小动物活体成像技术进展.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,小动物活体成像技术,Optical in Vivo Imaging,OI,1,www.ppthi-,目录,一、背景,二、原理,三、系统组成,四、优点,目录,五、分类,六、应用,2,背 景,www.ppthi-,动物模型是现代生物医学研究中重要的实验方法与手段,，,有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律,，,研究防治措施,；,同时由于大鼠、天竺鼠、小鼠等小动物,具有的,诸多优势,，,在生命科学、医学研究及药物开发等多个领域的应用日益增多。1999年，美国哈佛大学Weissleder等人提出了分子影像学（molecular imaging）的概念应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究,。,近年来,，,各种影像技术在动物研究中发挥着越来越重要的作用,，,涌现出各种小动物成像的专业设备,，,为科学研究提供了强有力的工具。,3,背 景,结构成像,X-Ray,CT,成像,MRI,成像,超声成像,功能成像,f MRI,功能核磁共振成像,PET,正电子断层成像,SPECT,单光子发射断层成像,分子影像,光学成像,核磁共振成像,核素成像,医学影像技术的发展,4,背 景,1920,世纪,结构成像,X-Ray,CT,成像,MRI,成像 超声成像,看到病变,5,背 景,20,世纪,90,年代,功能成像,f MRI,功能核磁共振成像,PET,正电子断层成像,SPECT,单光子发射断层成像,看到功能,6,背 景,21,世纪以来,看到细胞、分子水平的变化,分子影像,光学成像,核磁共振成像,核素成像,7,原 理,www.ppthi-,原理,光学成像,的原理,光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用灵敏的活体成像系统最少可以看到皮下的,500,个细胞，当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于,光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量化检测到光强度，同时反映出细胞的数量,。,8,原 理,www.ppthi-,9,系统组成,www.ppthi-,小动物活体成像系统组成,硬 件,CCD,相机,、,滤光片转轮,、,透镜,、,电子学组件,、,加热的样品平台,和,冷凝器,及相,机控制装置,组成，这是一种专业的体内成像系统，投光器排成直线，这可以实现快速、可重复的样品放置定位，大小可以随成像视野的变化而变化。,软 件,软件控制IVIS系统所有装置的设置，提供高级的,编目,及,浏览工具,，提供,定量分析工具,，有好的,界面,，装置的设置与相机相似，操作简单，两步操作获取图像。,麻醉系统,2条通路组成，一条是诱,导麻醉通路,，另外一条是,持续麻醉通路,。两条通路在氧气和麻醉药异氟烷混合状态下对小动物进行麻醉。,10,系统组成,www.ppthi-,布鲁克光学活体成像系统,小动物,CT,成像系统,11,优 点,www.ppthi-,能够反映细胞或基因表达的,空间,和,时间,分布，从而了解活体动物体内的相关,生物学过程、特异性基因功能和相互作用,。,由于可以对同一个研究个体进行长时间反复跟踪成像，既可以,提高,数据的可比性，,避免,个体差异对试验结果的影响，又不需要杀死模型动物，,节省,了大笔科研费用。,尤其在,药物开发,方面，活体成像更是具有划时代的意义。根据目前的统计结果，由于进入临床研究的药物中大部分因为安全问题而终止，导致了在临床研究中大量的资金浪费，而活体成像技术的问世，为解决这一难题提供了广阔的空间，将使药物在临床前研究中通过利用分子成像的方法，获得更详细的分子或基因水平的数据，这是用传统的方法无法了解的领域，所以活体成像将对新药研究的模式带来历史性变革。其次，在,转基因动物、动物基因打靶或制药研究,过程中，活体成像能对动物的性状进行跟踪检测，对表型进行,直接观测,和（,定量,）分析。,优 点,12,分 类,www.ppthi-,4.,计算机断层摄影成像,5.,超声成像,1.,可见光成像,2.,核素成像,3.,核磁共振成像,小动物活体成像系统,13,分 类,（一）可见光成像,生物发光,萤火虫荧光素酶：,底物是荧光素，光波长在540600 nm,海肾荧光素酶：,底物是腔肠素，所发的光波长在460540 nm。