1,+,的,B,2/,E,比值和等质量的正常碎片离子的,B,2/,E,相等。,B,2/,E,扫描的实现方式：在加速电压最高档,V,，,静电场电压为相应值,E,，,调节磁场强度为,B，,找到正常碎片离子,M,1,+,，,然后使加速电压,V,固定不变，断开加速电压和静电场电压间的常规关系，锁定,B,2/,E,的比值，将磁场强度及静电场电压下降到最低值，然后按,B,2/,E,值从小至大扫描，得到,M,1,+,的全部可能的母离子。,母离子的质量可从下页两式求出：,此方法的特点是先找到,M,1,+,，,称主束离子，然后利用固定的,B,2,/,E,的关系找到其不同的母离子,M,+,，,这种方式是典型的“子”(主束离子,M,1,+,),找“母”(亚稳母离子,M,+,),联合扫描方式。,B,2/,E,联合扫描是第,I,无场区由子找母的一种校好的方法，离子源状态不变，质量范围较宽，但分辨本领不高，因涉及到,B,2,的控制，电子上实现起来不易准确。,同样，厂商备有,B,2/,E,联动扫描的操作软件，将计算系统与主机联机操作，可得到,B,2/,E,联动扫描谱图。,亚稳,分解和碰撞诱导解离反应的动能释放,亚稳离子的内能在分解反应临界能上一个很窄的范围内，因而,MI,谱反映的是离子的终态结构，而这个结构不一定是其初始结构，有可能存在异构化的离子，从而使分析的亚稳离子成为混合离子。,亚稳谱是质谱中惟一能够较好地限定离子内能的(最低分解阈值以上00.5)和寿命(110,s),技术。,碰撞诱导解离通过碰撞为稳定的离子提供内能，其前体的内能较小，不易异构化，从而应具有明确的结构。,前体离子,M,p,+,在分解过程中，会将非固定化能和逆活化能以动能的形式放出，称动能释放。动能释放与离子结构有关，动能释放导致质谱峰变宽。,E,a,Q,E,E,0,E,0,r,M,p,+,动位移,反应坐标,内,能,T,e,M,f,+,+M,n,0,E,MI,E,T,M,1,+,M,2,+,+M,3,动能释放：,T,=,T,+,T,e,动能释放的计算公式：,其中：,m,1,m,2,m,3,分别为产物离子前体离子,M,1,+,碎片离子,M,1,+,和中性碎片,M,3,的质量，,d,为亚稳峰的半高宽度，,V,是加速电压。,用于,IKES,和,MIKES,中计算，,E,为,从亚稳获的,M,1,+,和从离子源中生成的,M,1,+,峰,半高宽,之,差，单位为弗。,动能释放改变峰宽和峰形，改变程度取决于动能释放的大小。,当,T,很小时，峰较窄，峰形接近高斯型，简单的键断裂，逆活化能很小，主要来自于非固定化能，一般小于0.05,eV,。,在,质心,坐标系中，亚稳离子分解导致碎片离子在各个方向有均等的速度，该速度附加在离子的原来飞行速度之上，形成合速度。,附加速度在垂直于离子飞行方向速度分量，使离子偏离管道中心。,附加速度较小时：当在离子到达检测器之前，离子偏离中心的距离未超过管道的半径时，各个离子均能够被检测器检测到，此时的附加速度仅仅使峰宽加大，峰形呈高斯形。,附加速度较大时，由于部分离子偏离中心的距离超过管道半径，这部分离子不能够被检测到，呈平顶形。,附加速度很大时，更多的离子偏加大，以致于在垂直于飞行方向的离子大部分不能够被检测到，呈碟形。,M,+,M,1,+,M,2,-,v,M,1,+,M,2,v,M,1,+,M,2,M,2,M,1,+,+,-,v,v,r,v,0,v,v,r,v,0,+,离子管道,v,0,离子管道,v,0,离子管道,v,0,离子管道,v,0,检,测,器,检,测,器,检,测,器,检,测,器,例 3-甲基-4-苯基-2-丁酮的质谱,从常规的,EI,质谱图上，可以看到，分子离子发生了,M-15,+,的断裂，但从该质谱图上不能判断,CH,3,的失去是发生在,碳上，还是碳上，还是这两种方式同时发生。通过亚稳分解方法可以很容易得到答案。不仅可以找出第一级断裂，还可以找到第二级和第三级断裂。结果示于下图。,2、串联双聚焦磁质谱仪,EBE,型双聚焦串联质谱仪,高,分辨质谱仪,高分辨,IKES。,BEB,型双聚焦串联质谱仪,中华人民共和国，教育部，武汉大学，中国唯一的一台,ZAB-3F。