含有亚油酸和神经酰胺的润肤剂皮肤屏障修护的作用机制.pdf

分析与测评2023年8月第4期Aug.2023,No.4香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS106www.ffc-www.ffc-*基金项目：广东省中医药局科研项目（编号20212158）收稿日期：2022-08-01；修回日期：2022-08-21作 者1.上海市疾病预防控制中心，公共服务与健康安全评价所，上海 200336；2.南方医科大学皮肤病医院，广东广州 510091；3.上海家化联合股份有限公司研发中心，上海 200082 陈 田1 叶 理2#殷庆飞3#含有亚油酸和神经酰胺的润肤剂皮肤屏障修护的作用机制*摘 要通过小鼠皮肤屏障损伤模型和重组人表皮模型研究含有亚油酸和神经酰胺的润肤剂皮肤屏障修护作用机制。将小鼠背部脱毛后连续涂抹润肤剂 7 天，皮肤经胶带撕脱后 4 h 屏障恢复率显著提升。将表皮模型暴露于润肤剂 24 h，其 FLG、LOR、CASP14、TGM1、SPRR2A、SPRR2B、HMGCR、SPT1、PPARG、CLDN1、OCLN、ZO-1 等 基 因表达显著升高。说明该润肤剂的皮肤屏障修护功能与促进角质包膜形成、脂质合成、角质形成细胞紧密连接以及调节角质形成细胞的增殖和分化等有关。关键词润肤剂 皮肤屏障修护 作用机制 亚油酸 神经酰胺Mechanism of Skin Barrier Repairing of an Emollient Containing Linoleic Acid and Ceramide*CHEN Tian1 YE Li2#YIN Qingfei3#(1.Division of Public Health Service and Safety Assessment,Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention,Shanghai 200336,China;2.Dermatology Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510091,Guangdong,China;3.R&D Center of Shanghai Jahwa United Co.,Ltd.,Shanghai 200082,China)Abstract:Mechanism of skin barrier repairing of an emollient containing linoleic acid and ceramide was explored in a mouse skin barrier injury model and recombinant human epidermis model.After applying emollient for 7 d,the barrier recovery rate in mice increased significantly in 4 h after the tape striping.The mRNA expressions of FLG,LOR,CASP14,TGM1,SPRR2A,SPRR2B,HMGCR,SPT1,PPARG,CLDN1,OCLN,ZO-1 and other functional genes as the epidermal model exposed to emollients for 24 h.The above results show that the skin barrier repair function of the emollient containing linoleic acid is related to promoting cornified envelope formation,lipid synthesis and tight connection of keratinocytes,and regulating the proliferation and differentiation of keratinocytes.Keywords:emollient skin barrier repairing mechanism of action linoleic acid ceramide分析与测评陈 田，等作 者 简 介陈田（1984），男，博士，高级工程师，主要从事化妆品研发以及皮肤科学应用基础研究。