,将基因整合到需观察细胞的染色体DNA上，标记后只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光强度与标记细胞的数目呈线性相关。,前者所发的光更容易透过组织，在体内的代谢较后者慢，而且特异性好。所以，大部分活体实验使用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因，如果需要双标记或特殊的实验，也可采用后者作为备选方案。,PpyRed红色漂移荧光素酶：,把荧光素酶的发光峰从562 nm漂移到612 nm。随着发光波长的增 加，PpyRed红色漂移荧光素酶穿透性大大提高，被皮肤吸收的比例显著降低，且光的漫射现象减少，提高了活体生物发光成像的灵敏度和分辨率。,发光酶基因操纵子,I,uxABCDE或luxCDABE,：,用于,细菌标记，,它由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是，一般细菌标记需要转座子的帮助，把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。通过荧光素酶基因标记的细菌进行胃肠道排空的实验，可以把活体成像的研究应用扩展到药物动力学、胃肠道功能学等领域。,14,分 类,www.ppthi-,荧光,荧光成像技术发展迅速，主要表现在成像探针的不断更新，随着小动物成像技术的发展，成像探针种类越来越多，功能越来越强大。,量子点荧光标记：,是纳米技术和体内荧光成像技术结合的一种新技术，除了能对活细胞,实时长时间动态荧光观察与成像,，对细胞间、细胞内及细胞器间的各种相互作用的原位实时动态示踪外，还可以标记在其他需要研究的物质上，如药物、特定的生物分子等，示踪其活动及作用，,在长时间生命活动监测及活体示踪方面具有独特的应用优势。,几种基于荧光显微镜技术的方法适用于体外细胞，也适合体内细胞的观察，如多光子显微技术、激光显微共聚焦技术和纤维光学方法等。因为共聚焦显微术使用方便、耗费少，所以应用最广泛，但如果观察时间过长且组织光穿过率低，则光毒性导致的细胞死亡是其应用的局限性之一。,15,分 类,www.ppthi-,可见光成像,优势：,使用低能量、无辐射、对信号检测灵敏度高、实时监测标记的活体生物体内的细胞活动和基因行为，已被广泛应用到监控转基因的表达、基因治疗、感染的进展、肿瘤的生长和转移、移植、毒理学、病毒感染和药学研究中。,缺点：,二维成像及不能绝对定量。,16,分 类,www.ppthi-,（二）核素成像,小动物PET,优势：,在于,特异性、敏感性和能定量示踪标记物,，且PET使用的放射性核素多为动物生理活动需要的元素，因此不影响它的生物学功能。放射性标记物进入动物体内后，由于其本身的特点，能够聚集在特定的组织器官或参与组织细胞的代谢；半衰期超短，一般在十几分钟到几小时，适合于,快速动态研究,。,缺点：,分辨率虽已达到1 mm，但却降低了灵敏度；同时，小动物PET在很大程度上缺少解剖结构信息和使用放射性核素，要求回旋加速器靠近成像设备。,小动物SPECT,小SPECT系统使用长半衰期的放射性同位素，不需要回旋加速器。常使用的放射性核素不是生理性元素，它们的半衰期从6 h到3 d，通常较PET使用的放射性核素半衰期长。可用于,监视生理功能、示踪代谢过程和定量受体密度等。,17,分 类,www.ppthi-,核素成像,核素成像技术用于发现易于为核素标记的既定靶目标底物的存在，或用于追踪小量标记基因药物，进行药物抵抗或病毒载体传送的研究。,18,分 类,www.ppthi-,（三）小动物CT,CT利用组织密度的不同造成对X射线透过率不同,对机体一定厚度的层面进行扫描,并利用计算机重建三维图像,。,小动物CT(微型CT)作为一种最新的CT成像技术，具有微米量级的空间分辨率(大于9m)，并可以提供三维图像；大多数系统使用圆锥形的X射线辐射源和固体探测器。探测器可以围绕动物旋转，允许一次扫描动物整体成像。,在小动物,骨和肺部组织检查,等方面具有独特的优势。但是，对比剂的使用导致射线的危害,因为敏感度和空间分辨率也依赖于CT暴露的时间和对比剂使用的数量。,19,分 类,www.ppthi-,（四）小动物MRI,MRI依据所释放的能量在物质内部不同结构环境中不同的衰减,绘制出物体内部的结构图像。,优点：,相对于CT，MRI具有无电离辐射性(放射线)损害、高度的软组织分辨能力，以及无需使用对比剂即可显示血管结构等的独特优点。对于核素和可见光成像，小动物MRI的优势是具有微米级的高分辨率及低毒性；在某些应用中，MRI能同时获得生理、分子和解剖学的信息。