,高分辨,IKES，,高分辨,MIKES,中性化再电离(,NR),和碰撞诱导解离电离(,CIDI),NR：,碰撞室1中充入碰撞气,N，,进行电荷交换反应碰撞气离子和中性,M，,离子经偏转电极除去，中性碎片继续前进，碰撞室2内充入氧化性气体,R，,中性碎片与其碰撞时氧化 产生正离子。,CIDI：,碰撞室1中没有碰撞气，亚稳分解离子和中性碎片，离子被偏转掉，亚稳中性碎片继续前进，碰撞室2同前面一样，来稳中性碎片碰撞时被电离。,Frank Condon,碰撞电离,M,1,+,M,1,+,M,1,M,1,NE,V,(M,1,+,),IE,(M,1,),NE,V,(M,1,+,)=,IE,(M,1,),(a),(b),离子和中性粒子几何结构相似，离子被中性化后能够生成稳定的中性分子，,NR,实验能够观察到复原的,M,1,+,。,(b),离子和中性粒子几何结构相差很大，离子被还原后生成振动激发态的中性粒子，其能量已达到中性粒子,M,1,的碎裂反应的临界能，,NR,谱中得不到复原的,M,1,+,。,用于气相离子化学研究，比如进行中性化-再电离和碰撞诱导解离等。,ZAB-4F,串联双聚焦质谱仪(,EBEB),二、四极杆串联质谱仪,优点：,碎片离子分辨高，第二级四极杆可以达到单质量分辨。,高的碰撞效率，比在双聚焦磁质谱仪中高20100倍，有利提高灵敏度。,消除伪峰,(相对于磁质谱而言)。,QO,QO,Q1,Q3,Q2,Q1,和,Q3：,正常的四极杆质量分析器。,Q2：,四、六、八极杆等，其上只加射频电压，可防止碰撞散射。八极杆对散射的抑制作用最强。目前，商品仪器多用八极杆。,弯曲的八极杆：防止中性碎片进入,Q3，,提高灵敏度。,方式,Q1,Q2,Q3,谱图,单级质谱仪,所有,m/e,通过,无,碰撞气所有离子通过,a,扫描,m/e,常规质谱图(,CI,EI,ESI,等）,前体,离子方式,扫描,m/e,碰撞气,b,所有离子通过,选择,m/e,由碎片离子找到前体离子谱,碎片离子方式,选择,m/e,碰撞气,b,所有离子通过,扫描,m/e,或,Q1,每,通过1个离子，可同时选择几个碎片离子,c,由前体,离子找到碎片离子谱,中性丢失方式(联合扫描),扫描,m/e,碰撞气,b,所有离子通过,与,Q1,保持同样速度扫描,m/e，,保持恒定质量数差,M,前体,离子的中性丢失谱,四极杆,串联质谱操作功能,a,或,Q1,扫描，,Q3,使所,m/e,通过。,b,如无碰撞气时则得到单分子分解的亚稳谱,c,选择离子监测(,SIM),单级质谱仪,前体,离子方式,碎片离子方式,中性丢失方式(联合扫描),中性获得方式(联合扫描，当在,碰撞室放置反性气体时,Q2,碰撞室,Q1,Q3,四,极质谱,分辨率不太高，但较容易实现单位质量分辨，在进行质谱/质谱分析时，碎片离子也比较容易得到单位质量分辨。这比扇形磁质谱仪的,MIKES,或,CID-MIKES,给出更高的分辨率，因磁质谱仪的静电场的分辨本领不强，所以子离子分辨率不高。,四极质谱/质谱的碰撞电压可调性强是其另一个优点，可以做能量分辨碰撞诱导解离谱以利于结构分析。,三、飞行时间质谱/质谱,基质辅助激光解吸电离(,MALDI),或激光解吸电离(,LDI),虽然是一促软电离方法，但在对于某些类别的化合物，电离过程中有一定的内能沉积，使得电离的离子离开离子源后，经过加速电压的加速进入无场飞行区后，仍会有一定程度的分解，产生亚稳分解的子离子。,飞行时间质谱仪的加速电压一般为2030,kV，,离子获得2030,keV,的动能，此值比扇形磁质谱(68,kV),的要高，但飞行时间质谱分析的对象一般分子量较大，所以，离子飞行速度与扇形磁质谱的离子飞行速度相当。飞行时间质量分析器的长度约在 0.52,m,之间，也和磁质谱的尺度相当。因此，飞行时间质谱上的亚稳离子分解与磁质谱有许多相似之处。,飞行时间质量分析器上实现亚稳分析的技术是源后分解(,PSD),技术，该技术对生物分子的结构分析价值非常高。,PSD,技术是由德国科学家,R.,Kaufmann,及其合作者首先推出并应用于分析肽序列。,线性飞行时间质量分析器不能实现,PSD,功能，必须要用反射式飞行时间质量分析器,。