#通信作者：叶理（1986），男，硕士，助理研究员，主要从事化妆品安全与功效评价研究。联系电话：[phone]E-mail:殷庆飞（1985），男，博士，高级工程师，主要从事化妆品应用基础研究。联系电话：[phone]E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2022.0181人体表皮的屏障功能是指由皮肤角质层、细胞间的脂质成分以及天然保湿因子等组成的“砖第 4 期分析与测评陈 田，等：含有亚油酸和神经酰胺的润肤剂皮肤屏障修护的作用机制107www.ffc-墙结构”，表面覆盖皮脂膜，由此形成一道人体天然保护屏障 1-2。皮肤屏障对人体健康非常重要，主要包括通过防止机体皮肤内部水分和小分子丢失以及防止外界不良因素，比如致病微生物等侵入人体的方式发挥作用 3。很多慢性炎症性皮肤疾病或者不良的皮肤状态与皮肤屏障受损有关，比如银屑病、特应性皮炎、冬季瘙痒、慢性湿疹以及敏感性皮肤等 4-7。由角质形成细胞合成的脂质主要包括神经酰胺、游离脂肪酸和胆固醇，这些成分以一定的比例存在于角质层的角质形成细胞间并形成复层板层结构 8。研究表明，外涂这些脂质的混合物或通过促进角质形成细胞合成这些脂质可以增强表皮屏障功能 9-11。我们曾对一款含有游离脂肪酸和神经酰胺的润肤剂进行临床研究，帮助对干燥性皮肤病比如特应性皮炎、银屑病等患者的皮肤进行护理，取得了良好的效果 12-14，但其潜在的生物学作用机制尚有待进一步阐明。基于此，利用小鼠皮肤屏障损伤-修复模型以及重组人表皮模型进行研究，一方面揭示该润肤剂的作用机制，另一方面借此指导产品配方的进一步优化。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂与样品重组人皮肤（表皮）模型培养基，上海斯安肤诺生物科技有限公司；噻唑蓝 MTT，碧云天生物技术有限公司；异丙醇、磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS），Sigma-Aldrich 公 司；总RNA 抽提试剂（TRIzol），美国 Thermo Fisher 公司；cDNA 逆转录试剂盒（iScript cDNA Synthesis Kit）、Real-time 荧光定量 PCR 试剂（iTaqTM Universal SYBR Green Supermix），美国 Bio-Rad 公司；待测润肤剂，包含红花籽油、稻糠油等油脂成分，上海家化联合股份有限公司。1.1.2 主要仪器TM300 型皮肤经皮水份流失（trans epidermal water loss，TEWL）测试仪、CM825 型皮肤水份测试仪、PH905 型皮肤酸碱度测试仪，德国 CK 公司；电动剃须刀，飞利浦公司；各种量程移液器，德国 Eppendorf 公司；多功能酶标仪，美国 Biotek公司；NanoDrop 微量分光光度计、CO2细胞培养箱，美国 Thermo Fisher 公司；CFX96 型实时荧光定量PCR 仪、T100 型普通 PCR 仪，美国 Bio-Rad 公司。1.1.3 动物使用 7 8 周龄雌性 C57 小鼠 20 只，SPF 级，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2013-0002。动物在正式试验前适应性喂养 3天。饲养环境为屏障级，室温（222）C，相对湿度 40%60%，光照明暗周期各 12 h。1.1.4 重组人皮肤（表皮）模型Episkin 重组人皮肤（表皮）模型购自于上海斯安肤诺生物科技有限公司。1.2 试验方法1.2.1 基于小鼠皮肤屏障损伤后修复模型的试验SPF 级 C57 雌性小鼠 20 只，7 8 周龄，随机分成样品处理组和空白对照组，每组 10 只。小鼠经异氟烷麻醉后，将背部及两侧剃毛，于次日向处理组小鼠的剃毛部位均匀涂受试物，每天 2 次，共7 天。