,缺点：,MRI的敏感性较低(微克分子水平)，与核医学成像技术的纳克分子水平相比低几个数量级，所以并非最理想的成像系统。,目前，动物MRI发展的焦点集中在新的增强对比因子,以增加敏感度和特异性。,20,分 类,www.ppthi-,（五）小动物超声,超声基于声波在软组织传播而成像，由于其无辐射、操作简单、图像直观、价格便宜等优势，在临床上广泛应用。在小动物研究中，由于所达到组织深度的限制和成像的质量容易受到骨或软组织中空气的影响而产生假象，所以超声不像其他动物成像技术那样应用广泛，应用,主要集中在生理结构易受外界影响的膀胱和血管,。,21,应 用,www.ppthi-,实例一：可见光之荧光成像,Ohyanagi等采用化学与酶合成法联用，合成了,N-,乙酰氨基乳糖（,LacNAc),、唾液酸化,N-,乙酰氨基乳糖（,Sialyl,LacNAc),、路易斯,X,寡糖抗原（,Le,）、唾液酸化,路易斯,X,寡糖抗原（,Sialyl Le,）等多种功能性寡糖，然后使用配体交换策略合成了上述多种寡糖修饰的量子点。随后他们研究了各种寡糖,-,量子点缀合物在小鼠体类的代谢情况，发现末端半乳糖结构的,glyco-QDs,经代谢后主要集中在肝脏；而末端唾液酸结构,的,glyco-QDs,都主要集中在肾脏。,应用实例,22,应 用,www.ppthi-,23,应 用,www.ppthi-,实例二：核素,-SPECT,成像,孙艳红等采用三齿配体的双功能螯合剂合成-榄香烯配合物并进行 Tc 标记，采用SPECT 成像仪器观察不同的时间点在荷瘤鼠内的分布滞留情况。成像结果显示，各主要脏器如心、肝、脾、肺、肾、胃肠均有较多分布，注射后 1-1.5h 小时肿瘤部位浓集明显。结果表明，可以考虑在分子上连接上肿瘤靶向分子，增加肿瘤部位的浓集，提高其抗癌作用的效果。,应用实例,24,应 用,www.ppthi-,25,应 用,www.ppthi-,实例三：,CT,成像,许天源等利用,N-,甲基,-N-,亚硝脲,(MNU),诱导构建大鼠原位膀胱癌动物模型，造模成功后，利用大鼠膀胱灌注欧乃派克稀释液后,CT平扫的改良CT检测方法对存活大鼠进行活体成瘤鉴定,，,并通过三维重建进行CTU成像,。,活体检测后处死所有大鼠,，,取膀胱组织进行病理组织学观察,。所有成瘤大鼠,CT,扫描均见异常，膀胱肿瘤表现为乳头状，团块状低信号新生物，凸向高信号膀胱腔形成充盈缺损。,CTU,下，膀胱原位肿瘤表现为椭球表面形状各异的凹陷，大小、边界、位置清晰。,应用实例,26,应 用,www.ppthi-,两组大鼠,CT,及,CTU,图像,从左到右依次为：横位,CT,、冠状位,CT,、矢状位,CT,和,CTU,图像,A,对照组大鼠,B,小体积肿瘤大鼠,C,大体积肿瘤大鼠,图中光滑的圆形充盈缺损为膀胱气泡,27,应 用,www.ppthi-,实例四：核磁共振成像,赵明媛等人采用0.5T低磁场MRI仪对小鼠皮下移植瘤（HepG2、S180、H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤组织）和原发性肝肿瘤（H-ras12V转基因肝癌小鼠）进行检测，观察其影像学表现并对H-ras12V转基因小鼠原发性肝肿瘤进行病理学确认。皮下移植瘤小鼠的肿瘤MRI成像结果表明，皮下肿瘤部位的T1WI上表现为低信号、T2WI上表现为高信号、成像清晰、效果良好，且三种小鼠皮下移植瘤的MRI成像效果相似。对于H-ras12V转基因小鼠原发性肝肿瘤的MRI成像结果表明，在转基因小鼠的肝区出现了T1WI上表现为低信号的多个区域，这些相应区域在T2WI上表现为高信号。病理解剖及病理切片证实，这些区域为多发性肝肿瘤。,T1WI(TR 500 ms，TE 20 ms)；T2WI(TR 2 000 ms，TE 60 ms）,因此，,利用低磁场MRI可以对小鼠原发性肝肿瘤和移植性肿瘤进行有效的检测，可作为小鼠肿瘤无创检测的有效方法。,应用实例,28,应 用,www.ppthi-,A,矢状面 横切面 冠状面,0.5T小动物核磁共振成像仪检测正常小鼠和H,-,ras12V 转基因小鼠,29,应 用,www.ppthi-,实例五：超声成像,曹云彪等采用小动物超声成像技术，对小动物腹部疾病进行诊断，可以清楚地得到图像，从而对小动物的疾病进行诊断，认为此技术可作为一种辅助诊断手段，具有广阔的应用前景。,应用实例,30,应 用,www.ppthi-,31,应 用,www.ppthi-,32,应 用,www.ppthi-,33,www.ppthi-,谢谢大家！,34,