,1、源后解离技术(,Post Source Delay,PSD),离子的飞行行为,不同飞行时间质量分析器离子运动的方式：,直射式，检测区无电场。,直射式，检测区加静电场，电场强度较小，不足以使离子反射回来。,反射式，直射端施加电场，其电场强度可使离子按一定角度反射回来，检测器置于反射轨道上。,活化区域,样品活化,表面/样品,离子源内活化,加速区内/边缘,源后,活化,真空,活化过程,过剩能来自于电离：光子-分子直接相互作用、固态活化、温度效应,多次低能或中能碰撞,高能碰撞(与残余气体),时间范围,ps,-ns,ns-,s,s-ms,离开表面距离,0,加速区,在,MALDI,中导致离子不稳定和源后分解的活化过程,亚稳离子的,来源,在,MALDI,探头表面激光脉冲,1,s,后基质和肽离子密度分布的快照。,上图：纯基质样品2,5-二羟基苯甲酸(,DHB),下图：基质,DHB,中,加入,Substance P,加速区内离子的分解-,碰撞活化过程,基,质,分子较小，质量经，激光照射后产生的离子和中性分子速度快，在样品离子前面形成气体云(,denser cloud,)。,当施加加速电压后，样品离子加速，通过该气体云，产生多次离子-分子碰撞，从而使样品分子获得能量，形成亚稳离子，在飞行区发生亚稳分解。,无场漂移区内肽的单分子分解速率与加速场强的关系,加速电场越强，样品与气体云碰撞能量越大，内能越高，分解越快。,一般的,TOF,质谱仪，场强10,kV/cm。,若采用,DE,技术，则分解速率减小5倍，减小亚稳离子的分解。,DE,可以提高分辨率，可以提高,PSD,信噪比，从而改善灵敏度。,加速场梯度对离子分解的影响,角动量测量实验,在离子探头表面100,m,处，压力达到1,mbar，,还,足够导致离子的分解。,实验上测定的加速区的气体云的密度,L,1,:,第一飞行区,L,2,:,第二飞行区,d,1,:,第一反射区,d,2,:,第二反射区,PSD,仪器原理,M,p,+,M,f,+,+,M,n,动能：,M,p,+,:,mE,M,f,+,:,m,f,E,/,m,在第一无场区飞行区某处产生的碎片离子,M,f,+,将以与前体离子,M,p,+,几乎相同的速度继续飞行进入反射区。,M,f,+,带有较低的动能，因此，与其前体离子相比，进入反射场的深度相对较浅，从而较早地离开反射区，比未裂解的前体离子更快地到达检测器。,为了记录所有碎片离子完整的质谱，反射器的电压必须逐步降低。设,V,f,为碎片离子,M,f,+,的电压，,V,R,为反射极板上电压。当,V,f,=V,R,时。,M,f,+,被反射回来，就能检测。只要有足够范围的,V,R,值，就能检测到全范围的,PSD,碎片离子，这样便可获得,PSD,亚稳分析质谱图。,大多数的反射场的线性动态范围有限，这导致并不是所有的碎片离子都能到达检测器，一张完整的,PSD,谱需要改变不同,VR,值，分若干次采集，然后拼接而成。,PSD,谱的质量校正：,对于线性,TOF，,不考虑仪器的静电加速场和减速场的影响，正常的离子的飞行时间与质量的平方根为线性关系,可能进行两点校正或最小二阶乘拟合方法校正。,对于,PSD,来说，飞行时间和质量的关系比较复杂，没有解析的数学函数，而且影响因素多达10几个，因此，用3次多项式进行拟合，为了进行拟合，需要至少4 个已知质量的峰，进行最小二阶乘多项式拟合,对于绝大多数的,PSD,分析，均可得到较高的精度。,前体离子的选择：离子门技术(“,ion gate”),或束消除技术(,“,beam blanking,),定义一个质量窗口，只有在符合质量窗口的离子通过时间段里，离子门的偏转电压关闭，而其它时间通过设置偏转电压，使所有的离子全部偏转掉，从而实现前体离子的选择。,两个前提条件：,离子门的是一个高的电压降，,PSD,要求离子门必而以非常高的速率时行电压的开关的转换。,离子消除设备必须具有足够高的空间分辨力，保证只对感兴趣的离子起作用。,离子门位置需要考虑前体离子的位置依赖弥散和离子门位置形成的,PSD,离子高的传输率。,从前体离子弥散的角度：距离子源越远越好，因为不同质量的离子已经较好的分开了，时间门容易从其中选择所需离子。,从,PSD,离子传输的角度：,PSD,离子对残留的边缘场十分敏感