第 8 天测量小鼠透皮失水率（TEWL）、角质层含水量及 pH 值，每只小鼠背部左右对称处各测 1 个点。然后用胶带撕脱破坏小鼠皮肤屏障，每只小鼠背部粘贴 3 次；粘贴后即刻测试同一部位的 TEWL，4 小时后再次检测 TEWL，并计算屏障功能相对恢复率。计算公式为（胶带撕脱即刻TEWL 4 小时恢复后 TEWL）/（胶带撕脱即刻TEWL 胶带撕脱前 TEWL）。1.2.2 基于重组人皮肤（表皮）模型研究屏障功能相关基因表达情况先将新到的人表皮模型转移至预先添加新鲜培养基的 12 孔板内，并置于饱和湿度、37 含体积分数 5%CO2的细胞培养箱中孵育 24 h，然后进行润肤剂暴露后细胞活力和基因表达的检测。简要试验步骤为：（1）将 25 L 待测样品均匀涂布于皮肤模型表面后于培养箱中孵育 30 min，再用无菌 PBS 清洗表皮模型 15 次，然后置于培养箱进行 42 h 后孵育，期间更换培养基 1 次，最后用MTT 法测试组织细胞活力。（2）基因表达检测：将 25 L 待测样品均匀涂布于皮肤模型表面并培养24 h 后，将表皮模型用 PBS 清洗 3 次，用打孔器将表皮模型取下并转移至预先加入 1 mL TRIzol 试剂的 1.5 mL EP 管中，并及时用移液器吹打至完全溶解。总 RNA 提取完成后，取 2 g 总 RNA 逆转录得到 cDNA，然后以 cDNA 作为模板，对屏障功能相关基因的表达进行相对荧光定量检测，-actin为内参基因。试验同时设置阴性对照组。每次试验重复 3 轮不同批次的皮肤模型，每次试验每组分析与测评2023 年 8 月香料香精化妆品108www.ffc-表 1 目的基因相对荧光定量 PCR 引物序列基因名称引物方向引物序列（5-3）丝聚蛋白（Filaggrin，FLG）FTGCCAAAAGATGTCTACTCTCCTRTCAACCATATCTGGGTCATCTGG兜甲蛋白（Loricrin，LOR）FGCCGTCCAAATAGATCCCCCRGCAAACCTCGGGTAGCATCA内披蛋白（Involucrin，IVL）FGCCTCTGCCTCAGCCTTACTRGACTGGAGGAGGAACAGTCTTG半胱天冬酶 14（Caspase 14，CASP14）FGGTGGATGTGTTCACGAAGAGGRCCTTCTTGAACCAGCTCTGCTTC转谷氨酰氨酶 1（Transglutaminase 1，TGM1）FACATGAAGTACGACACGCCTRTGTGACAATGAGTGTGCCGA小分子富含脯氨酸蛋白 2A（Small proline rich protein 2A，SPRR2A）FGTTCCACAGCTCCACCTTCARCACAGCCCAGGACTTCCTTT小分子富含脯氨酸蛋白 2A（Small proline rich protein 2B，SPRR2B）FTGGAGACTGAGCAAAGGAACCRTGCACAGGTGGTAGAAGCTC小分子富含脯氨酸蛋白 2A（Small proline rich protein 2G，SPRR2G）FCCCTGCCAGCAGAAGTATCCRGCTCAAGCCAGACAGAGGTT羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMG coenzyme A reductase，HMGCR）FGACGTGAACCTATGCTGGTCAGRGGTATCTGTTTCAGCCACTAAGG丝氨酸棕榈酰转移酶 1（Serine palmitoyltransferase 1，SPT1）FGCAGTGTTGAAGGAAAAGTGCGGRCAGTGCTCTCTTCCAGTTGTAGG脂肪酸合酶（Fattyacidsynthase，FASN）FTTCTACGGCTCCACGCTCTTCCRGAAGAGTCTTCGTCAGCCAGGA水通道蛋白 3（Aquaporin 3，AQP3）FCATCTACACCCTGGCACAGARCAAAAAGCTGGTTGTCGGCG白介素 1（Interleukin-1，IL-1）FTGTATGTGACTGCCCAAGATGAAGRAGAGGAGGTTGGTCTCACTACC肿瘤坏死因子（Tumour necrosis factor，TNF）FCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGRATGGGCTACAGGCTTGTCACTC增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）FCAAGTAATGTCGATAAAGAGGAGGRGTGTCACCGTTGAAGAGAGTGG过氧化物酶体增殖物激活受体 A（Peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARA）FTCGGCGAGGATAGTTCTGGAAGRGACCACAGGATAAGTCACCGAG过氧化物酶体增殖物激活受体 D（Peroxisome proliferator activated receptor delta，PPARD）FGGCTTCCACTACGGTGTTCATGRCTGGCACTTGTTGCGGTTCTTC过氧化物酶体增殖物激活受体 G（Peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）FAGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGRGGCTTCACATTCAGCAAACCTGG水闸蛋白 1（Claudin 1，CLDN1）FCTGTCATTGGGGGTGCGATARCTGGCATTGACTGGGGTCAT设置 2 个复孔。目的基因信息与引物序列见表 1。第 4 期分析与测评陈 田，等：含有亚油酸和神经酰胺的润肤剂皮肤屏障修护的作用机制109www.ffc-1.2.3 统计学分析试验数据均采用均值 标准差表示，并使用SPSS 17.0 软件进行后续统计分析。两组间差异比较采用 t 检验。当 P 0.05 时认为差异具有统计学意义。2 结果与讨论2.1 使用受试润肤剂能够增加小鼠受损皮肤屏障的恢复速率2021 年发布的化妆品分类规则和分类目录，其在功效宣称分类目录的功效类别中将“修护”释义为“有助于维护施用部位保持正常状态”15。因此，一方面，通过观察小鼠背部涂抹润肤剂 7 天后，皮肤的健康状态是否得到维持；另一方面，通过使用胶带轻度撕脱小鼠背部皮肤角质层后，观察早期润肤剂的干预是否可以帮助表皮屏障功能的恢复更快。也就是说，先进行受试物暴露，然后观察损伤后的恢复效应，主要目的是观察受试物的日常皮肤护理是否能够提升皮肤减轻和预防潜在危害因素引起损伤的能力。C57 小鼠经背部脱毛后，每天涂抹受试物 2 次，7 天后观察，小鼠皮肤外观无红斑、鳞屑以及干燥等改变，说明该润肤剂无皮肤刺激性。更重要的是，经过胶带轻度撕脱皮肤角质层后，相对于空白对照组，预先使用润肤剂处理的小鼠，其皮肤屏障功能的相对恢复更快一些（图 1）。2.2 润肤剂暴露对重组人表皮模型活力及相关基因表达改变的影响使用重组人表皮模型，检测受试润肤剂暴露后对皮肤模型组织细胞活力以及与角质包膜形成、皮肤脂质合成、水通道蛋白、细胞增殖、炎症因子、细胞紧密连接等功能相关基因表达的影响。在安全性测试方面，主要通过受试物暴露后重组人表皮模型的组织细胞活力是否会低于 50%以及炎性因子是否被显著诱导来评价 16-19。当表皮模型经过受试润肤剂 30 min 暴露以及 42 h 后孵育之后，组织细胞活力大于 50%，该结果说明润肤剂的使用不会引起明显的皮肤刺激性。而且经过受试润肤剂暴露 24 h 后，IL-1 和 TNF 等炎性因子的表达没有上调，也说明该润肤剂是非常温和 的。在功效及作用机制方面，用该润肤剂处理表皮模型 24 h 以后，角质包膜形成相关基因 FLG、LOR、CASP14、TGM1、SPRR2A、SPRR2B 的表达显著升高（图 2）。FLG 是皮肤表皮外层角化包膜的一个重要组成蛋白，主要存在于表皮颗粒层和透明层，是皮肤屏障的重要组成结构。FLG 可进一步降解成具有亲水性的自由氨基酸和吸水性衍生物，帮助皮肤储存水分，维持皮肤含水量 20。CASP14 是 调 节 丝 聚 蛋 白 原（profilaggrin，Pro-FLG）去磷酸化成为 FLG 的关键酶 21。在 FLG 缺失或 Pro-FLG 降解酶缺失的情况下，表皮水分减少，角蛋白丝纤维束形成受阻，皮肤发生致敏以及湿疹的风险增加 22。LOR 是角质包膜的主要组成成分，占角质薄膜蛋白量的 80%，对表皮屏障功能的正常发挥起着重要作用。LOR 与小分子富含脯氨酸蛋白 SPRRs 在 TG1、3 的催化下交联，可以加固角质包膜的胞质面。有报道显示，LOR基因名称引物方向引物序列（5-3）闭锁蛋白（occludin，OCLN）FATGCCCTCTGCAACCAATTTRGTACAATGGCAATGGCCTCC闭锁小带蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）FGTCCAGAATCTCGGAAAAGTGCCRCTTTCAGCGCACCATACCAACC-肌动蛋白（-actin，ACTB）FCACCATTGGCAATGAGCGGTTCRAGGTCTTTGCGGATGTCCACGT表 1 目的基因相对荧光定量 PCR 引物序列（续）图 1 润肤剂预处理促进皮肤屏障功能恢复（*，P0.05）空白对照组样品处理组*皮肤屏障功能恢复率/%403020100分析与测评2023 年 8 月香料香精化妆品110www.ffc-在皮肤屏障损伤性疾病，比如特应性皮炎和银屑病皮损内表达是显著减少的 23-24。TGM 主要在角质形成细胞中表达，参与-谷氨酰-赖氨酸异肽链的形成以及角质包膜支架蛋白谷氨酰胺与超长脂肪酸的结合。TGM1 缺陷的小鼠会出现皮肤角质层缺陷导致皮肤水分过度丢失，人类 TGM1的基因突变与层状鱼鳞病的发生相关 24-25。因此，这些关键基因的表达上调说明该润肤剂的使用能够促进角质包膜的形成。再者，经润肤剂暴露后，HMGCR 和 SPT1 的表达分别增加约 25%和 39%（图 2）。HMGCR 存在于内质网，是合成胆固醇的限速酶，在皮肤的脂质屏障形成中起关键调节作用 26。SPT1 是神经酰胺从头合成的限速酶，而神经酰胺也是结构脂质的重要组成部分，其含量减少可引起皮肤功能异常，比如特应性皮炎、银屑病以及鱼鳞病患者皮损中神经酰胺的含量明显低于正常皮肤 27。因此，HMGCR 和 SPT1 的上调说明该润肤剂的使用能够促进结构脂质的合成。紧密连接也是物理屏障中的重要组成部分，大多出现在皮肤表皮层，位于相邻细胞间隙的顶端侧面，由不同类型的跨膜蛋白及细胞内胞质蛋白组成，前者如 CLDN1 和 OCLN 等，后者如 ZO-1 等 28-29。研究发现，受试润肤剂的使用能够促进 CLDN1、OCLN 以及 ZO-1 的形成（图 2），说明皮肤细胞之间的紧密连接也得到增强。以上结果表明，受试润肤剂能够增加“砖墙结构”中“砖”（角质包膜）、“灰浆”（结构脂质合成）以及“钢筋”（细胞紧密连接）的形成。以上功能性基因的上调说明受试润肤剂的使用能够使得表皮组织的生长发育处于比较良好的健康状态。为此，进一步分析与角质形成细胞增殖和分化相关的基因，结果显示 PCNA 和 PPARG的表达上调（图 2）。表明 PCNA 在皮肤创伤修复过程中发挥着重要作用 30；PPARG 激活可以促进角质形成细胞分化、抑制角质形成细胞增殖、改善屏障稳态、促进表皮屏障修复、增加脂质合成、增加板层小体形成 31。此外，一些不饱和脂肪酸是 PPARG 的激动剂 32-33。因此，可以推测受试润肤剂对皮肤屏障的提升作用，与其所富含的亚油酸成分密切相关。3 结论该富含亚油酸的润肤剂不仅安全、温和，还图 2 润肤剂处理后促进重组人表皮模型中皮肤屏障功能相关基因的表达FLGSPRR2APCNACASP14HMGCRCLDN1LORSPRR2BPPARYTGM1SPT1OCLNZO-1相对表达量43210能够促进皮肤屏障的修护，其机制与促进角质包膜形成、脂质合成、角质形成细胞紧密连接以及调节角质形成细胞的增殖和分化相关。致谢非常感谢上海家化玉泽皮肤科学研究中心郭奕光教授在本文撰写过程中给予的指导！参考文献KENNETH R F,PETER M E.Role of lipids in the formation 1 and maintenance of the cutaneous permeability barrier J.Biochimica et Biophysica 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